全 文 ：287
史红梅，孙玉霞，蒋锡龙，魏彦锋，王恒振
(山东省酿酒葡萄科学研究所，山东济南 250100)
摘 要:对葡萄藤茎中多酚活性物质提取的最佳工艺条件进行了探讨。对影响提取液多酚含量的乙醇浓度、料液比、
提取温度、提取时间进行单因素实验，在此基础上设计了 4 因素 3 水平的正交实验，以提取液中多酚含量和 DPPH·清
除率为指标进行实验。结果表明:多酚活性物质的最佳工艺条件为提取温度 60℃，固液比 1∶15，乙醇浓度 50%，提取
时间 1h。在此条件下提取液中多酚含量为 14.43mg /g，DPPH·清除率 81.23%。
关键词:多酚，葡萄藤茎，DPPH·，正交实验
Orthogonal test as an approach to optimize
the extraction of polyphenol from grapevine cane
SHI Hong－mei，SUN Yu－xia，JIANG Xi－ long，WEI Yan－feng，WANG Heng－zhen
(Shandong Vine and Wine－Making Institute，Jinan 250100，China)
Abstract:The optimal extracting conditions of polyphenol from grapevine cane were studied. The single factor
experiments of alcohol concentration，the ratio of solid to liquid，extracting temperature and extracting time were
investigated.And 4 factors 3 levels orthogonal test was devised to obtain the optimal extracting conditions based on
the single factor experiment.The optimum extracting process of polyphenols from the grapevine cane was listed as
follows:extracting temperature 60℃，ratio of solid to liquid 1∶15，alcohol concentration 50% and extracting time 1h.
The yield of polyphenols was found to be 14.43mg /g and DPPH· clearance rate was 81.23% .
Key words:polyphenol;grape cane;DPPH·;orthogonal test
中图分类号:TS255.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2012)02－0287－04
收稿日期:2010－12－30
作者简介:史红梅(1979 －) ，女，工程师，主要从事新型发酵制品的
研究。
基金项目:山东省科技攻关计划;葡萄酒产业科技特派员创业链示范
建设(2009GG2ZC08013)。
多酚活性物质是一类具有生物活性的天然化合
物，是植物在生长发育中重要的次生代谢产物，具有
清除自由基［1］和抗氧化等生物活性作用，另在抑菌、
抗病毒、防癌抗癌［2］、抑制肿瘤、防治心血管疾病［3］等
方面也具有良好功效。近年来，多酚类物质的生物
活性及对人体的保健防病作用日益受到广泛关注。
目前国内对葡萄中的多酚活性的研究主要集中在葡
萄皮渣、籽、果汁及葡萄酒中，葡萄藤茎中多酚的开
发利用研究却较少。每年夏季葡萄进入旺盛生长
期、冬季进入休眠期时都要对枝蔓进行修剪，除少部
分留作育苗外，大部分都废弃掉了，既污染了环境又
造成了巨大的资源浪费。近几年，葡萄藤茎中的生
物活性物质已引起国内外研究人员的重视，Sierra
Raynea等［4］研究发现葡萄藤中含有反式白藜芦醇
(trans－ resveratrol)和葡萄素(trans － ε － viniferin) ;
Erkan Karacabey等［5］研究了葡萄藤茎中白藜芦醇及
其衍生物和阿魏酸(ferulic acid)的提取条件。国内
仅有高园等［6］研究了葡萄枝条中多酚物质的超声提
取条件。本实验采用正交实验的方法以提取液中多
酚含量和抗氧化活性作为研究对象，研究了葡萄藤
茎中的多酚活性物质的提取条件。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
蛇龙珠 一年生葡萄藤茎;无水乙醇 天津市广成
化学试剂有限公司;没食子酸 中国药品生物制品检定
所;DPPH·标准品 Simga公司;以上均为分析纯。
SHA－B数显恒温振荡器 常州国华仪器有限公
司;285A真空干燥箱 飞世尔科技有限公司;FW135
中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;
HP8453 紫外可见分光光度计 美国 Agilent 公司;
TDL－5 离心机 上海安亭科学仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 葡萄藤茎中多酚活性物质提取工艺流程 葡
萄藤茎→干燥→粉碎过筛→溶剂浸提→浸提液真空抽滤→粗
提液分析测定。
1.2.2 多酚含量测定 福林－肖卡(Folin－Ciocalteus)
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.02.043
288
法测定［7］。
1.2.3 DPPH·清除能力测定 配制 136μmol /L
DPPH 自由基乙醇溶液，分别取 5、4、3、2、1mL 于
10mL 容量瓶中，以乙醇定容，摇匀，在 517nm 处测定
吸光值，以吸光度 A为纵坐标，DPPH·浓度(μmol /L)
为横坐标，得线性方程 y = 0.0077x － 0.0193，R2 =
0.9928。配制 78μmol /L DPPH 自由基乙醇溶液，准
备吸取 3.9mL DPPH 自由基与 0.1mL 多酚粗提液置
于比色管中，放置 15min 测定吸光值。DPPH·清除
率(%)=(A0－A样)/A0 × 100%。
1.2.4 葡萄藤茎中多酚活性物质最佳提取工艺条件
的确定
1.2.4.1 溶剂对多酚含量的影响 取 1g 粉末置于三
角瓶中，分别加入甲醇、乙酸乙酯、70%乙醇、丙酮，
料液比 1∶10，恒温振荡提取 1h，研究不同溶剂对多酚
含量的影响。
1.2.4.2 乙醇浓度对多酚含量的影响 取 1g 粉末置
于三角瓶中，分别加入 10%、20%、30%、40%、50%、
60%、70%、80%、90%的乙醇水溶液，恒温振荡提取
1h，研究不同浓度乙醇水溶液对多酚含量的影响。
1.2.4.3 料液比对多酚含量的影响 取 1g 粉末置于
三角瓶中，分别加入 70%乙醇水溶液 5、7、9、11、13、
15、17、19mL，恒温振荡提取 1h，研究不同料液比对
多酚含量的影响。
1.2.4.4 时间对多酚含量的影响 取 1g 粉末置于三
角瓶中，加入 70%乙醇水溶液 10mL，恒温振荡提取，
时间分别为 0.5、1、2、3、4、5、6、7、8h，研究提取时间对
多酚含量的影响。
1.2.4.5 温度对多酚含量的影响 取 1g 粉末置于三
角瓶中，加入 70%乙醇水溶液 10mL，恒温振荡提取
1h，设置温度分别为 30、40、50、60、70、80℃，研究提
取温度对多酚含量的影响。
1.2.4.6 提取次数对多酚含量的影响 取 1g 粉末置
于三角瓶中，加入 70%乙醇水溶液 10mL，恒温振荡
提取 1、2、3、4 次，每次提取时间为 1h，研究提取次数
对多酚含量的影响。
1.2.4.7 正交实验 以蛇龙珠葡萄藤茎为原料，粉碎
过筛，取乙醇溶液体积分数、浸提温度、料液比和浸
提时间 4 个影响因素，设计四因素三水平正交实验，
进一步优化葡萄藤茎中多酚活性物质提取的最佳工
艺条件。因素水平表如表 1 所示。
表 1 葡萄藤茎中多酚活性物质
提取的正交实验因素与水平
Table 1 Experiment assignment of the
level and factor of polyphenol in grapevine cane
水平
因素
A温度
(℃) B固液比
C乙醇浓度
(V/V)
D提取时间
(h)
1 50 1∶13 50 1
2 60 1∶14 60 2
3 70 1∶15 70 3
2 结果与分析
2.1 葡萄藤茎多酚活性物质提取工艺单因素实验
2.1.1 溶剂对多酚含量的影响 由图 1 可知，不同的
溶剂对葡萄藤茎中多酚物质的含量的影响是不同
的，70%乙醇水溶液和丙酮的含量较高，甲醇次之，
乙酸乙酯最低，这主要是由于溶剂的极性不同，所提
取的有效成分的类型也不尽相同。乙醇作为一种极
性较强的溶剂，更易于提取植物原料中的黄酮类、单
宁等化合物［8］，而乙醇与水混合更增加了溶剂的极
性。综合考虑成本和环保因素，故采用 70%乙醇水
溶液作为提取剂。
图 1 不同溶剂对提取液中多酚含量的影响
Fig.1 Effects of different solvents on polyphenols content
2.1.2 乙醇水溶液浓度对多酚含量的影响 由图 2
可知，随着乙醇浓度的增加，多酚含量逐渐增加，在
浓度达到 60%时，提取液中多酚含量达到最大值;此
后随着乙醇浓度的增加，多酚含量又呈下降趋势。
这是由于随着乙醇浓度增大，溶液极性增加，多酚含
量增强，但乙醇浓度继续增加会加大醇溶性杂质、色
素以及亲脂性强的成分的溶出，这些成分与多酚活
性物质竞争，同乙醇水分子结合，同时组织的通透性
下降，从而导致多酚活性物质的溶解度下降［9］，因此
乙醇浓度选为 60%。
图 2 乙醇浓度对提取液中多酚含量的影响
Fig.2 Effects of alcohol concentration on polyphenols content
2.1.3 料液比对提取液中多酚含量的影响 由图 3
可知，随着料液比的增加，提取液中多酚含量逐渐增
加，在料液比为 1∶15 时提取率达到最大值，随后又逐
渐降低。这是因为有机溶剂能抑制多酚与植物中的
蛋白、多糖等物质结合，增加料液比有利于多酚活性
物质更大限度的浸出，但料液比继续增大又会增加
多酚与空气接触的机会，而多酚容易氧化，所以提取
量有所降低［10］，同时料液比增加还会造成原料的浪
费，对多酚纯化也会增加困难。
2.1.4 提取时间对多酚含量的影响 由图 4可知，提取
时间在 2～7h之间时，提取液的多酚含量变化不大，这可
能是由于在前 2h内，多酚物质已大部分被提取出来，这
与 Ana Bucic－Kojic等人的研究结果基本一致［11］。考虑
到成本和经济因素，故选择提取时间为 2h。
289
图 3 料液比对提取液中多酚含量的影响
Fig.3 Effects of ratio of solid to liquid on polyphenols content
图 4 提取时间对提取液中多酚含量的影响
Fig.4 Effects of extracting time on polyphenols content
2.1.5 提取温度对多酚含量的影响 由图 5 可知，随
着提取温度的升高，提取液中多酚含量逐渐增加，在
60℃时达到最大值，此后随着温度的升高多酚含量
又呈下降趋势，这是因为温度的升高有助于多酚的
溶出和过氧化物的钝化，但温度过高又不利于多酚
化合物的稳定，可加重多酚物质的非酶促氧化聚
合［12］，综合考虑多酚热不稳定、易氧化的特性，选
60℃为提取温度。
图 5 提取温度对提取液中多酚含量的影响
Fig.5 Effects of extracting temperature on polyphenols content
2.1.6 提取次数对多酚含量的影响 由图 6 可知，随
着提取次数的增加，提取液中的多酚含量显著降低，
当提取 4 次时，提取液中的多酚含量已经低至
0.88mg /g，该浓度过低，应用价值不大，不适宜在生产
中推广应用，因此提取次数选择 3 次。
2.2 葡萄藤茎中多酚活性物质提取工艺条件的优化
根据单因素实验的实验结果，设计了 4 因素 3 水
平的正交实验，以多酚粗提物中的多酚含量及其抗
氧化活性清除 DPPH·的能力进行考察，实验结果如
表 2 所示。
以多酚粗提物中多酚含量为实验指标，从表 2
中多酚含量极差可以看出，C 因素(乙醇浓度)为主
要的影响因素，B 因素(固液比)次之，D 因素(提取
图 6 提取次数对提取液中多酚含量的影响
Fig.6 Effects of extracting times on polyphenols content
时间)的影响效果最小，可见各因素影响的次序为
C ＞ B ＞ A ＞ D，多酚活性物质提取的最佳工艺为
A3B3C1D1，即提取温度 70℃，固液比 1 ∶15，乙醇浓度
50%，提取时间 1h。
表 2 葡萄藤茎中多酚活性物质
提取工艺条件的正交实验结果
Table 2 Results of orthogonal test of
polyphnol in grapevine cane
实验号 A B C D 多酚含量
(mg /g)
DPPH·
抑制率
(%)
1 1 1 1 1 13.00 78.09
2 1 2 2 2 12.30 72.04
3 1 3 3 3 11.99 66.08
4 2 1 2 3 12.08 75.51
5 2 2 3 1 11.63 67.59
6 2 3 1 2 14.03 75.62
7 3 1 3 2 11.51 65.79
8 3 2 1 3 14.33 70.79
9 3 3 2 1 14.71 81.83
多
酚
含
量
K1 37.29 36.59 41.36 39.34
K2 37.74 38.26 39.09 37.84
K3 40.55 40.73 35.13 38.40
k1 12.43 12.20 13.79 13.11
k2 12.58 12.75 13.03 12.61
k3 13.52 13.58 11.71 12.80
R 1.09 1.38 2.08 0.50
优方案 A3 B3 C1 D1
K1 216.2 219.4 224.5 227.5
K2 218.7 210.4 229.4 213.5
K3 218.4 223.5 199.5 212.4
k1 72.07 73.13 74.83 75.84
k2 72.91 70.13 76.46 71.15
k3 72.80 74.51 66.49 70.79
R 0.83 4.38 9.97 5.05
优方案 A2 B3 C2 D1
以多酚粗提物的抗氧化活性清除 DPPH·的能
力为考察对象，从表 2 中 DPPH·清除率的极差可以
看出，C 因素(乙醇浓度)为主要的影响因素，D 因素
(提取时间)次之，B 因素(固液比)的极差与 D 因素
相差不大，为第三影响因素，可见各因素影响的次序
为 C ＞ D ＞ B ＞ A，由此得出的多酚活性物质提取的最
佳工艺为 A2B3C2D1，即提取温度 60℃，固液比1∶15，
乙醇浓度 60%，提取时间 1h。
综合两个考察对象可以看出，C 因素(乙醇浓
度)为多酚含量及其抗氧化活性的主要影响因素，虽
290
然两者得出最佳乙醇浓度有所差异，但差别不大，可
以综合考虑经济效益和目标产物的功效来确定乙醇
浓度，选为 50%;D因素(提取时间)为多酚的抗氧化
活性次要影响因素，可以看出多酚提取物的抗氧化
活性对提取时间比较敏感，两者得出最佳提取时间
一致，均为 1h;同时多酚的抗氧化活性还受提取温度
的影响，提取温度提高有利于多酚物质的浸出，但过
高的温度对多酚抗氧化活性有一定的影响，故提取
温度选定为 60℃。
综上所述，以粗提物的多酚含量及其抗氧化活
性为实验指标，两者获取的最佳工艺条件有两个因
素相同，要获得具有高抗氧化能力的多酚粗提取应
降低提取温度，因此本次实验最终确定的最佳提取
条件为:A2B3C1D1，即提取温度 60℃，固液比 1∶15，乙
醇浓度 50%，提取时间 1h。
2.3 验证实验
根据正交实验所得的最佳方案在已经做过的 9组
实验中没有，因此本次实验按照所获取的条件进行验
证实验，所得结果为:多酚含量 14.43mg /g，DPPH·清
除率为 81.23%。从验证结果与正交实验中的实验结
果相比可以看出，多酚含量和DPPH·清除率都比较
高，但不是最高，原因在于最佳方案需要综合平衡两个
实验指标，出现个别单项实验比最佳方案高也是在所
难免的，因此实验结果可靠，可以采用。
3 结论
在单因素实验的基础上，以乙醇浓度、料液比、
提取温度、提取时间为实验因素进行 4 因素 3 水平的
正交实验，以提取液中多酚活性物质含量和 DPPH·
清除率为实验指标，对实验结果进行方差分析，最
终得到的最佳提取条件为:提取温度 60℃，固液比
1∶15，乙醇浓度 50%，提取时间 1h。在此条件下多
酚含量 14.43mg /g，DPPH·清除率 81.23%。
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208－211.
(上接第 286 页)
作为制备鸭血抗氧化肽的最佳复合酶是可行的。这
两种酶具有不同的活性中心和底物特异性，混合复
配后水解的底物范围大大增加，水解效果及抗氧化
性均好于单一酶。通过单因素实验设计，以及在此
基础上通过四因素三水平响应面法实验，建立了响
应值与各因素之间的数学模型。根据此二次回归模
型，确定复合酶制备鸭血抗氧化肽的最佳工艺参数:
温度为 55.21℃，时间为 1.70h，底物浓度为 10.0%，酶
用量为 0.45AU /g;在此条件下进行实验得出:
SN－TCA指数为 49.13%，DPPH·清除率为 80.75%。
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