全 文 ：第 25卷 第 5期
2009年 10月 　　
哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报(自然科学版)
JournalofHarbinUniversityofCommerce(NaturalSciencesEdition)　　
Vol.25No.5
Oct.2009
收稿日期:2009-08-12.
基金项目:国家自然科学基金项目(30873403);黑龙江省自然科学基金项目(D200502);黑龙江省教育厅科研项目(11511102).
作者简介:孙桂超(1975-), 女 , 硕士 , 研究方向:抗肿瘤药物研究.
四氢异葎草酮诱导 SGC-7901细胞凋亡作用的研究
孙桂超 1, 2 , 邹　翔 1, 2 ,宋　辉 1, 2 ,季宇彬1, 2, 3
(1.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心 , 哈尔滨 150076;2.哈尔滨商业大学 药物研究所
博士后科研工作站 ,哈尔滨 150076;3.教育部 抗肿瘤天然药物工程研究中心 , 哈尔滨 150076)
摘　要:观察四氢异葎草酮(Tetrahydro-isohumulone, TH)通过线粒体途径诱导 SGC-7901细胞凋亡的
机制.MTT法检测 TH对 SGC-7901细胞增殖的影响;荧光显微镜观察 TH对 SGC-7901细胞凋亡形态
的影响;流式细胞仪分析 SGC-7901细胞凋亡率;采用试剂盒检测 Caspase-9的活性;Westernblot法检
测 Caspase-3蛋白表达情况.2、8、32μg/mL的 TH处理 SGC-7901细胞 72 h后 , SGC-7901细胞生长
受到抑制 , 抑制率在一定范围内呈剂量 、时间相关性;随着 TH质量浓度的提高 SGC-7901细胞的凋亡
率也增加;TH各剂量均能够显著升高 SGC-7901细胞内 Caspase-9活性 ,并呈剂量依赖性;同时 , TH能
够上调 SGC-7901细胞内 Caspase-3的表达量 , 并且呈剂量依赖性.TH可通过诱导 SGC-7901细胞凋亡
发挥抗肿瘤作用 , 启动线粒体凋亡通路可能是 TH诱导 SGC-7901细胞凋亡的重要机制之一.
关键词:四氢异葎草酮;SGC-7901;细胞凋亡;线粒体途径
中图分类号:R285　　　 　文献标识码:A　　　　 文章编号:1672-0946(2009)05-0513-05
Studyoncelapoptosiseffectinducedbytetrahydro-iso-humulone
onhumangastriccancerSGC-7901 celsviamitochondrialpathway
SUNGui-chao1, 2 , ZOUXiang1, 2 , SONGHui1, 2 , JIYu-bin1, 2, 3
(1.CenterofResearchandDevelopmentonLifeSciencesandEnvironmentalSciences,
HarbinUniversityofCommerce, Harbin150076, China;2.InstituteofMateriaMedica
andPostdoctoralProgrammeofHarbinUniversityofCommerce, Harbin150076, China;
3.EngineeringReseachCenterofNaturalAnticancerDrugs, MinistryofEducationHarbin150076, China)
Abstract:ToinvestigatetheinducingapoptoticefectofTetrahydro-iso-humulone(TH)on
SGC-7901celsviathemitochondrialpathway.SGC-7901 celsaretreatedwith2, 8, 32μg/
mLofTHfor72 hours.TheMTTassayisusedtodetecttheefectofTHonSGC-7901cels
invitro.FluorescencemicroscopeisusedtoobservethemorphologicalchangesofSGC-7901
cels.Flowcytometryisemployedtoanalysetheapoptoticrates.Activitytestkitisusedto
investigatetheactivitychangesofCaspase-9.WesternBlotassayisemployedtodetectthe
expressionofCaspase-3 protein.THcouldinhibittheproliferationofSGC-7901 celsina
dose-dependentandtime-dependentmanner.ApoptoticratesofSGC-7901celsincreasedaf-
tertreatedwithdiferentdosagesofTH, andtheactivityofCaspase-9 inSGC-7901 isin-
creasedbyTHinadose-dependentmanner.THcouldalsoup-regulatetheexpressionof
Caspase-3 proteininSGC-7901celsinadose-dependentmanner.THcaninhibittheprolif-
erationofSGC-7901cels, andinducingcelapoptosisviathemitochondrialpathwaymaybe
oneoftheimportantactionmechanismsofTH.
Keywords:tetrahydro-iso-humulone;SGC-7901;apoptosis;mitochondrialpathway
　　啤酒花(HumulusLupulusL.)又名忽布(英语
俗名 Hop)、香蛇麻花 、酒花 、野酒花.已有的研究发
现啤酒花中含有十几类化学物质 ,包括树脂类 、挥
发油 、黄酮类 、鞣质 、胆碱 、粗纤维 、氨基酸等多种化
学成分.啤酒花提取物及其复方制剂具有抗菌 、抗
肿瘤 、抗氧化 、镇静 、雌性激素样等多种生物活
性 [ 1-2] .四氢异葎草酮 (Tetrahydro-isohumulone简
称 TH)是啤酒花浸膏四氢异构化后的稳定的活性
成分.以往研究表明 TH可能改变了线粒体渗透转
运孔(PTP),导致线粒体膜电位(MMP)下降 ,启动
线粒体调控的凋亡通路 ,诱导 SGC-7901细胞凋
亡.本实验在此基础上 ,进一步研究四氢异葎草酮
诱导 SGC-7901细胞凋亡的作用及可能机制.
1　材料与方法
1.1　细胞株
SGC-7901人胃癌细胞株 ,由中国医学科学院
药物研究所提供.
1.2　药品和试剂
四氢异葎草酮 (质量分数 95 %,北京豪盛酒
花厂);阿霉素((简称 ADM,山西泰盛制药有限公
司);RPMI-1640培养基(Gibco公司);胎牛血清
(Hyclone公司);胰酶(Gibco公司);DMSO(北京
索莱宝科技有限公司);MTT(溴化四氮唑蓝 ,美国
MolecularProbe公司);AnnexinV-FITC细胞凋亡
检测试剂盒(碧云天公司);Caspase-9活性检测
试剂盒(碧云天公司);兔抗 Caspase-3多克隆抗
体(北京博奥森公司);兔抗 β -actin多克隆抗体
(北京博奥森公司);HRP羊抗兔 IgG(北京索莱堡
公司);其他药品和试剂均为国产分析纯.
1.3　主要仪器
SANYOMC0175型 CO2 培养箱 (NAPCO公
司);JJT-900 /1300超净工作台(北京半导体设备
一厂);OlympusIX70倒置显微镜(Olympus公司);
WELLSCANMK3型酶标仪(美国 Bio-Rad公
司);荧光显微镜(德国 Leica公司);CLOUTEREP-
ICS-XL型流式细胞仪(美国 Beckman-Coulter
公司);凝胶成像系统 , GIS-2019(北京天能公
司);电泳仪(美国 Bio-Rad公司);垂直电泳转印
槽(北京六一仪器厂).
1.4　细胞培养
SGC-7901人胃癌细胞用 RPMI1640培养液(含
10%胎牛血清)于 37℃、5%CO2培养箱中常规培养 ,
细胞贴壁生长 ,每 2 ～ 3d传代 1次.2.5g/L胰蛋白酶
消化传代 ,取对数生长期的细胞用于实验.
1.5　MTT法检测 TH对 SGC-7901细胞增殖的抑
制作用
取对数生长期的 SGC-7901细胞 ,胰酶消化
为细胞悬液 ,细胞计数调整细胞浓度为 5 ×104个 /
mL,按每孔 100 μL接种于 96孔板中 ,置 37 ℃、
5%的 CO2培养箱中孵育 24 h后 ,每孔加 100 μL
不同质量浓度的药液 ,使药物的终质量浓度分别为
2、4、8、16、32、64 μg/mL,每剂量设 6个平行孔;对
照组加相同体积的培养液;阳性对照组每孔加阿霉
素 100 μL使终质量浓度为 0.01、 0.1、 1、10 μg/
mL,于 37 ℃继续培养 72 h后 ,弃上清 ,每孔加入
MTT溶液(0.5 mg/ mL)100 μL,于 37 ℃细胞培
养箱中继续孵育 4 h,弃培养上清 ,每孔加 200 μL
DMSO,用微型振荡器振荡混匀 ,用酶标仪在检测
波长 570 nm条件下测定吸光度(A),依据测得的
吸光度计算抑制率及 IC50.
抑制率 =(对照组 A值 -给药组 A值)/对
照组 A×100%.
1.6　荧光显微镜观察凋亡细胞形态
细胞给药后 72 h收集细胞 ,用 PBS重悬细胞
并计数.取 1×105个重悬的细胞 , 1 600 r/min离
心 5min,弃上清 ,加入 195 μLAnnexinV -FITC
结合液(1X)重悬细胞.加入 5 μLAnnexinV -F
ITC,混匀 ,室温 (20 ～ 25℃)避光孵育 10 min,
1 600r/min离心 5 min,弃上清 , 加入 190 μLAn-
nexinV -FITC结合液 (1X)重悬细胞.加入 10
μL碘化丙啶染色液 ,混匀 ,冰浴避光放置.1 000 r/
min离心 5 min, 收集细胞 , 用 100 μLAnnexinV
-FITC结合液(1X)重悬细胞 ,涂片后荧光显微
镜下观察.
1.7　流式细胞仪检测 TH对 SGC-7901细胞的凋
亡率:
细胞给药后 72 h收集细胞 ,用 PBS重悬细胞
并计数.取 5 ～ 10万重悬的细胞 , 1 000 r/min离
心 5min,弃上清 ,加入 195 μLAnnexinV -FITC
结合液 (1X)重悬细胞.加入 5 μLAnnexinV-
FITC,混匀.室温 25 ℃避光孵育 10 min, 1 000 r/
min离心 5 min,弃上清 ,加入 190 μLAnnexinV-
FITC结合液(1X)重悬细胞.加入 10 μL碘化丙啶
染色液 ,混匀 , 4 ℃避光孵育 15 min.随即用流式细
胞仪检测凋亡率.
1.8　TH对 SGC-7901细胞 Caspase-9相对活性
的影响
给药后 72 h收取细胞.按照每 2×106个细胞
加入 100 μL裂解液的比例加入裂解液 ,重悬沉淀 ,
·514· 哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )　　　　　　　　　　　第 25卷
冰浴裂解 15 min.4 ℃ 12 000 r/min离心 10 min.
收集上清液 , 于 -20℃储存备用.采用 Bradford法
将裂解后的各组蛋白样品调至相同浓度.按照试剂
盒方法测定 Caspase-9相对活性.
1.9　Westernblot法检测 TH对 SGC-7901细胞
Caspase-3蛋白表达的影响
给药后 72h收取细胞.按照每 2×106个细胞
加入 100 μL裂解液的比例加入裂解液 ,重悬沉淀 ,
冰浴裂解 15 min.4 ℃ 12 000 r/min离心 10 min.
收集上清液 , 于 -20℃储存备用.采用 Bradford法
将裂解后的各组蛋白样品调至相同浓度.配制 5%
的浓缩胶及 12%的分离胶.蛋白上样 , 80 V电泳.
待样品前沿进入分离胶后 ,调电压至 120 V,继续
电泳 1 h.电泳结束后剥离浓缩胶 ,用湿转法转膜 ,
电流为 80 mA,转膜时间为 1h.完成后将膜用 5%
脱脂奶粉的 TTBS封闭液封闭 1 h, 取出膜 , 加
1∶200稀释的兔抗 Caspase-3多克隆一抗 ,杂交过
夜 ,然后用 TTBS洗膜 3次 ,每次 5 min, 然后加入
1∶500 TTBS稀释的 HRP标记的二抗 ,室温反应 2
h后取出膜 , TBS洗 3次 ,每次 5 min.加入显色剂
闭光显色 ,显色后凝胶成像系统照相并用分析软件
分析测定.
1.10　结果分析
实验结果采用 SPSS11.5 forWindows软件处
理.各组数据以 x±S表示 ,组间比较采用方差检验.
2　实验结果
2.1　TH对 SGC-7901细胞增殖的影响
实验结果如表 1、图 1所示.随着给药浓度的
增加 , TH对 SGC-7901细胞的抑制作用逐渐增
强 , MTT实验表明 , 阿霉素的 IC50为 0.48μg/mL,
四氢异葎草酮的 IC50为 8.97 μg/mL.
表 1　MTT法检测 TH对 SGC-7901的抑制率
组别 剂量 /(μg· mL-1) n OD值( x±S) 抑制率 /% IC50 /(μg· mL-1)
阴性组 — 6 0.65±0.05 — —
TH 2 6 0.62±0.08 4.32
4 6 0.49±0.04＊ 23.98
8 6 0.25±0.02＊ 61.44 8.97
16 6 0.11±0.009＊ 83.87
32 6 0.07±0.02＊＊ 89.37
64 6 0.07±0.02＊＊ 89.48
　　与阴性组比较＊P<0.05, ＊＊P<0.01
A)阴性组;B)ADM 5μg/mL;C)TH 2μg/mL;D)TH 8μg/mL;E)TH 32μg/mL
图 1　TH对 SGC-7901细胞凋亡形态的影响
·515·第 5期　　　　　　　　　孙桂超 , 等:四氢异葎草酮诱导 SGC-7901细胞凋亡作用的研究
2.2　TH对 SGC-7901细胞凋亡形态的影响
荧光显微镜观察结果如表 1所示.双阴性是正常
细胞 , AnnexinV显阳性为早期凋亡的细胞 ,双阳性是
坏死或晚期凋亡的细胞.从图 1中可以看出 ,随着药
物浓度的增大 ,凋亡细胞数目增多 ,凋亡细胞特征性
形态逐渐明显 ,高剂量组能看到细胞变圆 ,细胞体积
变小 ,凋亡早期细胞呈蓝绿色荧光 ,而凋亡晚期细胞
和坏死细胞呈红色荧光.图 1中箭头所指的细胞为凋
亡晚期细胞 ,可以清楚地看到核碎裂和凋亡小体.
2.3　TH对 SGC-7901细胞凋亡率的影响
实验结果如表 2和图 2所示 ,随 TH质量浓度的
升高凋亡细胞比例不断增多 ,给药各组凋亡率与对照
组比较均具有显著性差异(P<0.05或 P<0.01).
表 2　TH对 SGC-7901细胞凋亡率的影响( x±S)
组别 次数 剂量 /(μg· mL-1) 凋亡率 /%
阴性组 3 — 0.1±0.05
TH 3 2 15.0±0.07＊
3 8 40.5±0.15＊＊
3 32 59.3±0.03＊＊
ADM 3 5 32.5±0.05＊＊
　　与阴性组比较＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
A)阴性组;B)ADM 5μg/mL;C)TH 2μg/mL;D)TH 8μg/mL;E)TH 32μg/mL
图 2　TH对 SGC-7901细胞的凋亡率
2.4　TH对 SGC-7901细胞 Caspase-9相对活性
的影响
研究结果如表 3所示.结果显示 ,与阴性对照组
比较 ,不同浓度的 TH作用 SGC-7901细胞作用 72h
后 ,细胞 Caspase-9的相对活性随着药物质量浓度的
升高而升高 , Caspase-9相对活性分别为 141.67%、
208.33%、383.33%,其中质量浓度为 8、32μg/mL的
TH与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05).
表 3　TH对 SCG-7901细胞内 Caspase-9相对活性的影响
组别 剂量 /(μg· mL-1) 次数 OD值( x±S) Caspase-9活性 /%
阴性组 — 3 0.090±0.005 —
TH 2 3 0.095±0.005 41.67±1.59＊
TH 8 3 0.103±0.003＊ 108.33±6.50＊＊
TH 32 3 0.124±0.004＊ 283.33±11.77＊＊
　　与阴性组比较＊P<0.05, ＊＊P<0.01
·516· 哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )　　　　　　　　　　　第 25卷
2.5　TH对 SGC-7901细胞 Caspase-3蛋白表达
的影响
实验结果如图 3所示 ,内标 β -actin蛋白条带
灰度基本一致 , SGC-7901细胞的 Caspase-3蛋
白表达水平随着 TH的给药质量浓度的升高而升
高 ,与阴性对照组比较 , 2、8、32μg/mL的 TH各组
Caspase-3平均相对表达分别为 126.25±17.15,
142.78±20.14和 188.01±18.59,其中 32μg/mL
组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.
05).
1)Control;2)2μg/mLTH;
3)8μg/mLTH;4)32μg/mLTH
图 3　TH对 SGC-7901细胞内
Caspase-3蛋白表达的影响
3　讨　论
细胞凋亡在肿瘤发生发展和治疗中具有重要
作用.细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡
(ProgrammedCelDeath, PCD),是指细胞在一定的
生理或病理条件下 ,遵循自身的程序 ,自己结束其
生命的过程.它是有一系列酶参与 、由基因控制的
一个主动的 、高度有序的死亡过程 [ 3 -4] .本研究中 ,
MTT法测得 TH对 SGC-7901半数抑制浓度 IC50
分别为 8.97 μg/mL,说明其对 SGC-7901有明显
的细胞毒性作用.通过荧光显微镜下观察 TH2、8、
32 μg/mL剂量下作用 72 h后的 SGC-7901细胞
凋亡形态结果显示 ,可观察到呈现不均匀的团块状
或颗粒状蓝绿色荧光的早期凋亡细胞和红色荧光
的晚期凋亡及坏死细胞 ,荧光强而致密 ,细胞体积
缩小 ,细胞核呈波纹状 ,部分染色质出现浓缩状态.
随着药物质量浓度的增加 ,凋亡的细胞比例也随之
增加 ,并且随着质量浓度的升高呈现一定的剂量依
赖性 ,说明 TH对 SGC-7901的生长抑制作用与诱
导肿瘤细胞凋亡有关.
在细胞凋亡过程中 , Caspase-9处于级联反应
的上游 ,在内源性线粒体途径中 ,细胞内的死亡信
号 ,如 DNA损伤 、毒素和 ATP耗竭等均可以诱发
线粒体释放 CytC.CytC、AIF、Apaf-1(细胞凋亡
蛋白酶活化因子 1)、dATP和 Caspase-9酶原结合
形成凋亡复合体 , Caspase-9被释放并激活 ,接着
下游的 Caspase-3等被激活 ,降解底物使细胞发
生凋亡[ 5-6] .本实验通过对 SGC-7901细胞内的
Caspase-9相对活性的检测 ,发现 TH能够显著地
升高 SGC-7901细胞内的 Caspase-9相对活性.
在细胞中 , Caspase的非程序性活化可以引起严重
的后果.因此 ,它的活化受到严格的调控.在细胞的
正常状态 ,它保持在非活性状态 ,一旦有微小的诱
导信号 , Caspase可以被迅速而广泛地激活 [ 7-8] .根
据 Caspase的功能 ,是作为效应因子(Caspase-3、
Caspase-6和 Caspase-7)还是作为起始因子
(Caspase-8和 Caspase-9),可以将 Caspase酶原
的蛋白水解活性分为两种机制.在促凋亡刺激因子
作用下 ,首先激活了作为起始因子的 Caspase,然后
通过一系列蛋白水解 ,活化了效应因子 Caspase.在
凋亡过程中 ,作为效应因子的 Caspase-3的激活
能够引起大多数底物的蛋白水解 ,降解细胞重要蛋
白质 ,从而导致细胞死亡 [ 9-10] .本研究发现 TH作
用细胞 72 h后 ,细胞内 Caspase-3的蛋白表达水
平显著升高 ,且具一定的有剂量依赖性.综合以上
实验结果 ,我们发现 TH可通过诱导 SGC-7901细
胞凋亡发挥抗肿瘤作用 ,且启动线粒体凋亡通路可
能是 TH诱导 SGC-7901细胞凋亡的重要机制之
一.
参考文献:
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(下转 520页)
·517·第 5期　　　　　　　　　孙桂超 , 等:四氢异葎草酮诱导 SGC-7901细胞凋亡作用的研究
2.9　样品测定
分别精密吸取供试品溶液 、对照品溶液各
10 μL,注入液相色谱仪 ,测定峰面积积分值 ,根据
测定结果 ,脑心通滴丸中紫丁香苷含量应不低于
0.014 mg/丸.见表 6.
表 6　脑心通滴丸中紫丁香苷的含量
序号 紫丁香苷含量 /(mg·丸 -1) RSD/%
1 0.017 115
2 0.017 108 0.14
3 0.017 071
4 0.014 794
5 0.014 365 1.70
6 0.014 801
7 0.014 253
8 0.014 077 0.77
9 0.014 277
3　结　语
由实验得知紫丁香苷在 265 nm处有最大吸
收 ,且峰形较好 ,其他成分在该波长处无干扰 ,可作
为检测波长.实验过程中考察了热提和超声波提取
2种方法 ,发现超声波提取法更能充分的提取紫丁
香苷 ,使紫丁香苷的含量测定更准确可靠.本实验
采用的方法 ,精密度 、重现性 、稳定性 、回收率等指
标良好 ,表明该方法专属性较强 ,且简单 、可靠 ,可
以用于脑心通滴丸中紫丁香苷的含量测定.
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