全 文 ：四川 大 学 学 报 (医 学版 )
J Sichuan Un iv (Med Sci Edi)
　 2008; 39( 6): 1027 - 1031　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
草花粉变应原的纯化及免疫特性分析*
刘　昀 1 , 孙秀珍 1△ , 徐迪士 2 , 李　维 1 , 冯向莉 1 , 徐　晶 1
1.西安交通大学医学院第二附属医院呼吸内科 (西安 710004) ; 2. 清华大学玉泉医院 内科
　　【摘要】目的　纯化 草花粉变应原并分析其免疫学活性。 方法　粗制 草花粉提取液经 Sephadex G-75
Sephacr yl S-200HR层析柱纯化 ,分段收集各组份。 SDS-PAGE检测各组分蛋白相对分子质量 , ELISA抑制实验及
免疫印迹实验分析各组分蛋白质对特异性 IgG和 IgE的抑制率及与患者血清的反应率。结果　浓缩粗制 草花粉
提取液经 Sephadex G-75层析柱纯化 ,得到两个峰 ,第一峰富含蛋白质 ,第二峰含有大量色素 ,蛋白含量甚微 ,弃之 ;
收集第一峰及其谷段洗脱液 ( P液 ) ,经 Sephacr yl S-200HR层析柱纯化 ,分离出 4个组份 ,即第一峰 ( P1 )、谷段 ( V )、
第二峰 ( P2 )和末段 ( E)。 电泳结果显示纯化后的 草花粉含 20多种蛋白质条带 ,相对分子质量区带为 5. 0× 103～
97. 4× 103 , P1段主要是相对分子质量为 43× 103～ 97. 4× 103的蛋白质 , P2段和 V段主要是相对分子质量为 5. 0×
103～ 43× 103的蛋白质 , E段主要是相对分子质量为 5. 0× 103以下的蛋白质 ; EL ISA抑制实验结果显示 P1、 V、
P2、 E对 sIg G抑制率分别为 68% 、 70% 、 95% 、 5% ,对 sIgE抑制率分别为 25% 、 64% 、 71% 、 11% ;免疫印迹实验结
果显示 P1、 V、 P2、 E与患者血清 sIgG的反应率分别为 65. 63% 、 78. 13% 、 87. 50% 、 6. 25% ,与患者血清 sIg E的反应
率分别为 25. 00% 、 71. 88% 、 84. 38% 、 15. 63%。 结论　草花粉含 20多种蛋白质成分 ,相对分子质量在 5× 103～ 43
× 103之间的蛋白质变应原性和免疫原性均较强 ,为主要变应原 ;相对分子质量在 43× 103～ 94. 7× 103的蛋白质免
疫原性强而变应原性弱 ,为次要变应原。
【关键词】　 草花粉　纯化　变应原　变应原性　免疫原性
【中图分类号】　 R593. 1
Purif ication and Analysis of the Immunoactivity of Humulus Pollen Allergen　 LIU Yun , SUN X iu-zhen△ , XU
Di -shi , LI Wei , FEN G X iang-li , XU J ing.　 Respiratory Departments, Second Aff iliated Hospital of Medical
College , Xi’ an J iaotong University , Xi’ an 710004, China
【Abstract】　 Objective　 To purify the humulus po llen a llerg en and study the allerg enicity and immunogenicity
of it. Methods　 Crude humulus po llen ex tr acts w ere purified by gel filtr ation with Sephadex G-75 and Sephacry l S-
200HR. Various fractions of the alle rg en pro tein w ere co llected respectiv ely. The mo lecula r w eigh ts of pro tein
w ere confirmed by SDS-PAGE. The inhibition r ate and reaction ra te with sIgG and sIgE o f pa tient’ s se rum w ere
determined by EL ISA inhibition test and w estern blo tting . Results　 Tw o peaks w ere obtained f rom crude humulus
pollen ex tra cts by gel filtra tion o f Sephadex G-75. The first peak contained most of pro tein while the second peak
contained little pr otein and lo ts o f pigments. So the second peak was th row n away. P solution w hich contained the
first peak and valley frac tion were purified by gel filt ration o f Sephacry l S-200HR and four components that
included the 1st peak, the va lley, the 2nd peak and the end fr action w ere obtained. The r esults o f elec tropho resis
demonstra ted that purified humulus po llen contained mo re than 20 kinds of pro tein with the molecular weights
ranged fr om 5. 0× 103 to 97. 4× 103. The fraction of the 1s t peak contained protein w ith the mo lecula r weights
ranged f rom 43× 103 to 97. 4× 103 , a nd the fra ction o f the valley and the 2nd peak contained pro tein with the
mo lecula r w eigh ts ranged from 5. 0× 103 to 43× 103 . The frac tion o f the end contained pro tein with the mo lecula r
w eigh ts lower than 5. 0× 103 . The results o f ELISA inhibition test showed tha t the inhibition rate o f the 1st peak,
the valley , the 2nd peak and the end f raction to s IgG we re 68% , 70% , 95% , 5% respec tively , and th ose to sIg E
w ere 25% , 64% , 71% , 11% respectiv ely. The results of w estern blo tting demonstra ted that th e r eaction ra te o f the
1st peak, the valley, the 2nd peak and the end frac tion with s IgG o f patients’ serum were 65. 63% , 78. 13% ,
87. 50% , 6. 25% respectiv ely , and those with patients’ sIgE w ere 25. 00% , 71. 88% , 84. 38% , 15. 63%
respectiv ely. Conclusion　 Humulus po llen contained mo re than 20 kinds of pr otein. The pro teins with mo lecula r
w eigh ts ranged from 5. 0× 103 to 43× 103 w ere the ma jo r a llerg en with strong allerg enicity and immunogenicity.
The pro teins with molecular w eights ranged from 43× 103 to 97. 4× 103 we re subo rdina ted alle rg en with strong
immunogenicity and w eak aller genicity.
【Key words】　　 Humulus pollen　　 Purifica tion　　 Aller gen　　 Aller genicity　　 Imm unogenicity
* 国家自然科学基金 (批准号 30371336)资助
△ Co rresponding au thor, E-mai l: doc-ly@ sohu. com
　　 草花粉是我国夏秋季节主要致敏花粉之一 ,
常常引起哮喘发作 , 草花粉变应原疫苗特异性免
疫治疗 ( SIT)是唯一针对病因治疗的有效方法。但
由于粗制变应原成分复杂 ,易引起局部及全身毒副
反应 ,甚至偶可造成哮喘严重发作致死亡 ,因此开发
高纯度无致敏性变应原疫苗是近几年过敏性疾病防
治的研究热点。本研究采取凝胶层析方法对 草花
粉变应原进行纯化并分析其免疫学活性。 国内外尚
未见相关报道。
1　材料和方法
1. 1　 草花粉变应原粗浸液 (Crude, C)的制备
自然脱落法收集 草花粉 , 9号分样筛过筛 ,室
温下乙醚脱脂 ,以 50 g /L浓度浸泡于柯卡氏液 ,超
声波粉碎 ( 150 W, 10 min) ,提取 72 h, 4℃下 13000
×g离心 30 min,取上清 ,用布氏漏斗减压抽吸过滤
分离杂质 ,再将滤液装于透析袋置 PBS中透析 24
h,每 4～ 6 h更换一次透析液 ,后将透析袋置于空中
吹拂浓缩至总体积的十分之一 ,浓缩后置 4℃冰箱
冷藏保存 [1 ]。
1. 2　 草花粉变应原的纯化
1. 2. 1　 草花粉变应原粗浸液 ( C液 )经 Sephadex
G-75层析柱纯化　取 20 g Sephadex G-75于 250
m L 0. 01 mo l /L pH7. 40的 PBS中溶胀过夜 ,装柱 ,
待凝胶沉积后用 2～ 3倍柱床体积的 PBS冲洗平衡
层析柱 ,放出多余液体后 ,加入 C液 2 mL,连接恒
流泵 ,用 0. 01 mol /L pH7. 40的 PBS洗脱 ,电脑全
自动部分收集器收集洗脱液 ,核酸蛋白检测仪监控
洗脱情况 ,得洗脱曲线 ,有两个峰 ,混合收集无色透
明蛋白含量高前峰段洗脱液 ( P液 ) ,经浓缩、透析、
离心 ( 10 000× g 10 min)后 , 4℃冰箱冷藏保存 ,后
峰富含色素 ,只含微量蛋白 ,弃之。
1. 2. 2　 P液经 Sephacry l S-200HR层析柱纯化　
取 20 g Sephacryl S-200HR同前方法 ( 1. 2. 1)装柱
及平衡 ,加入浓缩的 P液 2 mL,连接恒流泵 ,用
0. 01 mo l /L pH7. 40的 PBS洗脱 ,核酸蛋白检测仪
监控洗脱情况 ,得洗脱曲线 ,分离出 4个组分 ,即第
一峰 ( P1 )、谷段 ( V)、第二峰 ( P2 )和末段 ( E) ,分别收
集各段洗脱液经浓缩、透析、离心 ( 10 000× g 10
min)后 , 4℃冰箱冷藏保存。
1. 3　十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-
PAGE)检测各组分蛋白质相对分子质量区带
取标准蛋白 ( M )、 C液和 Sephadex G-75洗脱
出的 P液、 Sephacryl S-200HR洗脱出的 P1、 V、 P2、
E段各 50μL进行蛋白电泳 ,采用不连续 PAGE,分
离胶浓度为 12. 5% ,浓缩胶浓度为 5% ,电极缓冲液
为 pH8. 30的 Tris-甘氨酸系统。室温下电泳 ,电压
为 110 V ,电流为 15 mA,染料迁移至距凝胶下端约
1 cm处 ,停止电泳。 取出凝胶 ,染色 1 h,倾出染色
液 ,用蒸馏水洗凝胶数次后加入脱色液 ,数小时换液
一次 ,直到背景清晰。根据标准分子质量计算各组分
蛋白质相对分子质量。
1. 4　 ELISA法测各组分对特异性免疫球蛋白 ( sIg)
的抑制率
1. 4. 1　血清准备　① 阳性血清:收集 32例我院变
态反应专科门诊 草花粉过敏性哮喘患者血清 ,其
中男性 14例 ,女性 18例 ,年龄 10～ 63岁〔平均年龄
( 34± 18)岁〕。支气管哮喘诊断标准依据第四届全国
哮喘学术会议制定的《支气管哮喘防治指南》 [2 ] ,
草花粉过敏的筛选标准: 根据典型的花粉过敏病史 ;
草花粉变应原皮肤点刺实验结果≥+ + + ; CAP
系统检测哮喘患者血清 草花粉特异性 IgE( sIgE)
阳性。② 阴性血清: 10例无变态反应病史的健康患
者血清 ,各种变应原皮试均为阴性。
1. 4. 2　操作方法　①稀释 P液 200μL包被
ELISA平板 , 4℃过夜 ;②抑制管准备: 0. 01 mol /L
pH7. 40的 PBST稀释阳性血清 ( 1∶ 2. 5稀释待测
sIgE抑制率 , 1∶ 12. 5稀释待测 sIgG抑制率 ) ,两种
浓度各 4管 ,分别加等体积 P1、V、 P2、 E抗原 ,置 37
℃孵育 1 h,对照的阳性血清、阴性血清也同时孵
育 ;③于 P液包被的板孔中分别加阴性血清、阳性
血清、抑制管血清各 200μL, 37℃孵育 2 h;④分别
加兔抗人 IgG-HRP、兔抗人 IgE-HRP各 100μL, 37
℃孵育 2 h; ⑤加底物 ( 4-氯-1-萘酚+ 1% H2O2 ) 150
μL, 37℃ 30 min;⑥加终止液终止反应 ;每次试剂
之间均洗涤 3次× 5 min;⑦用酶标仪测吸光度值
( A值 ) ,以阴性血清调零 ,测定抑制管血清及阳性血
清的吸光度值 ,计算抑制率 ( IR): = (阳性血清 A值
-抑制管血清 A值 ) /阳性血清 A值× 100%。
1. 5　 Western Blotting实验分析各组分蛋白质与
患者血清的反应率
1. 5. 1　转印　①参见步骤 1. 3的 SDS-PAGE制作
板胶 ,灌胶后不插入梳子 ,在浓缩胶上加 3 mm高的
样品层 P1 ,电泳步骤同 1. 3,不染色 ;②在电泳凝胶
上放相同大小的硝酸纤维素膜 ,分别在凝胶两侧加
滤纸、泡沫垫、有机玻璃支持 ;③将上述装置放入盛
有电转移缓冲液的电泳槽内 ;④电泳: 100 mA通电
3 h ,将膜取出夹在两张干燥的滤纸之间干燥。重复
1028 四川大学学报 (医学版 ) 2008年第 39卷第 6期　
上述操作过程 ,分别转印 V、 P2、 E组分。
1. 5. 2　免疫学分析　①将硝酸纤维素膜切成 2
mm宽的条带 ;②分别置于转移槽中 , PBS T冲洗 10
min;③将硝酸纤维素膜条置于含 4%脱脂奶粉封闭
液中 , 37℃缓慢摇动 2 h;④ PBST冲洗 3次× 5
min;⑤按测 sIgG1∶ 50, s Ig E1∶ 10分别加入 草
花粉过敏患者血清 , 37℃摇动 2 h;⑥ PBST冲洗 3
次× 5 min;⑦分别加入兔抗人 Ig G-HRP、兔抗人
IgE-HRP, 37℃摇动 2h;⑧ PBS T冲洗 3次× 5
min, PBS冲洗 10 min;⑨加底物溶液 ,反应 2～ 10
min,至显色后终止反应。
2　结果
2. 1　 草花粉变应原层析柱纯化结果
2. 1. 1　浓缩 C液经 Sephadex G-75层析柱纯化结
果　浓缩 C液经 Sephadex G-75层析柱纯化 ,用
0. 01 mol /L pH7. 40 PBS洗脱 ,洗脱曲线 (图 1)为
两个峰 ,第一峰无色澄清 ,富含蛋白质 ;第二峰为橙
黄色 ,含有大量色素 ,蛋白含量甚微 ,弃之。收集第一
峰及其谷段洗脱液 ( P液 )。
图 1　浓缩 C液 Sephadex G-75洗脱曲线
Fig 1　 Elution graph of concentrated Crude extract appl ied to
Sephadex G-75
2. 1. 2　浓缩 P液经 Sephacryl S-200HR层析柱纯
化结果　浓缩 P液经 Sephacryl S-200HR层析柱纯
化 ,用 0. 01 mol /L pH7. 40 PBS洗脱 ,洗脱曲线 (图
2)分离出 4个组分 ,即第一峰 ( P1 )、谷段 ( V )、第二
峰 ( P2 )和末段 ( E)。
2. 2　 SDS-PAGE法测各组分蛋白质相对分子质量
区带
取标准蛋白 ( M )、 C液和 Sephadex G-75洗脱
出的 P液、 Sephacryl S-200HR洗脱出的 P1、 V、 P2、
E段各 50μL进行蛋白电泳 ,结果见图 3,可见 C液
含有 20多条蛋白质 ,相对分子质量在 5. 0× 103～
97. 4× 103之间 ;经 Sephadex G-75初步纯化的 P液
图 2　浓缩 P液经 Sephacryl S-200HR洗脱曲线
Fig 2　 Elution graph of concentrated P solution applied to Sephacryl
S-200HR
含有的蛋白质条带与 C液相似 ;经 Sephacry S-
200HR层析纯化后的 P1蛋白质相对分子质量区带
43× 103～ 97. 4× 103 ; V蛋白质相对分子质量区带
5. 0× 103～ 43× 103 ; P2蛋白质相对分子质量区带同
V段组分 ,但含量较 V段更丰富。 E段蛋白质相对
分子质量在 5. 0× 103以下。
2. 3　 ELISA检测各组分对 sIgG和 sIgE的抑制率
ELISA抑制实验结果显示 P1、 V、 P2、 E对 sIgE
抑制率分别为 25% 、 64%、 71% 、 11% ,对 sIgG抑制
率分别为 68% 、 70% 、 95% 、 5% (表 1)。提示 P1组
分具有较强的免疫原性 ,而变应原性较弱 , P2组分
的变应原性及免疫原性均较强。
2. 4　 Western Blotting检测结果
图 3　 草花粉变应原蛋白电泳结果
Fig 3　 Electrophoresis resul ts of protein of humulus pol len allergen
M: Protein marker; V: The v al ley f raction af ter purifi ed by gel
f il tration wi th Sephacry S-200HR; P2: Th e 2
nd peak f raction af ter
pu ri fi ed by g el fil t ration w ith Seph acry S-200HR; P: Th e 1st p eak
f raction and valley f raction af ter pu ri fied by gel f il t ration wi th
Sephadex G-75; P1: Th e 1
st peak f ract ion af ter purif ied by gel
f il tration w ith Sephacry S-200HR; E: Th e end f raction af ter pu rif ied
b y gel fil t ration w i th Seph acry S-200HR; C: The crude ext ract of
h umulus pollen allerg en
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表 1　各组分对 s IgE和 s IgG抑制率
Table 1　 Inhibition ratio of different component to specific IgE and specific IgG
PS
A
P1
A IR
V
A IR
P2
A IR
E
A IR
IgE 0. 28 0. 21 25% 0. 10 64% 0. 08 71% 0. 25 11%
Ig G 0. 92 0. 29 68% 0. 28 70% 0. 05 95% 0. 87 5%
　　 PS: Posit ive s erum; A: Abso rb ency valu e; IR: Inhibi ti on ratio= ( A value of posi tive serum - A value of inhibi ted s erum ) /A v alue of
posit ive serum× 100%
　　 P1、 V、 P2、 E各组分与患者血清 sIgG的反应例
数分别为: 32例中 21例、 25例、 28例和 2例 ,反应
率分别为: 65. 63% 、 78. 13% 、 87. 50% 、 6. 25% ;与患
者血清 sIgE的反应例数分别为: 32例中 8例、 23
例、 27例和 5例 ,反应率分别为: 25. 00%、 71. 88%、
84. 38% 、 15. 63% (表 2)。 P2和 V段组分与 70%以
上的过敏患者反应 ,提示其含有的蛋白成分是 草
花粉的主要变应原成分 ,而 P1段组分的 sIg G反应
率为 65. 63% ,其含有的蛋白成分为次要变应原成
分。
表 2　各组分与患者血清 sIgG和 sIgE的反应率 (例数 )
Table 2　 Different component react rate with specif ic IgE and
speci fic IgG of patients’ serum ( number)
P1 V P2 E
IgG 65. 63% ( 21) 78. 13% ( 25) 87. 50% ( 28) 6. 25% ( 2)
IgE 25. 00% ( 8) 71. 88% ( 23) 84. 38% ( 27) 15. 63% ( 5)
3　讨论
草俗称“拉拉秧” ,为被子植物门双子叶植物
纲桑科 草属一年生缠绕草本植物 ,秋季开花 ,属风
媒花。近年来的调查资料表明 , 草花粉已成为我国
多数地区夏秋季节花粉症的一个重要变应原 [ 1, 3- 6]。
草花粉致敏引起的Ⅰ型变态反应病是影响全球
健康的主要问题之一 [7 ]。在变态反应疾病的众多治
疗方法中 ,只有 SIT是针对病因治疗的有效方法 ,
并可以改变哮喘病程 ,能阻滞症状的恶化和防治对
新的过敏原产生过敏。半个多世纪以来 ,世界各地变
态反应学者一直应用粗制变应原进行 SI T,虽有一
定疗效 ,但因其含多种致敏和非致敏物质 ,注射后可
引起局部及全身过敏反应和新的致敏而恶化疾病 ,
为此 ,开发高纯度、无致敏性的变应原制剂是近年国
内外该领域研究的热点 [8, 9 ]。 国外在变应原特征、纯
化和分子克隆方面进行了大量的研究工作。目前开
发的一些高度纯化的天然和重组变应原 ,已成为植
物花粉变应原标准化的诊断试剂和治疗试剂 [ 10]。国
外一些研究使用离子交换和亲和层析法等方法纯化
变应原 [11, 12 ] ,这需要价格昂贵和高特异性设备 ,如
快速蛋白质液相层析法 ( FPLC)和高效液相色谱仪 ,
但这些方法很难推广应用。
本研究采用传统方法浸泡提取 草花粉变应
原 ,浓缩后用凝胶层析原理把蛋白质分子按分子大
小进行分离 ,工序简单 ,分离方法高效、快捷、经济。
以 Sephadex G-75作为凝胶介质 ,进行洗脱 ,可弃除
大部分杂质如色素及相对分子质量小于 3000的物
质。 收集主要蛋白质峰段 ,再进行浓缩、透析和离心
后 ,用 Sephacry S-200HR作为凝胶介质 ,洗脱后按
先后顺序收集 4个组分 ,几乎所有的色素和相对分
子质量小于 5000的物质被除去 ,这样大部分杂质及
对身体有刺激性的盐类物质被除去 ,还可以分离出
主要变应原和次要变应原 ,运用这些组分进行免疫
诊断和 SIT治疗 ,可以减少过敏反应和假阳性结
果 ,符合变应原疫苗制剂的研究方向。目前的研究表
明 ,作为 SIT的变应原疫苗制剂不需要过分纯化 ,
因为在变应原制剂中成分复杂 ,很难分离 ,况且这些
成分往往属同科植物 ,具有交叉抗原性 ,同亲缘更近
的同种属交叉抗原性更强 [13 ] ,故单一成分抗原作
SI T的效果较差。所以组分分离可能更合乎临床的
需要。
大部分变应原同时具有变应原性和免疫原性。
变应原性是指抗原介导机体产生 sIgE型抗体 , sIgE
抗体最主要的生物学活性是具有同种组织细胞亲嗜
性 ,使其致敏并引起肥大细胞脱颗粒 ,进而生物活性
介质释放 ,导致哮喘等变应性疾病的发生。免疫原性
是指抗原介导机体产生 IgG型抗体的能力 ,在变态
反应如过敏性哮喘发作中 , IgG是机体产生的保护
性抗体 ,也是特异性阻滞性抗体 ,它能阻止过敏原激
发的特异性 IgE与肥大细胞表面结合 ,从而防止肥
大细胞脱颗粒 ,阻止或减轻了哮喘病的发作。本研究
中 ,峰 1诱导机体产生的主要为 sIgG,而少部分患
者也产生了 sIgE,为次要变应原成分 ,因为峰 1免
疫原性强而变应原性弱 ,应该是 SIT 的理想成分。
而谷段和峰 2段免疫原性和变应原性均较强 ,可介
导机体产生 sIgE诱发哮喘发作 ,同时又介导机体产
生保护性抗体 sIgG。 应该是主要变应原组分 ,也是
1030 四川大学学报 (医学版 ) 2008年第 39卷第 6期　
主要诊断试剂及 SIT的主要成分。 而末段产生的
s Ig E免疫原性和变应原性均较弱 ,作为 SIT应尽量
弃除。通过本实验 ,我们区分了 草花粉的主要变应
原和次要变应原 ,为 草花粉变应原疫苗的研究提
供了基础。国外已有研究检测到很多相对分子质量
在 10× 103～ 20× 103的变应原 ,如螨 Der f /p 2[14 ]、
乳汁 [15 ]、小麦 [16 ]及白桦变应原。相对分子质量小的
变应原容易通过气道、结肠黏膜 [17 ]。 据报道这些变
应原可诱发哮喘和变应性鼻炎 [18 ] ,与本研究中 P2
段相似。因此本研究为蛋白质抗原的纯化提供了新
的途径 ,为变应原制剂的标准化和临床应用提供了
研究基础。
参 考 文 献
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( 2008 - 06 - 03收稿 , 2008 - 09 - 18修回 )
编辑　汤　洁
1031　 J Sichuan Univ ( Med Sci Edi) Vo l. 39 No. 6 2008