全 文 ：202
响应面法优化野葛叶中
叶绿素超声波提取工艺
魏文恺1，郝建平1，* ，王 峰1，张 静1，宋 强2
(1.山西大学生命科学学院，山西太原 030006;
2.山西中医学院，山西太原 030024)
收稿日期:2014－10－08
作者简介:魏文恺(1988－) ，女，在读研究生，研究方向:药用植物细胞工程。
* 通讯作者:郝建平(1959－) ，男，硕士，副教授，研究方向:植物细胞工程。
基金项目:国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BA107B05－4)。
摘 要:为优化野葛叶叶绿素提取工艺，在超声波辅助的基础上，选取影响叶绿素提取效果的液固比、超声提取温度、
超声提取时间、提取溶剂种类四个因素，在单因素实验的基础上，根据 Box－behnken中心组合设计原理，以叶绿素得率
为影响值，进行四因素三水平的响应面分析(ＲSA)。结果表明，超声波辅助提取野葛叶中叶绿素优化条件为:液固比
106∶1(mL·g －1) ，超声提取温度 54℃，超声提取时间 31min，提取溶剂种类乙醇∶丙酮(1.9∶1) ，在此条件下，叶绿素得率
可达 0.691%。
关键词:野葛，叶绿素，响应面，优化
Optimization of ultrasonic－assisted extraction process of
chlorophyll from Pueraria lobata using response surface methodology
WEI Wen－kai1，HAO Jian－ping1，* ，WANG Feng1，ZHANG Jing1，SONG Qiang2
(1.School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China;2.Shanxi University
of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China)
Abstract:In order to optimize the ultrasound extract of Pueraria lobata leaves chlorophyll process conditions，four
factors were selected which had effect on extraction rate of chlorophyll，that was ratio of liquid to material，
ultrasonic extraction temperature，ultrasonic extraction time，extraction solvent species.In the basis of single factor
experiments，these four factors were optimized using response surface analysis based on a four－variable，three－
level Box－Behnken design.The results showed that the optimum preparation technology for ultrasound extract of
Pueraria lobata leaves chlorophyll were:ratio of liquid to material was 106 ∶ 1(mL·g － 1) ，ultrasonic extraction
temperature was 54℃，ultrasonic extraction time was 31min，extraction solvent species ethanol ∶ acetone(1.9 ∶1).
Under the optimal extraction condition，the chlorophyll productivity was 0.691% .
Key words:Pueraria lobata;chlorophyll;response surface analysis(ＲSA) ;optimization
中图分类号:TS201.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2015)11－0202－06
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 11． 032
野葛 Pueraria lobata(Willd.)Ohwi为豆科多年生
落叶藤本植物，也是我国卫生部公布的药食同源植
物，全株均有使用价值［1］。葛根的主要组成是淀粉、
纤维素、蛋白质和总黄酮，还有少量的脂肪、果胶、鞣
质和生物碱等［2］，其中的葛根素等异黄酮成分具有扩
张冠状动脉和脑血管、改善心脑血液循环、降低心肌
耗氧量、增强机体免疫力以及降低血糖等功效［3－4］;
葛蔓中含有与葛根基本相同的有效成分，故药理作
用也相似;葛花主要用于改善酒精引起的新陈代谢
异常;葛叶中有效成分则以叶绿素为主，同时富含胡
萝卜黄素、各种维生素、矿物质、黄酮类、糖苷等［1］。
叶绿素含量是衡量植物光合作用能力的重要生
理指标［5］。其无毒，可食用，还具有抗氧化和抗突变特
性，广泛应用于食品、化妆品、医药等领域［6－7］。叶绿素
为脂溶性色素，不溶于水而溶于丙酮、乙醇和石油醚等
有机溶剂［8］。不同的提取方法以及不同的提取溶剂对
叶绿素的提取及稳定性均会产生不同影响［9－10］。
本实验用超声波辅助有机溶剂提取叶绿素，既
可有效地避免光照，同时也节约了成本，提高了提取
效率。在单因素实验的基础上，应用响应面法优化，
解决了多变量问题，而且所得结果精度高，优化效果
好［11－12］。目前对野葛的研究，多以葛根、葛花的作用
203
以及其中有效成分含量的测定为主，葛叶的研究尚
未见报道。野生野葛在山西省由北到南均有分布，
对于晋产野葛的研究也尚属空白［13－14］。本实验为晋
产野葛叶资源的开发利用提供了参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
野葛叶 采集于山西省晋城市陵川县崇文镇磨
河，50℃烘干，粉碎机粉碎;乙醇、丙酮 天津市进丰
化工有限公司，分析纯。
SP－2000UV型紫外可见分光光度计 上海光谱
仪器有限公司;FA1604N 型电子天平 上海精密科
学仪器有限公司;KQ－100E 型超声波清洗器 昆山
市超声仪器有限公司;101 － 2AB 型电热鼓风干燥
箱 天津市泰斯特仪器有限公司;MJ－25BM05A 型
搅拌机 广东美的精品电器制造有限公司;其他常
用玻璃仪器。
1.2 实验方法
1.2.1 叶绿素提取方法 准确称取适量干叶粉末
(过 35 目筛)，加入一定量的提取溶液，在超声波条
件下提取叶绿素，然后抽滤并收集滤液，将滤液稀释
20 倍，进行吸光度测定。全部实验过程在避光或弱
光下进行［15］。高等植物中的叶绿素主要有叶绿素 a
和叶绿素 b 两种类型。应用紫外分光光度计分别测
定提取液在波长 663nm 和 645nm 处的吸光度，根据
以下公式计算总叶绿素的含量。
叶绿素 a浓度(mg /L)Ca = 12.7A663－2.69A645
叶绿素 b浓度(mg /L)Cb = 22.9A645－4.68A663
叶绿素总浓度(mg /L)C总 = Ca + Cb
叶绿素得率(%)= C总 ×提取液体积 ×稀释倍
数 /样品质量 × 100
1.2.2 单因素实验 分别以不同的液固比、超声提
取温度、超声提取时间、提取溶剂种类进行单因素实
验，考察各因素对野葛叶的叶绿素提取的影响。每
个单因素实验重复提取 3 次，分别测定其吸光度值，
取平均值。
1.2.2.1 液固比对叶绿素得率的影响 在超声提取
时间为 20min、超声提取温度为 30℃、提取溶剂为乙
醇∶丙酮(1 ∶1)的条件下，选取液固比为 20 ∶1、40 ∶1、
60∶1、80∶1、100∶1、120∶1、140∶1(mL·g －1)进行叶绿素
提取实验。
1.2.2.2 超声提取温度对叶绿素得率的影响 在液
固比为 100∶1(mL·g －1)、超声提取时间为 20min、提取
溶剂为乙醇∶丙酮(1∶1)的条件下，选取超声提取温度
为 30、40、50、60、70℃进行叶绿素提取实验。
1.2.2.3 超声提取时间对叶绿素得率的影响 在液
固比为 100∶1(mL·g －1)、超声提取温度为 50℃、提取
溶剂为乙醇∶丙酮(1∶1)的条件下，选取超声提取时间
为 10、20、30、40、50min进行叶绿素提取实验。
1.2.2.4 提取溶剂种类对叶绿素得率的影响 在液
固比为 100∶1(mL·g －1)、超声提取温度为 50℃、超声
提取时间为 30min的条件下，选取提取溶剂为乙醇、
乙醇∶丙酮(3∶1)、乙醇∶丙酮(2∶1)、乙醇∶丙酮(1∶1)、
乙醇∶丙酮(1∶2)、乙醇∶丙酮(1∶3)和丙酮进行叶绿素
提取实验。
1.2.3 响应面法优化实验 在单因素实验的基础
上，根据 Box－Behnken中心组合实验设计原理，对液
固比、超声提取温度、超声提取时间、提取溶剂种类
四个因素进行四因素三水平实验设计，对提取条件
进行优化，实验因素与水平见表 1。
表 1 响应面分析因素与水平
Table 1 Analytical factors and levels for ＲSA
因素
水平
－ 1 0 1
A液固比(mL·g －1) 80∶1 100∶1 120∶1
B超声提取温度(℃) 40 50 60
C超声提取时间(min) 20 30 40
D提取溶剂种类
乙醇∶丙酮
= 3∶1
乙醇∶丙酮
= 2∶1
乙醇∶丙酮
= 1∶1
1.2.4 数据分析 实验数据采用 Minitab15.0 和
Excel软件进行处理。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果与分析
2.1.1 液固比对叶绿素得率的影响 结果如图 1。
图 1 液固比对叶绿素提取率的影响
Fig.1 Effect of liquor to material on
extraction yield of chlorophylls
由图 1 可以看出，随着液固比的增加，叶绿素得
率也逐渐升高。当达到 100∶1(mL·g －1)以后，随着液
固比的增加，叶绿素得率变化不大。这可能是由于
随着提取溶剂量的增加，材料与溶剂的接触面浓度
差越大，渗透压也越大，叶绿素容易浸出［9］;当溶剂量
增加到一定值时，材料中叶绿素浸出达到一定平
衡［16］，叶绿素得率趋于平稳。此外，溶剂量太大也会
增加生产成本和溶剂成本的回收。
因此，选取液固比 100∶1(mL·g －1)为最优值，同
时在 80∶1～120∶1(mL·g －1)之间做进一步优化。
2.1.2 超声提取温度对叶绿素得率的影响 结果如
图 2。
由图 2 可以看出，随着超声波提取温度的升高，
叶绿素得率先上升后下降;当温度为 50℃时，叶绿素
得率达到最大值，之后叶绿素得率下降。这可能是
由于随着温度的升高，使分子运动加剧［17］，植物组织
软化、膨胀，从而加速溶剂对叶绿素的渗透及对叶绿
素的溶解［12］，使叶绿素得率增加;当温度达到 50℃以
后，高温使热敏性物质叶绿素被破坏［18］，导致叶绿素
204
图 2 超声提取温度对叶绿素提取率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature
on extraction yield of chlorophylls
得率下降。
因此，选取超声提取温度 50℃为最优值，同时在
40～60℃之间做进一步优化。
2.1.3 超声提取时间对叶绿素得率的影响 结果如
图 3。
图 3 超声提取时间对叶绿素提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction time
on extraction yield of chlorophylls
由图 3 可以看出，随着超声提取时间的增加，叶
绿素得率先上升后下降，当时间为 30min 时叶绿素
得率达到最大值，之后叶绿素得率下降。这可能是
由于随着时间的增加，超声波对材料的作用就越充
分［9］，叶绿素得率升高;当达到一定时间后，叶绿素的
浸出趋于平衡，而且已经浸出的叶绿素在长时间的
超声波条件下可能遭到破坏［16］，因此有所下降。
因此，选取超声提取时间 30min 为最优值，同时
在 20～40min之间做进一步优化。
2.1.4 提取溶剂种类对叶绿素得率的影响 结果如
图 4。
由图 4 可以看出，当单一的乙醇或丙酮作为提
取溶剂时，叶绿素得率都不是最高。在混合溶剂中，
随着丙酮所占比重的增加，叶绿素得率先升高后下
降;当提取溶剂为乙醇∶丙酮(2∶1)时，叶绿素得率达
到最大值。这可能是由于混合溶剂的协萃效应使叶
绿素的溶解性能优于单一溶剂［15］。
因此，选取提取溶剂乙醇∶丙酮(2∶1)为最优值，
同时在乙醇∶丙酮(3∶1)～乙醇∶丙酮(1∶1)之间做进一
步优化。
2.2 响应面分析法优化结果与分析
2.2.1 响应面分析方案及结果 以液固比(A)、超声
提取温度(B)、超声提取时间(C)、提取溶剂种类
图 4 提取溶剂种类对叶绿素提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction solvent
on extraction yield of chlorophylls
(D)为自变量，叶绿素得率(Y)为响应值，根据 Box－
Behnken设计进行响应面分析实验，共 27 组，实验方
案及实验结果见表 2。
表 2 响应面分析方案及实验结果
Table 2 Program and experimental results of ＲSA
实验号 A B C D Y(%)
1 0 0 0 0 0.676
2 0 － 1 1 0 0.555
3 － 1 1 0 0 0.601
4 1 0 0 － 1 0.624
5 1 0 － 1 0 0.598
6 0 0 0 0 0.681
7 0 1 － 1 0 0.623
8 1 0 0 1 0.611
9 0 － 1 0 1 0.541
10 0 0 － 1 － 1 0.552
11 0 － 1 － 1 0 0.508
12 － 1 0 0 － 1 0.538
13 0 － 1 0 － 1 0.529
14 － 1 0 1 0 0.549
15 1 0 1 0 0.629
16 0 1 0 1 0.626
17 0 0 1 － 1 0.601
18 0 0 1 1 0.619
19 0 1 1 0 0.627
20 0 0 0 0 0.692
21 － 1 0 0 1 0.571
22 1 1 0 0 0.653
23 1 － 1 0 0 0.538
24 0 1 0 － 1 0.606
25 0 0 － 1 1 0.610
26 － 1 0 － 1 0 0.523
27 － 1 － 1 0 0 0.517
2.2.2 方差分析结果 通过 Minitab15.0 软件对表 2
数据进行多元回归拟合，得到编码空间的超声波提
取野葛叶叶绿素的回归方程为:
Y = 0.68300 + 0.029500A + 0.045667B +
0.013833C － 0.010667D － 0.053708A2 － 0.057208B2 －
0.048458C2 －0.044208D2 + 0.007750AB + 0.001250AC
+0.011500AD－0.010750BC－0.002000BD +0.010000CD
205
从该模型方差分析表 3 可知，本实验所选用的
二次多项模型具有高度的显著性(p ＜ 0.0001)［19］。
失拟项在 α = 0.05 水平上不显著(p = 0.277 ＞ 0.05) ，
其决定系数为 Ｒ2 = 0.9701，校正决定系数为 0.9352，
说明该模型能解释 93.52%响应值的变化，拟合情况
较好，用该模型对超声波提取野葛叶叶绿素的技术
进行优化是合适的。
表 3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variances for the fitted regression model
来源 自由度 平方和 均方 F值 p
回归 14 0.069202 0.004943 27.78 0.000
线性 4 0.039130 0.009783 54.99 0.000
平方 4 0.028418 0.007105 39.93 0.000
交互作用 6 0.001654 0.000276 1.55 0.244
残差误差 12 0.002135 0.000178
失拟 10 0.002001 0.000200 2.99 0.277
纯误差 2 0.000134 0.000067
合计 26 0.071337 Ｒ2 = 0.9701 Ｒ2Adj = 0.9352
注:差异显著(p ＜ 0.05) ;差异极显著(p ＜ 0.01) ，表 4 同。
对方程的回归系数显著性分析(表 4)表明，实验
中常量、A、B、C、A2、B2、C2、D2 项为极显著影响因素，
D项为显著影响因素，表明在超声波提取野葛叶叶
绿素的过程中，液固比、超声提取温度、超声提取时
间及提取溶剂种类均会对叶绿素得率产生显著影
响;其中 A2、B2、C2、D2 的影响极显著，说明在叶绿素
提取过程中液固比、超声提取温度、超声提取时间和
提取溶剂种类对于叶绿素得率的影响是非线性的。
AB、AC、AD、BC、BD、CD 为不显著项，说明四因素彼
此间的交互作用不明显。
表 4 回归系数显著性分析
Table 4 Significance test each regression coefficient
of the fitted regression model
项 系数 系数标准误 T p
常量 0.683000 0.007701 88.693 0.000
A 0.029500 0.003850 7.662 0.000
B 0.045667 0.003850 11.860 0.000
C 0.013833 0.003850 3.593 0.004
D － 0.010667 0.003850 － 2.770 0.017
A2 － 0.053708 0.005776 － 9.299 0.000
B2 － 0.057208 0.005776 － 9.905 0.000
C2 － 0.048458 0.005776 － 8.390 0.000
D2 － 0.044208 0.005776 － 7.654 0.000
AB 0.007750 0.006669 1.162 0.268
AC 0.001250 0.006669 0.187 0.854
AD 0.011500 0.006669 1.724 0.110
BC － 0.010750 0.006669 － 1.612 0.133
BD － 0.002000 0.006669 － 0.300 0.769
CD 0.010000 0.006669 1.499 0.160
2.2.3 响应面分析与优化 图 5～图 10 为通过上述
二次多项回归方程所作的各因素的响应面图。由图
5～图 10 可以分析出任意两因素对叶绿素得率的交
互影响，并能确定最佳因素水平范围。当固定两个
因素时，另外两个因素均做“0”水平处理。从响应面
的三维图可以看出，响应面的最高点即为在所选范
围内的极值。
由图 5～图 10 可知，A、B对叶绿素得率影响极显
著，表现为曲面较陡;C、D 对叶绿素得率影响显著，
表现为曲面较平滑，这与回归分析的结果一致。
液固比和超声提取温度的交互作用对叶绿素得
率的影响由图 5所示，液固比在 100∶1～120∶1(mL·g －1)
之间，超声提取温度在 50～60℃之间时，叶绿素得率
存在最大值。液固比和超声提取时间的交互作用对
叶绿素得率的影响由图 6 所示，液固比在 100 ∶ 1 ～
120∶1(mL·g －1)之间，超声提取时间在 30～40min 之
间时，叶绿素得率存在最大值。液固比和提取溶剂
种类的交互作用对叶绿素得率的影响由图 7 所示，
液固比在 100∶1～120∶1(mL·g －1)之间，提取溶剂种类
在乙醇∶丙酮为 1∶1～2 ∶1 之间时，叶绿素得率存在最
大值。超声提取温度和超声提取时间的交互作用对
叶绿素得率的影响由图 8 所示，超声提取温度在
50～60℃之间，超声提取时间在 30～40min 之间时，叶
绿素得率存在最大值。超声提取温度和提取溶剂种
类的交互作用对叶绿素得率的影响由图 9 所示，超
声提取温度在 50 ～ 60℃之间，提取溶剂种类在乙
醇∶丙酮为 1∶1～2∶1 之间时，叶绿素得率存在最大值。
超声提取时间和提取溶剂种类的交互作用对叶绿素
得率的影响由图 10 所示，超声提取时间在 30～40min
之间，提取溶剂种类在乙醇∶丙酮为 1∶1～2∶1 之间时，
叶绿素得率存在最大值。由此可以看出，四个因素
各自都存在极值，这与单因素实验结果一致，并且对
叶绿素得率具有显著性，它们的变化都是非线性的，
都不受其他因素的影响，这与回归分析结果一致。
图 5 A与 B的响应面
Fig.5 Ｒesponse surface of A and B
图 6 A与 C的响应面
Fig.6 Ｒesponse surface of A and C
206
图 7 A与 D的响应面
Fig.7 Ｒesponse surface of A and D
图 8 B与 C的响应面
Fig.8 Ｒesponse surface of B and C
图 9 B与 D的响应面
Fig.9 Ｒesponse surface of B and D
图 10 C与 D的响应面
Fig.10 Ｒesponse surface of C and D
2.2.4 野葛叶中叶绿素提取工艺的确定与验证 根
据 Box－Behnken实验所得的结果和二次多项回归方
程，利用 Minitab15.0 软件获得的野葛叶叶绿素提取
的最佳条件为:液固比为 105.859 ∶1(mL·g －1)、超声
提取温度为 54.141℃、超声波提取时间为 30.909min、
提取溶剂种类为乙醇 ∶丙酮(1.909 ∶1)。在上述条件
下，野葛叶中叶绿素得率预测值为 0.698%。为了检
测模型预测的准确性，在最佳提取条件下进行提取，
考虑到操作的可行性，实际提取条件为:液固比106∶1
(mL·g －1)、超声提取温度 54℃、超声提取时间
31min、提取溶剂种类乙醇∶丙酮(1.9∶1)。
进一步对上述优化条件进行了 3 次验证实验，
所得野葛叶叶绿素得率结果分别为 0.695%、
0.689%、0.690%，平均值为 0.691%，与预测值较为接
近，证明该模型能较好地预测野葛叶中叶绿素的实
际提取效果。
3 结论
本研究在单因素实验的基础上，运用 Box －
Behnken响应面设计确定并优化得到野葛叶中叶绿
素的超声波提取工艺为:液固比 106∶1(mL·g －1)、超
声提取温度 54℃、超声提取时间 31min、提取溶剂种
类乙醇∶丙酮(1.9∶1)。在此条件下，叶绿素得率可达
到 0.691%。实验证明，响应面分析法可以有效地优
化野葛叶中叶绿素提取的工艺条件，这一结果为进
一步分离纯化野葛叶中的叶绿素提供了参考依据。
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［(NH4)2 SO4］双水相体系对大豆中脂肪氧合酶的萃
取分离进行了研究。综合考察酶分配系数、相比和
萃取率，探讨了(NH4)2 SO4、PEG2000、NaCl浓度以及
pH对脂肪氧合酶萃取的影响，并通过正交实验进一
步优化实验条件，结果表明，单一因素下的最佳工艺
条件 为:(NH4 )2 SO4 15%、PEG2000 13%、NaCl
1.0%、pH5.8;正交实验和验证实验优选出的最佳工
艺条件为:(NH4)2 SO4 17%、PEG2000 13%、pH5.2，此
条件下获得酶的分配系数为 9.710，萃取率为 87.6%。
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