全 文 ：葎草多糖的提取分离及组成性质研究＊
屠婕红　陈伟光　盛　静　敖　雷
　屠婕红 ,女 ,副教授
＊嘉兴市科技局基金资助项目(No.2005AY3042)
(浙江省嘉兴学院医学院　浙江 314001)
摘要:目的　从葎草中提取分离多糖成分 ,并研究其组成性质和分子量。方法　经水提醇沉 、脱蛋
白后的粗多糖 ,采用 SephadexG-100和 SepharoseCL-4B柱色谱分离及纯度鉴定 ,薄层色谱法和气
相色谱法测定多糖组成 ,凝胶色谱法测定相对分子质量。结果　从葎草水溶性多糖提取物中分离
得到 3种均一多糖(HSP-1、HSP-2、HSP-3),其中 HSP-1的单糖组成为核糖 、阿拉伯糖 、木糖 、甘露
糖 、葡萄糖和半乳糖 ,它们的摩尔比为 0.35∶0.32∶0.13∶0.13∶0.29∶1.00, HSP-1的平均分子质量为
4.3×104。结论　HSP-1为葎草多糖的主要成分 ,首次从葎草全草中提取获得 。
关键词:葎草;多糖 ;提取分离;组成性质;薄层色谱;气相色谱
中图分类号:R284.2
Extraction, separation, compositionandpropertiesofpolysaccharide
fromHumulusscandens＊
TUJie-hong, CHENWei-guang, SHENGJing, AOLei
(MedicalSchool, JiaxingColege, Zhejiang　314001)
Abstract:Objective　ToextractandseparatethecompositionofpolysaccharidefromHumulus
scandens, andstudyitscomposition, propertiesandmolecularweight.Methods　 Thecrude
polysaccharide, afterthewaterextracting-alcoholprecipitationanddeproteinization, wasseparated
andpurifiedbyusingthechromatographiccolumnsofSephadexG-100 andSepharoseCL-4B
respectively.Thecomponentsofpolysaccharideweredeterminedbyusingthinlayerchromatography
(TLC)andgaschromatography(GC).Therelativemolecularweightofpolysaccharidewas
determinedbyusing gelchromatography.Results　 Therewere 3 kindsofhomogeneous
polysaccharides(HSP-1 , HSP-2 and HSP-3) separatedfrom theextractofwatersoluble
polysaccharideofHumulusscandens, amongwhichthemonosaccharideofHSP-1consistedofribose,
arabinose, xylose, mannose, glucoseandgalactosewiththemolarratiobeing0.35∶0.32∶0.13∶
0.13∶0.29∶1.00.TheaveragemolecularweightofHSP-1was4.3×104.Conclusion　HSP-1 is
themaincomponentofpolysaccharideofHumulusscandens, whichisextractedfromwholeHumulus
scandensforthefirsttime.
Keywords:Humulusscandens;polysaccharide;extractionandseparation;componentsandproperties;
thinlayerchromatography;gaschromatography
　　葎草又名拉拉秧 , 为桑科植物葎草 Humulus
scandens(Lour.)Merr.的干燥全草 ,具有清热解毒 、
利尿消瘀等功效 [ 1] ,它资源丰富 ,生命力旺盛 ,在我
国南北各地均有分布和生长 ,是农田和园林绿化中
的重要杂草 ,可能含有抗衰老成分 ,若能合理开发利
用 ,将会变废为宝 。针对葎草活性成分的研究少有
文献报道 ,而多糖又是中药中抗衰老 、增强免疫力的
主要活性成分 ,本文对葎草中水溶性多糖成分进行
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第 31卷第 8期 2008年 8月
Vol.31 No.8 Aug.2008　 　
北京中医药大学学报
JournalofBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine
了提取分离 ,并对其主要多糖成分的组成性质作了
分析研究 ,为进一步开发利用葎草多糖奠定了基础 。
1　材料
1.1　仪器
气相色谱仪(岛津 14C型 ,日本岛津公司),紫
外分光光度计(UV-2401PC,日本岛津公司),自动收
集仪 (BSZ-100 , 上海沪西分析仪器厂 ), 离心机
(0412-1,上海手术器械厂),中药粉碎机(RT-08,上
海淀久中药机械制造有限公司),旋转蒸发仪(RE-
52AA,上海医疗器械厂),真空干燥器(DZF-1B型 ,
上海跃进医疗器械厂),自动旋光仪(WBE-2A,上海
精密科学仪器有限公司),电子分析天平(BC-210S,
北京赛多利斯仪器有限公司),黏度计(NDJ-9S,上
海精密仪器仪表有限公司),高效薄层色谱硅胶预
制板(天津药典标准仪器厂)。
1.2　药材与试剂
实验用葎草 Humulusscandens(Lour.)Merr.采
自浙江省嘉兴学院梁林校区内 ,由嘉兴学院生药教
研室陈伟光副教授鉴定 ,全草于阴凉处用风扇吹干 ,
粉碎过 40目筛备用。 SephadexG-100, Sepharose
CL-4B,葡聚糖标准品 (DextranT-500、T-70、T-40、
T-10)和蓝色葡聚糖 2000均为 Pharmacia公司产品;
核糖等 7种单糖对照品(进口分装 ,上海化学试剂
公司);其他试剂均为国产分析纯。
2　方法
2.1　多糖提取的正交试验
称取葎草干燥粉末 10 g,用 95%乙醇浸泡脱
脂 ,药渣以蒸馏水为提取溶剂 , 分别以提取时间
(A)、提取温度(B)、提取次数(C)和液固比(D)为
影响因素 ,按 L9(34)正交设计方案进行试验 。提取
完成后进行过滤 ,合并滤液 , 60 ℃减压浓缩至原来
体积的 1/4 ,浓缩液加 4倍量的乙醇 ,冰箱放置24h,
抽滤 ,收集多糖沉淀 ,减压干燥 ,计算提取率 。每一
试验平行操作 2次 ,取平均值进行正交试验结果分
析 ,找出最佳提取条件 。见表 1。
表 1　L9(34)正交设计因素水平表
水平 因素A/h B/℃ C/次 D/倍
1 0.5 70 1 5
2 1.0 80 2 10
3 1.5 90 3 15
2.2　多糖的纯化与柱色谱分离
称取葎草干燥粉末 500g,用 95%乙醇浸泡脱脂 ,
按正交法确定的最佳工艺条件进行葎草多糖提取的
放大实验 ,得到的提取溶液 ,用 Sevag法去蛋白[ 2] ,离
心除去胶状沉淀(重复 8次),至紫外测定在 260、
280nm处无蛋白质和核酸吸收峰 ,上清液对蒸馏水透
析 2d, 60 ℃减压浓缩至原来体积的 1/4,浓缩液加
4倍量 95%乙醇使多糖沉淀析出 ,抽滤 ,沉淀用无水
乙醇 、丙酮反复洗涤 , 减压干燥 , 得葎草粗多糖
(PolysaccharideofHumulusscandens, HSP)。称取上
述葎草多糖 100 mg,加蒸馏水溶解 ,上 SephadexG-
100柱(2.5cm×60cm)进行色谱分离 ,蒸馏水洗脱 ,
控制流速 0.25 mL/min,自动部分收集器 5mL/管收
集 ,以改良的硫酸 -苯酚法[ 3]跟踪检测 ,根据洗脱曲
线收集 、合并含糖部分 ,浓缩 ,减压干燥 ,即得。
2.3　纯度鉴定
在凝胶色谱柱 SepharoseCL-4B(2.5 cm×
60 cm)上 ,以 1%NaCl洗脱 ,流速 10 mL/h,用改良
的苯酚 -硫酸法跟踪检测 ,根据洗脱曲线收集 、合并
含糖部分 ,绘制色谱图谱 ,观察结果。
2.4　相对分子质量测定
参照文献 [ 4]的方法 ,采用凝胶色谱法 。取 0.1
mol/LNaCl溶液充分溶胀的 SepharoseCL-4B装柱
(1.7mm×90 cm), 用 0.1 mol/LNaCl溶液平衡
3d,先后将已知分子量的葡聚糖标准品 (T-500, T-
70, T-40, T-10)配制成 0.5%溶液 ,进行凝胶色谱 ,
上样量各 2 mL,用 0.1 mol/LNaCl溶液洗脱 ,流速
为 6mL/h,按 1mL/管分部收集 ,用改良的苯酚 -硫
酸法检测多糖 ,分别求得相应的洗脱体积(Ve)。再
用蓝色葡聚糖 2000上柱求得柱的外水体积(Vo),
以 Ve/Vo为纵坐标 , lgM为横坐标 ,得到分子量测定
标准曲线 。相同浓度待测样品于同条件上柱 ,求得
Ve/Vo值 ,查标准曲线计算相对分子质量 。
2.5　多糖的单糖组成分析
2.5.1　样品完全酸水解:取 20mg葎草多糖的干燥
样品 ,加入 2.0mol/L的硫酸溶液 5 mL,置 120℃烘
箱中封管水解 4 h,取出冷却后加碳酸钡中和至 pH
7 ～ 8, 3 000 r/min离心除去硫酸钡沉淀 ,上清液减
压蒸发至干 ,获得多糖水解物 ,备用。
2.5.2　硅胶薄层色谱法:参照文献 [ 5]的方法取少
量上述水解产物 ,加蒸馏水溶解 ,同时取各种标准单
糖配成水溶液 ,分别点样于同一预制硅胶 G薄层板
上 ,以乙酸乙酯 -甲醇 -乙酸 -水(13∶3∶3∶3)为展
开剂 ,苯胺 -邻苯二甲酸喷雾显色 , 110 ℃烘烤
10 min至显色清晰 。
2.5.3　气相色谱法:精密称取 10 mg水解产物 ,加
·562· 北京中医药大学学报　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　第 31卷
入 20mg盐酸羟胺 , 2 mL吡啶 ,置 90 ℃水浴中加热
反应 30 min并振荡 ,取出后冷至室温 ,加入 2 mL醋
酸酐 ,在 90℃下继续反应 30 min进行酰化 ,生成具
有挥发性的糖腈乙酸酯 ,反应物于旋转蒸发仪中减
压蒸干 ,残渣加入 2 mL氯仿溶解 ,过滤。同法制备
各种标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物 ,分别进行气相
色谱分析。
气相色谱条件:SE-30弹性石英毛细管柱
(0.32 mm×30 m);柱温 100 ℃保持 5 min, 5 ℃/
min程序升温至 230 ℃,维持 30 min;检测器(FID)
和进样口温度均为 270 ℃;载气为 N2 , 40 kPa。
2.5.4　组成单糖的摩尔比测定:以 L-阿拉伯糖为
内标测定组成多糖的单糖的定量校正因子 。精确称
取组成多糖的单糖标准物 ,使标准物与内标的质量
之比在 0.3 ～ 2.5之间的 5个不同浓度 ,按 2.5.3的
方法进行气相色谱分析。以标准糖和内标的峰面积
之比作为横坐标 ,标准糖和内标的质量之比作为纵
坐标求得它们的斜率 ,即为该种标准糖的定量校正
因子 f(Wi/WsAi/As)。
多糖组成中单糖的摩尔比测定条件与测定定量
校正因子的条件相同。以 L-阿拉伯糖为内标 ,测定
各单糖残基的峰面积 ,乘以 f/M(f:该单糖的定量校
正因子 , M:该单糖的分子质量)所得的值即为该种
单糖的摩尔比值 。
3　结果
3.1　正交试验结果
以葎草多糖的提取率为指标 ,正交试验的实验
结果见表 2。
表 2　正交设计结果分析
实验号 因素A/h B/℃ C/次 D/倍 提取率 /%
1 0.5 70 1 10 2.37
2 0.5 80 2 20 4.48
3 0.5 90 3 30 6.78
4 1.0 70 2 30 5.26
5 1.0 80 3 10 8.75
6 1.0 90 1 20 4.02
7 1.5 70 3 20 7.43
8 1.5 80 1 30 3.75
9 1.5 90 2 10 3.74
K
1 13.6 15.1 10.1 14.9K2 18.0 17.0 13.5 15.9K3 14.9 14.5 22.7 15.8K1平均 4.5 5.0 3.4 5.0K2平均 6.0 5.7 4.5 5.3K3平均 5.0 4.8 7.6 5.3R 1.5 0.9 4.2 0.3
　　由表 2结果显示:C因素对应的极差 R最大 ,其
次是 A因素 ,此两因素为影响葎草多糖提取率的主
要因素;B因素和 D因素影响较小 ,各因素对提取效
果的影响大小顺序是:提取次数 (C)>提取时间
(A)>提取温度(B)>液固比(D),各因素的最佳
水平为:A2, B2, C3, D2。即葎草多糖的最佳提取工
艺条件为:用 10倍量水 ,在 80 ℃水浴中加热提取 3
次 ,每次 1 h。
3.2　葎草多糖的提取结果
500 g葎草干燥粉末经水提醇沉 , 8次 Sevag试
剂脱蛋白处理 ,得到葎草粗多糖(HSP)6.09 g,得率
为 1.218%。进一步上 SephadexG-100柱分离 ,得
到 HSP-1、HSP-2和 HSP-3三种多糖成分 , 其中
HSP-1含量最高 ,约占多糖量的 4/5。 HSP-1为浅棕
色粉末状固体 ,易溶于水 ,不溶于乙醇 、丙酮 、乙醚等
有机溶剂 ,与苯酚 -硫酸试剂 、蒽酮 -硫酸试剂反应
为阳性 , 与 I2 -KI反应为阴性 , 特性黏度 [ η] =
193.6mL/g,比旋度 [ α] 20D (H2O)为 +153.8(c=
0.8)。紫外光谱测试表明 ,在 260、280nm处无吸收
峰 ,说明样品 HSP-1中不含蛋白质 、核酸类物质。
经 SepharoseCL-4B柱色谱得到的洗脱曲线为单一
对称峰 ,表明 HSP-1为单一的杂多糖。
3.3　葎草多糖 HSP-1相对分子质量
由 Ve/Vo对标准分子量的对数关系得标准曲
线方程为:Ve/Vo=3.975 6 -0.418 7 lgM(r=
0.993 9), 根据 HSP-1的洗脱体积 171 mL, 求得
HSP-1的相对分子量为 4.3×104。
3.4　葎草多糖 HSP-1含有的单糖成分
HSP-1完全酸水解产物经硅胶薄层色谱表明主
要含有葡萄糖 、半乳糖 、阿拉伯糖 、甘露糖和核糖 5
种单糖成分。
图 1为标准单糖糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱
图 ,按出峰先后依此为鼠李糖 (26.076 min)、核糖
(26.665 min)、阿拉伯糖 (27.332 min)、木糖
(27.732 min)、甘露糖 (35.732 min)、葡萄糖
(36.158min)和半乳糖(37.198 min)。 HSP-1完全
水解物糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱分析 (见图
2),结果显示 6个吸收峰(26.618 min、27.232 min、
27.665min、35.698 min、36.065 min、37.121 min),
比较上述两张图谱 ,表明 HSP-1含有核糖 、阿拉伯
糖 、木糖 、甘露糖 、葡萄糖和半乳糖。薄层色谱和气
相色谱比较未能显示木糖 ,可能是木糖含量较低的
缘故 。
各种单糖的校正因子分别为:f核糖 =1.007,
·563·第 8期 屠婕红等　葎草多糖的提取分离及组成性质研究
1鼠李糖　2核糖　3阿拉伯糖
4木糖　5甘露糖　6葡萄糖　7半乳糖
图 1　标准单糖的气相色谱图
2核糖　3阿拉伯糖　4木糖　5甘露糖
6葡萄糖　7半乳糖
图 2　水溶性多糖的气相色谱图
f阿拉伯糖 =1.000, f木糖 =1.004, f甘露糖 =0.998 , f葡萄糖 =
1.129, f半乳糖 =1.063。测得葎草多糖组成单糖的摩
尔比为核糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳
糖 =0.35∶0.32∶0.13∶0.13∶0.29∶1.00。
4　讨论
通过水提 、脱蛋白 、透析 、醇沉方法从葎草全草
中获得不含蛋白质 、核酸的葎草多糖粗品 ,得率为
1.218%,经凝胶色谱分离纯化得到的 HSP-1为葎草
多糖的主要成分 ,该多糖由核糖 、阿拉伯糖 、木糖 、甘
露糖 、葡萄糖和半乳糖组成。在葎草多糖提取过程
中 ,游离蛋白质也被提取出来 ,脱去游离蛋白质的方
法有 Sevag法 、三氯乙酸法等 ,本实验采用比较温和
的 Sevag法脱葎草多糖中的游离蛋白 ,以免影响多
糖的生物活性 。
利用凝胶色谱法测定分子量不需要复杂的仪器
设备 ,操作简便 ,样品用量少 ,但误差较大 ,测得的是
近似分子量;用薄层色谱法初步鉴定多糖中单糖的
组成 ,根据多糖组分不同 , 采用气相色谱法 , 选择
SE-30毛细管色谱柱 ,衍生化后 ,再进行测定 ,此法
鉴定单糖的组成 ,方便可靠 ,针对性强。多糖生物活
性多样 , 对 HSP-1的药理作用我们将进一步进行
研究 。
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(收稿日期:2008-01-11)
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⑤F检验用英文斜体大写 F;⑥卡方检验用希腊文斜体小写 χ2;⑦相关系数用英文斜体小写 r;⑧自由度用希
腊文斜体小写 γ;⑨样本用英文斜体小写 n;⑩概率用英文斜体大写 P。
·564· 北京中医药大学学报　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　第 31卷