全 文 ：网络出版时间:2015 － 11 － 24 11:00 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20151124． 1100． 034． html
葎草中黄酮类成分的分离鉴定及对小鼠肺水清除率的影响
陈再兴1，王 星1，祝 妍1，王 琳2，王 岩1，聂宏光3，孟繁浩2
(中国医科大学 1. 药学院中心实验室，2．药学院药物化学教研室，3．代谢病分子机制与药物研究所，辽宁 沈阳 110122)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2015． 12． 017
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2015)12 － 1715 － 04
中国图书分类号:R-332;R284． 1;R322． 35;R541． 63
摘要:目的 对葎草中主要黄酮类成分进行提取分离，并对
其结构进行鉴定;探讨葎草中黄酮类单体成分对小鼠肺水清
除率(AFC)的影响。方法 葎草乙醇提取后，除色素，柱分
离得单体成分，利用光谱法对其结构进行鉴定;通过气管给
药后，酶标仪测定肺内吸出液的小牛血清白蛋白浓度的方
法，计算木犀草苷(LGL)和大波斯菊苷(AGL)影响下的小鼠
在体 AFC。结果 葎草中的主要成分为木犀草苷和大波斯
菊苷;二者均能促进 AFC。结论 葎草中的主要成分均可降
低肺内的积水。
关键词:葎草;化学成分;木犀草苷;大波斯菊苷;肺水清除
率;肺水肿
收稿日期:2015 － 08 － 31，修回日期:2015 － 10 － 10
基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目(No 2014021038)
作者简介:陈再兴(1973 －) ，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方
向:中药药效物质基础及活性成分分析，E-mail:zaix-
ingchen@ sina． com;
孟繁浩(1964 －) ，男，博士，博士生导师，教授，研究方向:
药物合成及修饰，通讯作者，E-mail:fhmeng@ cmu． edu． cn
中药葎草为桑科植物葎草 Humulus scandens．
(Lour．)Merr． 的全草［1］。其味甘、苦，性寒。具有
清热解毒，利尿消肿之功效。文献记载用于肺结核
潮热、肠胃炎、痢疾、感冒发热、肾盂肾炎、急性肾炎、
膀胱炎、泌尿系结石;外用治痈疖肿毒、湿疹、毒蛇咬
伤等［2］。据报道葎草全草含黄酮、天门冬素、挥发
油、鞣质及树脂;葎草叶含大波斯菊苷等;果实中含
葎草酮、蛇麻酮等［3 － 4］。本试验对葎草中的黄酮类
化学成分进行提取分离，并对其主要成分进行了结
构鉴定，同时探讨了黄酮类成分对小鼠肺水清除率
(AFC)的影响。
1 葎草中主要化学成分的提取、分离与鉴定
1． 1 仪器与材料
1． 1． 1 仪器 RD-1 熔点测定仪(天津天光光学仪
器有限公司) ;制备液相(P270 高压恒流泵;UV230
+紫外 －可见检测器;大连依利特分析仪器有限公
司) ;Bruke-ARX-300 型核磁共振光谱仪(德国布鲁
克公司) ;LCQ 液 － 质联用仪(赛默飞世尔科技公
司)。
1． 1． 2 材料 色谱柱 Shim-pack C18(5 μm，250 ×
10 mm) ;柱色谱用硅胶(100 目，160 ～ 200 目)和薄
层色谱用硅胶 G(60 型)均系青岛海洋化工厂生产;
D101 大孔树脂为天津南开大学产品;HPLC 所用溶
剂均为色谱纯(山东禹王试剂有限公司生产) ;实验
所用其它试剂均为分析纯。
1． 2 药材 葎草采自沈阳北陵地区，经鉴定为桑科
(Moraceae)葎草属(Humulus)植物葎草 Humulus
scandens(Lour．)Merr． 的全草。标本保存在中国医
科大学药学院中心实验室。
1． 3 提取与分离
1． 3． 1 提取 取干燥葎草全草 10 kg，切碎后，第 1
次加 10 倍量 70%乙醇提取 2 h，第 2 次加 8 倍量
70%乙醇提取 1 h，第 3 次加 6 倍量 70%乙醇提取 1
h，合并提取液，回收乙醇至无醇味;加入氯仿萃取 3
次，每次 1 500 mL，弃去氯仿层，水层加热除去残留
氯仿。将上述水层溶液加入药用级 D101 树脂
(1 500 g)柱中，吸附 12 h，先用适量水冲洗，然后用
95%乙醇洗脱，洗脱液浓缩至干，备用。
1． 3． 2 分离 取上述提取物 120 g，甲醇溶解，加硅
胶(100 目)适量，研匀，挥干溶剂，备用;称取柱层析
用硅胶(160 ～ 200 目)1 200 g，湿法装柱上样后，用
氯仿 －甲醇不同比例进行梯度洗脱，结合薄层色谱
合并相同流份，然后用制备液相精制，在(100 ∶ 20 ～
30)比例的洗脱剂中得到单体化合物Ⅰ和化合物
Ⅱ，见 Fig 1。
1． 4 化合物结构鉴定
1． 4． 1 化合物Ⅰ 淡黄色结晶粉末，mp 258 ～
260℃。盐酸 － 镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳
性，提示为黄酮类化合物并有糖存在。ESI-MS 给出
m/z:449. 36［M + H］+的准分子离子峰，推测其分子
质量为 448，分子式为 C21 H20 O11。UV 图谱在 255
nm和 350 nm 有吸收峰，提示可能有黄酮类化合物
带Ⅰ、带Ⅱ的吸收峰存在;带Ⅱ存在肩峰，提示可能
在 B环 3，4位有 2 个 OH 存在。IR 在3 328 cm －1
有吸收峰，结合其峰型显示可能有分子内氢键存在，
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1 600 cm －1左右的吸收峰提示有 C = C 不饱合键存
在。1HNMR谱显示苷元部分有与木犀草素相似的质
子信号:δ6. 91(1H，d，J = 8. 4 Hz) ，7. 45(1H，d，J =
8. 4 Hz) ，7. 42(1H，s)是构成 AMX 偶合系统的 B
环的质子信号;δ6. 79(1H，d，J = 1. 8 Hz) ，6. 44
(1H，d，J = 1. 8 Hz)为 6，8 位质子信号;δ6. 75(1H，
s)为 3 位氢信号;δ12. 99，δ9. 99，δ9. 40 分别为 5，
4，3位羟基质子信号。13 CNMR 谱有 21 个碳信号，
δ182. 0 为羰基的碳信号;δ100. 0，77. 2，76. 5，
73. 2，69. 6，60. 7 为糖的碳信号。经与文献对
照［4 － 5］，确定该化合物为木犀草苷(luteolin-7-O-β-
D-glucoside) ，结构见 Fig 1A。
1． 4． 2 化合物Ⅱ 淡黄色结晶粉末，mp 227 ～
229℃。盐酸 － 镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳
性，提示为黄酮类化合物并有糖存在。ESI-MS 给出
m/z:433. 25［M + H］+的准分子离子峰，推测其分子
量为 432，分子式为 C21H20O10。UV 图谱在 268 nm
和 335 nm有吸收峰，提示可能有黄酮类化合物带
Ⅰ、带Ⅱ的吸收峰存在;带Ⅱ为单峰，提示可能在 B
环 4位有 OH 存在。IR 在3 190 cm －1有吸收峰，结
合其峰型显示可能有分子内氢键存在，1 600 cm －1
左右的吸收峰提示有 C = C 不饱合键存在。1HNMR
(DMSO － d6)谱中，δ12. 96(1H，s)为黄酮 5 位羟基
的质子信号;δ7. 96(2H，d，J = 8. 4 Hz) ，6. 94(2H，
d，J = 8. 4 Hz) (AABB系统)两组双重峰，为 4位有
取代的 B 环上的 4 个质子信号;δ6. 87(1H，s) ，
6. 45(1H，s)为 6-H和 8-H 信号;δ6. 83(1H，s)为 3-
H的信号;δ5. 40 ～ 4. 61 为糖区质子信号。13 CNMR
(DMSO － d6)谱有 19 个碳信号，B 环上有两个重叠
的碳信号;δ116. 1 归属为 B 环上 C-3，5的信号;
δ128. 7 归属为 B环上 C-2，6的信号;δ182. 1 为羰
基的碳信号;δ100. 0，77. 3，76. 5，73. 2，69. 6，
60. 7 为糖的碳信号。经与文献对照［5 － 6］，确定该化
合物为大波斯菊苷(cosmosiin) ，结构见 Fig 1B。
2 葎草中黄酮类成分对小鼠肺水清除率的影响
2． 1 材料 健康♂昆明小鼠由中国医科大学实验
动物中心提供，动物合格证号:SCXK(辽)2008-
0005。鼠龄 8 ～ 10 周，体质量 20 ～ 30 g，按试验设计
分组，每组 10 只。LGL和 AGL均为实验室自制(高
效液相归一化法测定 LGL 和 AGL 纯度均 ＞ 98%) ;
小牛血清白蛋白(BSA，Sigma 公司) ，阿米洛利
(Amiloride，Sigma 公司) ，特布他林(Terbutaline，
Sigma公司) ;生理盐水，G250，水合氯醛，氧气等。
2． 2 试验过程 各组别药物均采用等渗 5%小牛
血清白蛋白生理盐水溶液配制。动物分组见Tab 1，
Fig 1 A． Luteolin-7-O-β-D-glucoside;B． Cosmosiin
小鼠腹腔麻醉(按 300 mg·kg －1的剂量给予 10%水
合氯醛)后，钝性分离气管，插管后，经三通阀通入
氧气。随后经插管处三通阀注入各组别溶液 0. 3
ml。通过小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)
给予麻醉小鼠 100% O2，通气 30 min，然后用 1 ml
注射器经气管插管缓慢负压吸取肺泡内液体［7 － 8］。
溶液中白蛋白量的测定，以空白溶液作为参照，通过
全自动定量酶标仪测出，按下面的公式计算 AFC。
Tab 1 Test groups
Group Drug
Blank group －
Control group 1 mol·L －1 Amiloride
0． 1 mol·L －1 Terbutaline
Test group 0． 2 mol·L －1 LGL
0． 2 mol·L －1 AGL
0． 2 mol·L －1 LGL + 1 mol·L －1 Amiloride
0． 2 mol·L －1 AGL + 1 mol·L －1 Amiloride
2． 3 AFC计算 AFC =［(Vi － Vf)/Vi］× 100，Vf =
Vi × Pi /Pf 式中 Vi 和 Vf 分别代表起始注入肺泡内
(i)和灌注 30 min 后吸出的肺泡液(f)液体体积，P
是白蛋白浓度。
2． 4 统计学处理 数据结果以 珋x ± s 表示，数据比
较采用单因素方差分析。
3 结果
3． 1 葎草中主要化学成分的提取、分离与鉴定 葎
草醇提液浓缩后，氯仿萃除叶绿素，采用药用级
D101 树脂吸附，洗脱后得到 120 g 的吸附物(采用
高效液相归一化法测定，其中包含 50. 6%木犀草苷
和 30. 2%大波斯菊苷) ，约占药材 1. 2%。上硅胶柱
分离，并精制后，得到单体化合物。利用波谱解析结
构，与文献数据核对后确定其中 2 种成分为木犀草
苷和大波斯菊苷。
3． 2 葎草中黄酮类成分对小鼠肺水清除率的影响
通过小鼠 AFC 试验，测定得出 7 个不同组别的
AFC，结果见 Tab 2。
·6171· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Dec;31(12)
Tab 2 Determination results of alveolar
fluid clearance(AFC，珋x ± s，n = 10)
Group AFC /%
Blank group 29． 1 ± 4． 6
Amiloride group 20． 5 ± 4． 1*
Terbutaline group 39． 2 ± 4． 8*
LGL group 33． 6 ± 3． 1*
LGL + Amiloride group 28． 0 ± 2． 6#
AGL group 32． 8 ± 3． 0*
AGL + Amiloride group 28． 5 ± 3． 2#
* P ＜ 0. 05 vs blank control group;#P ＜ 0. 05 vs LGL or AGL group
4 讨论
4． 1 黄酮类成分的提取、分离和鉴定 本实验主要
针对葎草中的黄酮类成分进行提取分离研究。70%
乙醇提取后用氯仿淬去叶绿素，然后用大孔吸附树
脂对黄酮类成分进行吸附，吸附物上硅胶柱分离，在
氯仿 ∶ 甲醇(100 ∶ 20 ～ 30)比例的洗脱剂中得到 4
种化合物，制备液相精制后，光谱鉴定为尿嘧啶、木
犀草苷、大波斯菊苷和牡荆素。其中木犀草苷和大
波斯菊苷含量最高，对其药效学进行了初步研究。
本方法综合了以往文献报道的方法，既采用树脂吸
附，又通过硅胶柱层析分离，大大提高了单体成分的
纯度，利于后面的精制过程。
4． 2 肺水清除率试验 阿米洛利作为上皮细胞钠
通道的阻断剂给予后，明显降低正常组小鼠的肺水
清除率;而特布他林作为促进钠通道的激动剂，能够
增加正常组小鼠的肺水清除率。LGL 和 AGL 试验
组均能促近小鼠肺泡对水的重吸收，与空白组相比
差异有显著性，而当两组中分别加入阿米洛利后又
使肺水清除率降低，说明二者可能是通过促进钠通
道开放的机制完成水分的重吸收，试验模式及结果
推论见 Fig 2。
4． 3 肺水肿治疗设想 以往肺水肿治疗遵循 Star-
ling定律，属被动转运机制，静力因素在肺水肿的形
成和消散过程中起重要作用。心源性肺水肿常规的
药物治疗包括利尿药(呋塞米静脉注射) ，血管扩张
药(硝酸甘油或硝普钠静脉泵入) ，正性肌力药(毛
花苷丙稀释后静脉注射) ，升压药(多巴胺静脉泵
入)和吗啡等。非心源性肺水肿病人对常规使用的
治疗药物反应的效果欠佳。急性肺水肿往往需要气
管插管和机械通气。
因通过上皮细胞钠通道(ENaC)能主动重吸收
肺泡内的水分，动力主要来源于底膜侧的 Na +，K + -
ATP酶，本试验中 AGL和 LGL能增强 ENaC 主动转
运功能，使钠通道由基态变成激发态，使肺泡内水液
主动重吸收回到体循环，增强肺泡通气与换气功能，
改变了以往肺水被动吸收的方式，为肺水肿开辟了
新的治疗方式，模式图见 Fig 3。
Fig 2 Mode patterning of test design and results
* P ＜ 0. 05 vs blank control group
·7171·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Dec;31(12)
Fig 3 Model of alveolar fluid clearance(AFC)
(致谢:本试验在药学院中心实验室完成，对参与药物提
取等工作的王星晧、牛兴、刘文姝等同学一并表示感谢!)
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Separation and identification of flavonoid constituent in
Humulus Scandens and their effects on alveolar fluid clearance in mice
CHEN Zai-xing1，WANG Xing1，ZHU Yan1，WANG Lin2，WANG Yan1，NIE Hong-guang3，MENG Fan-hao2
(1． Central Laboratory School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China;
2． Dept of Medicinal Chemistry School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China;
3． Institute of Metabolic Disease Research and Drug Development，China Medical University，Shenyang 110122，China)
Abstract:Aims To extract，separate and identify the
flavonoid constituents in Humulus Scandens and to ex-
plore the relationship of monomers and alveolar fluid
clearance (AFC)in mice in vivo． Methods Humulus
scandens were extracted with alcohol and then isolated
by the technology of Column and the structures were i-
dentified by spectrometry． In vivo AFC was measured
using bovine serum albumin protein assays affected by
luteolin-7-O-β-D-glucoside (LGL ) and cosmsiin
(AGL)． Results The main constituents of flavanones
in Humulus scandens were LGL and AGL． Both of them
could improve the AFC． Conclusion The AFCs of
LGL and AGL，compared to the blank control group，
increased which explains the effect of flavonoid constit-
uents on removing edema and promoting water absorp-
tion．
Key words:Humulus Scandens;chemical constituent;
luteolin-7-O-β-D-glucoside; cosmsiin; alveolar fluid
clearance (AFC) ;pulmonary edema
·8171· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Dec;31(12)