全 文 ：第 2 3卷
9 9 1 3年
第 2期
5 月
植 物 病 理 学 报
AC T A PH YT O P AT H O O G I C L人 S I NI C A
V 0 1
。
M
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2 3N
o
19 9 3
放射土壤杆菌 Ml l s菌株生物防治葡萄根癌病的研究’
谢学梅 游积峰 陈培 民 郭俊梅
(内蒙古园艺科学研究所 )
提要 从内蒙古玫瑰香葡萄冠瘦中分离到一株无致病力的土壤杆菌 Ml l s菌株 , 经鉴定为放射土壤
杆菌 ( A g r o b a e t e r i 、 , m r a d i o b a e t e r ) , 属生物 I 型 。 在平皿培养产生的土壤杆菌素 , 能抑制
葡萄根癌土壤杆菌生物 I 型菌株的生长 , 在温室向日葵幼苗和葡萄嫩枝上接种 , M 115 菌株 能 显
著地抑制多株不同类型甫萄根癌土壤杆菌诱导形成冠瘦瘤 。 在琼脂糖凝胶电泳图谱上 , M 11 5菌株
有一条质粒带 , 与生物 I型根癌土茸杆菌 C 58 菌株的质粒情况基本相同 。 研究还表明该菌株能在
葡萄上存活定殖 。
植物根癌病 (又称冠瘦病 ) , 由根癌土壤杆菌 ( A . ut m e f ac ien s ) 侵染引起的一种常见
植物细菌性肿瘤病害 , 世界各地均有发生 。 近年来调查 , 在我国葡萄 、 桃 、 李 、 梨 、 苹果 、
板菜 、 毛白杨 、 啤酒花 、 甜菜、 月季 、 樱花和沙棘等重要经济作物上均有此病发生 , 尤以葡
萄根癌病发生较普遍而严重 , 发病率有的高达 1 0 % , 甚至死 亡 、 毁园 〔 ” 。
世界许多国家对根癌病的防治进行了长期研究 , 未能取得理想的防治方法 , 直到 19 7 2年
澳大利亚 K e r r等研究报道用放射土壤杆菌 K 84 菌株 , 成功地对核果类果树根癌病进行了生物
防治 〔 2 ’ 。但K 84 只对含胭脂碱型 T i质粒的生物 I 型和 l 型根癌菌有抑制作用 , 它不能抑制含
章鱼碱 T i质粒的根癌菌 , 对生物 l 型根癌菌引起的葡萄根癌病无防治作用 〔 3 ’ 。 因此 , 近 年
来 , 一些国家都研究寻找类似 K 84 那样的放射土壤杆菌菌株 , 企求成功地生物防治 葡萄 根癌
病。 美国p a n a g o p o u l o s ( 1 9 7 5 ) , 南 非 H e n d s o n ( 19 8 3 ) 和 、V e b s t e r ( 1 9 5 6 ) , 分别 从 土
壤 、 按树和李子树冠瘦中分离出一些产细菌素的菌株 , 但在生物防治葡萄根癌病试验中均未
获得成功 。 我国陈晓英等 C们 ( 1 9 8 6 ) 、 梁亚杰等 ( ` ’ ( 1 9 9 0 ) 报道从啤酒花和葡萄冠瘦中 分
离出放射土壤杆菌 H L B一 2和 E 26 菌株 , 产生的细菌素能抑制葡萄根癌菌生长和致 瘤 。 笔 者
从内蒙古玫瑰香葡萄冠瘦中分离到无致病力的对葡萄根癌土壤杆菌生物 ! 型菌株有抑制作用
的放射土壤杆菌 M l ls 菌株 。 本文报道该菌株的分离鉴定及其生物防治试验的结果 。
材料与方法
(一 ) , 株。放射土壤杆菌 M 11 5, 19 8 6年 8月本组从葡萄上分离 : H L B一 2 , 中国科学院微生物所陈晓
英提供 , K 8 4 , 中国科学院微生物所马德钦提供。 实验所用根癌土壤杆菌见表 l 。
(二 ) 培养基。 常规培养基 P D A 、 N人 、 Y E M 、 Y E B 〔 “ 〕 , MW 〔 7 〕培养基用于分离菌株和测定土壤杆
菌素的产生。
(三 ) 土滚杆 , 生物型的鉴定 。基本按 K e r r和 p a n ag o p o lu os 〔 “ 〕所用的性状和方法 。
(四 ) 根启土滚杆菌对土峨杯 , 紊 M l l s 、 H L B一 2、 K 84 敏感性的侧定。 将 M l l s 、 H L B一 2、 K 84 菌株
点接在 M W培养基平皿中央 , 28 O C温箱培养 2天 , 用氯仿蒸汽杀死细菌 , 在无菌条件下 , 用吹雾瓶或喉 头
.本项研究承滚南京农业大学方中达 、 任欣正教授指导 , 中国科学院徽生物所马德钦 副研 究员指导并协助 质 较 D N人
位讨和拍瓜 , 道致谢意 。
13 8 植 物 病 理 学 报 2 3卷
表 l 实验用根癌土滚杆菌菌株及其有关特性
菌 株
质粒类 型 ·
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、 离寄主 来 源
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本实脸室
本 实验室
澳 大利亚 K e r
本实脸室
本实脸室
木实脸室
中国植物所
中科院徽生物所
本 实脸室
上海生物所
中国 植物所
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e t o p i n e )
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: A r g (A
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.
喷雾器分别将稀释到 10 一 l 。 ’ 个细胞 / m l根癌菌悬浮液均匀地喷务到上述已杀死细菌的M W平板 培养基上
面 , 28 O C培养 2~ 3天 , 观测抑制圈 。
(五 ) M l ls , 株抑制翻萄根盆土峨杆菌对植物的致盛试验。 供试植物为向日葵 、 巨峰葡萄等。 将 M l巧
和根癌菌株分别接种于 Y E B (或 N A液体培养基中 , 28 O C摇床振运培养 48 小时 , 离心收集菌体后 , 分别用
生理盐水稀释到 10 ’个细胞 /毫升 。 M l ls 与根癌菌以 1 : 1的比例混合 , 注射接种在向日葵幼苗基部和葡 萄嫩
枝上。接种后 , 向日葵 7天后开始观察结果 , 观察 2~ 3次 , 葡萄上 , 15 天开始观察 , 观察 2~ 3次 ( 2个月 ) 。
(六 ) M n s , 株在有萄上存活的研究。参考 T a r b a h的方法 〔 ” 。将分别标记硫酸链霉素 30 o m g /m l和利
福平 ( 1 om g /m l) M l s菌株 , 接种到葡萄嫩枝上 , 一个月后从接种处取样分离标记抗药性的M n s菌株 。
(七 ) M l s , 株的质拉检测 。 参考高才昌等的方法 〔 ’ ” ’ , 并以 C s s 、 H r J B一 2 、 E 26 菌株作对照。
试验结果
(一 ) 放射土坡杆菌 M 1 5菌株生物型的鉴定 。 经对 M l ls 菌株生理生化特性鉴定 , 结 果
表明 , M l ls 菌株在乳糖培养基上产生 3一酮基乳糖 ,氧化酶反应 阳性 , 石蕊牛奶中产碱 , 不利
用赤醉糖 , 能利用乙醇 、 松三糖产酸 , 不利用丙二酸盐 , 在 S hc r ot h培养基 上 生 长 , 耐 3%
N
a
C L
, s 5
O
C生长等 。 因此 , M l l s菌株属于生物 I 型 。
(二 ) 不同类型的根盛土滚杆菌对土坡杆菌案 lM l s 、 H L B一和 K84 的敏感性侧定 。 从表 2
可见 , 所测试的28 株不同生物型 、 不同质粒类型 、不同寄主范围和来源的根癌土壤杆菌在M W
培养基平皿测定时 , 对土壤杆菌素M l ls 几乎都敏感 , 其中以生物 ! 型菌株最为敏感 , 抑 制
圈直径最大达 5~ 6厘米 。 生物 I 型和 l 型菌株敏感性较差 , 一般抑制圈直径 1 。 3~ 2 . 0厘米。
M l l6 抑菌谱超过H L B一 2 , 所试菌株中有7株不被H L B一 2抑制 , 其中生物 I 型 2株 , 生物 I 型
和 I 型 5株 。 生物 I 型根癌菌对土壤杆菌素 K 84 都不敏感 。
(三 ) M !特 , 株防洽根盛土坡杆菌对寄主植物致油效果 。 M l s菌株和不同类型的 来 自
葡萄冠瘦的生物 I 型和 I型根癌土壤杆菌以 1 : 1的比例混合接种在葡萄和向日葵上 , 有显著
谢学梅等 : 放射土城杆菌M 工51菌株 生物防治葡萄根癌 病的研究
的防治根癌菌致瘤效果 , 见表 3和图 1 。 从表 3可知 , 在葡萄上 , 12 株根癌菌中有 10 株被完全抑
制致瘤 , 另 2株也不同程度的受到抑制 , 形成的冠瘦明显比对照小 。 M l ls 也 能 抑 制对土 壤
杆菌素H L B一 2不敏感的生物 l 型根癌菌 。 在向日葵上作同样试验 , 其结果与在葡 萄 _ !二试 验
相一致 。
表 2 不同根盛土城杆菌对土城杆菌素M l l s 、 H l 矛 B 一 2 、 K 84 饭感性
感 性① 敏 感 性①
根庙蔺株
M l l s H L B一 2 } K 8 4 M i 1 5 H L B 一 2 ) K 8 4
K 3 0 8
M 13一 2
M I 4一 l
M I 4一 6
L I S一 1
L I 64 5
G I g一 1
T l l l 一 3
T l l Z一 3
T l l 4一 1
C l l s一 l
B l l 6一 2
W l l s
一 5
M I 22
一 1
M I2 3一 1
M B 2 6一 1
M B 2 7一 l
M B 2 8一 6
M B 2 9一 4
M S 3 2一 6
B S 3 3一 4
B S 3 3一 1 0
G L 5 8一 3
H S 35一 1
C 5 8
P Z
一 l
B 6 S 3
7 0 2
S
S②
R
R
S
S②
5R
R
R
R
R
R
S
②
S
C曰
R
R
②Qú5
R
S
R
R
S
R
R
R
敏一
.……l
① S衰示敏班 , ② S表示 敏感性差 , R表示抗性 .
在向日葵上接种试验还表明 , M l ls 菌株
与一些来 自啤酒花和樱桃冠瘦上的生物 I 型
根癌菌H S 3 5一 1、 C s s菌株以 i : 1混合接种 ,
这些菌株的致癌力也被抑制。 有些根癌菌株
虽不被完全抑制 , 但形成的瘤子比对照小 ,
发病也推迟 。
(四 ) M n s菌株在葡萄上存活 定 殖 的
姗宪。 从接种抗药性 ( S t r , , R i f r ) 的 M x一5
菌株的葡萄枝上 (接种点处 ) 取 1克 样 品 ,
经表面消毒后 , 在灭菌研钵中研 碎 , 用 s m l
无菌水稀释 ,摇床振荡4小时后 , 吸取 l m l稀释
到 10 “ 4后 , 再吸取 o . l m l置 M W培养基上 ,用
三角玻瑞棒涂匀 , 28 O C温箱培养4~ 5 天 。 结
果从每毫升稀释液中分离到抗链霉 素 M 115
菌株5 1 0 0 0个 , 抗利福平 M l l s菌株 190 0 0个 。
这表明 , M l ls 菌株能在葡萄上存活定殖 。
表 3 M l ls 菌株和有萄根启病菌混合接
种防治冠应形成的效果
根瘤菌株
向 日 葵 { 葡 萄
M l , 5 + 病菌 …病菌 「 M: 15 + 病 , …病菌
币.r山去,小.r今
小.今r`叮十月占百.人,杏.备币`个.牵.本+`今卞十t备.占I小
小.今.币山,.下奉,命
十.币小.今小币奋百十` .备r小.奋,令山`.小卫个币M I 3一 2
M I4 一 6
L I S一 1
L I 64 5
T l l l一 3
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一 5
M 2I 2 一 1
M B 2 6一 1
M B 2 7一 l
M I 2 3一 l
BS 3 3一 10
K 3 0 8
注 : ` + . 表 示瘤小 : ` t t’ 表 示瘤较大 : . t卞t . 表示
瘤大 , .一 表示无瘤 .
植 物 病 理 学 报 2 3卷
、 `习,|l
!
l习、 ||
图 1 (上 图 ) 图 2
图 1 M l 5菌株 抑制葡萄根癌土城杆菌在向 日葵 、 葡萄苗
_卜致瘤
上 图 : 向 日葵幼苗上接种
左 : 单独接种根癌菌 M h s一 5 ;
右 : 生防菌 M n s与根癌菌 W l s一对昆合接种 。
下 图 : 葡萄 枝上接种
左 : 单独接 种根痛菌 W l ls一 5:
右 : 生防菌与 M l s根癌菌混合接种 .
图 2 M n s菌株质粒 D N A的琼脂搪授胶 电泳图
1
.
C 58, 2
.
M l l s ; 3
.
H L B一 2 ; 4
.
E 2 6
.
图 1 (下 图 )
(五 ) M ! 18 菌株质粒的检侧结果 。 通过琼脂糖凝胶电泳图谱可 以观测到M l ls 菌株有 1条
质粒带 , 与生物 I 型根癌土壤杆菌 C 58 基本相同 , 见图 2 。 根据在琼脂糖凝胶中的迁 移 率 和
C 5 8菌株相同 , 推测它的质粒与 C 58 菌株的T i质粒 ( 2 0 o K b) 大小相似 。 关于 M l ls 菌株产上
壤杆菌素基因编码是在染色体上 , 还是在质粒上有待进一步研究。 一 ,
}
讨 论
奋
|
从葡萄冠瘦中分离出的不致病放射土壤杆菌 M l l s ,具有土壤杆菌生物 I 型的生理生化特
性 。 它产生的土壤杆菌素对根癌菌抑制谱宽 ,在 MW培养基上测定超过H L B一 2菌株的抑 菌
围 , 不仅对引起葡萄根癌病的生物 I 型菌株有较强的抑制作用 , 而且对从其它寄主植物上分
离的根癌土壤杆菌中的生物 I 型和 l 型的一些菌株也有一定的拮抗作用。 用M l ls 与多 株 不
同类型的生物 I 型和来自葡萄的生物 I 型根癌菌以 1 : 1的比例混合接种向日葵幼苗和葡萄绿
枝 , 有防治根癌菌致病的显著效果 , 这在目前还未见到有从葡萄冠瘦中分离的生物 I 型放射
土集杆菌防治葡萄根癌病的报道 。
试验还表明 , 凡是在平皿测定对土壤杆菌素M l ls 敏感性强的菌株 , 接种防病时 , M l ls
对这些根癌菌株的防治致癌效果就显著 。
按K e r r等的观点 , K 84 菌株的防病机制是由于土壤杆菌素84 的作用 〔 “ ’ , 因此 , M l ls 菌
株的防病机制也可能是由于它产生的土壤杆菌素的类似物质的作用 。 根据前人研究的结果 ,
认为理想的生防菌株 , 必须具备本身不致病 , 能够产生大量的细菌素 , 抑菌范围广 , 抑菌力
空期 谢学梅等 : 放射土壤杆菌M h s菌株生物防治葡萄根庙病的研究 14 1
强 , 并能在寄主上存活和繁殖 。 我们对 M l ls 菌株的研究结果表明它具备上述几项条 件 , 并
关l乙ón
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且在田间防治有显著效果 。 因此 , 该菌株在生物防治葡萄根癌病中 , 有较大的实用价值
于田间防治试验结果另文报道 ) 。 M l ls 菌株的生物防治机理方面 , 还需进一步研究 。
口卜 〔 1 ) 游积峰等 . 植物保护学报 , 1 9 8 6 ,
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17 2一 1了9 , 1 9 7 7
ON A 5 T RA IN M !
B ! O L O G IC A L
1 5 O F AG RO B A C T E R IUM RA D 10 B A C T E R F O R T H E
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