全 文 ：收稿日期:2004-06-30
基金项目:国家自然科学基金(39770178)
＊通讯作者
文章编号:　0490-6756(2005)01-0179-06
金属离子和变性条件对野花生豆凝集素
活性和构象的影响
赵　曦 ,荣艳珍 ,常丽青 ,高　顺 ,吴传芳 ,李宜瑾 ,王陈继 ,鲍锦库＊
(四川大学生命科学学院成都 610064)
摘要:野花生豆凝集素在 pH 7.0和 pH 5.0缓冲体系中 , 用 EDTA去除其金属离子 , CML 凝
血活性下降.Ca2+、Mg2+ 、Mn2+ 、Zn2+可使去除金属离子 CML 活性基本恢复到天然水平 ,表
明这些二价金属离子为 CML活性所必需.研究不同温度和不同浓度盐酸胍条件下 CML 的圆
二色谱 、荧光光谱及其凝血活性的变化 ,结果表明 CML 含有较多 β-折叠 ,具有较强的抗变性
能力;脲变性的时间扫描荧光光谱证实了 CML 变性过程的阶段性.
关键词:野花生豆凝集素;金属离子;圆二色谱;荧光光谱;生物学活性
中图分类号:Q68　　　文献标识码:A
凝集素是一类结构各异的非免疫源性的糖结合蛋白或糖蛋白[ 1] .植物凝集素是凝集素家族中重要一
类.虽然植物凝集素存在的生理意义还不十分清楚 ,但越来越多的植物凝集素被分离纯化 ,人们利用各种
生物化学手段对植物凝集素的结构和性质进行研究.野花生豆凝集素(Crotalaria mucronata lectin ,简称
CML)是一类 A型血专一性凝集素 ,对它的分离纯化及性质研究已有报道[ 2 ,3] .本文在已有性质研究的基
础上 ,研究 CML 活性与金属离子之间的关系 ,并结合远紫外圆二色谱及内源荧光光谱的方法 ,研究 CML
在变性条件下构象和活性变化的关系.
1　材料与方法
1.1　材料
野花生豆种子采自福建省上杭地区;新鲜健康人 A 型血采自成都市第六人民医院;Sephacry S-200
HR购自 Pharmacia公司;SDS-PAGE低分子量标准为上海丽珠东风生物技术有限公司产品.
荧光光谱测定在HITACHI F-4500荧光分光光度计上进行 ,激发和发射光谱谱宽均为 5.0nm ,测定温
度为 25℃.圆二色谱在 JASCO-500型自动记录分光偏振仪上测定.
1.2　方法
1.2.1　CML 纯度测定　按文献[ 4]的方法纯化 CML ,纯化的 CML在 PAGE 或 SDS-PAGE均呈现单一蛋
白带.
1.2.2　CML 浓度测定　蛋白质浓度测定用 Folin-酚试剂 ,以牛血清白蛋白作标准[ 5] .
1.2.3　CML 活性测定　参照文[ 6]凝集活性测定在微量血清稀释板上进行 ,在系列倍比稀释的“V”型孔
中加入人 A型血红细胞振摇 10min ,室温放置 2h ,显微镜检查凝血活性.
1.2.4　金属离子对 CML 活性影响　取 4.32×10-4g/mL CML 2 ～ 3mL ,在含 2mmol/L EDTA 0.1mol/L
2005年 2月
第 42卷第 1期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edit ion)
Feb.2005
Vol.42　No.1
HAc-NaAc缓冲液中透析 20 ～ 30h ,透析去除 EDTA , 调节 pH 到中性 ,测定凝集素凝血活性和荧光光谱.
凝血活性.另取对照测定凝血活性.
1.2.5　不同温度处理对 CML 圆二色谱和荧光的影响　未经处理样品(生理盐水为溶液)进行远紫外圆
二色谱.CML 为 0.716×10-3g/mL ;残基平均分子量 110;灵敏度2m°/cm;光程 0.02cm .以下圆二色谱的
测定均按此参数进行.将溶解在生理盐水中的 CML 作为天然状态 CML.将用生理盐水配制的 CML 分别
于 40℃、60℃、70℃、80℃保温 10min ,快速冷却后测定其活性及光谱性质.(以下实验样品同)
1.2.6　不同 pH处理对 CML 圆二色谱的影响　配制 0.1mol/L pH 4.0 、5.0 HAc-NaAc缓冲液 、0.1mol/
L pH 9.0 NaHCO3-Na2CO3缓冲液和 pH 11.0 、pH 13.0 NaOH 溶液.将 CML溶于上述溶液中 ,4℃放置过
夜 ,测定圆二色谱和调节 pH 到中性并测凝血活性.
1.2.7　不同浓度盐酸胍对 CML 圆二色谱的影响　将 CML 溶于含有 0.5mol/L 、1mol/L 、3mol/L 、6mol/
L 、8mol/L 盐酸胍的生理盐水中 ,分别测定凝血活性和圆二色谱.
1.2.8　CML脲变性的时间扫描荧光光谱　将含 8mol/ L 脲的 CML 溶液(配制后放置 24h以上),用水稀
释 ,使 CML 终浓度为 50mg/L ,测定其在 295nm激发光下发射波长为 335nm 的相对荧光光谱强度随时间
的变化.
2　结果与讨论
2.1　天然状态 CML 的圆二色性与荧光光谱
CML 的远紫外圆二色谱在 218nm 处显示单一负峰(图 1),在 199nm 处有一正峰 ,峰值约为 218nm 峰
值的两倍.这些是以 β-折叠为主的蛋白质的远紫外圆二色谱的主要特征[ 7] .
在中性和 SDS溶液中 ,多聚 L-赖氨酸呈 β-折叠 ,它的远紫外圆二色谱在 218nm 处有一负峰.Litman
等人[ 7]从遗传树上处于关键地位的九个种属中分离了高分子或低分子的免疫球蛋白 ,测定了他们的远紫
外圆二色谱 ,这些谱线共同特征是 217nm 处的负峰 ,而它们的结构以 β-折叠为主.白鲟有一沉降系数为
10S的免疫球蛋白及鸡的 IgG的远紫外圆二色谱的峰位置均为 217.5nm[ 8] .CML 的远紫外圆二色谱峰在
218nm 处 ,它的谱线与以上的蛋白很相似 ,由此推测 ,CML 的二级结构以 β-折叠为主.
CML 的内源荧光发射光谱见图 2.用 280nm 激发时 ,发射峰峰值位于 335nm 处.其中未见有 Ty r 残
基的发射峰 ,表明 Tyr 残基的荧光基本上通过能量转移传递给了 Trp残基 ,使得 Trp 残基的荧光光谱增
强[ 9 ,10] .用 295nm 的激发光激发时 , CML 荧光光谱最大发射峰也在 335nm , 这与水溶液中自由 Trp的荧
光光谱 280nm 相比发生了明显的蓝移[ 9] .说明 T rp残基位于疏水环境中 ,这与荧光淬灭的结果一致[ 2] .
图 1　天然 CML 的圆二色谱图
Fig.1　CD spectra of native CML
图 2　天然 CML的荧光发射光谱
Fig.2　Fluorescence spectra of native CML
1:激发光波长 280nm;2:激发光波长 295nm
180 四川大学学报(自然科学版) 第 42卷
2.2　金属离子对 CML 光谱和活性的影响
在 pH5.0和 pH7.0时用 EDTA除去金属离子后 ,CML 的活性变化如表 1:
表 1　金属离子对 CML活性的影响
Table 1　The hemagglutinating activity of CML with the effect of me tal ion
CM L
凝集素浓度(×10-4g/ mL)
4.32 2.16 1.08 0.54 0.27 0.135 0.68
天然 + + + + + + +
pH5.0 去离子- - + + + - - - -
Ca
2+ + + + + + + -
Mg2+ + + + + + - -
Zn2+ + + + + + + -
Mn2+ + + + + + - -
pH7.0 去离子 + + - - - - -
Ca2+ + + + + + + -
Mg2+ + + + + + - -
Zn2+ + + + + + + -
Mn2+ + + + + + - -
　　　　　　“ +”表示凝血;“ -”表示不凝血
金属离子对CML 光谱和活性的影响见图 3.去除金属离子后 CML 还有一部分处于活性构型 ,就像去
离子的ConA处于“松散”型和“紧凑”型的平衡一样[ 12] ,“紧凑”型具有活性.pH 5.0 时去除金属离子后的
荧光峰相对强度下降更甚的原因可能是:酸性 pH 值 ,使失去金属离子的 CML 部分 Trp残基的微环境发
生了较大的变化 ,使之更为亲水 , CML 分子的稳定性下降程度更大 ,导致相对荧光强度下降更甚.
图 3　金属离子对 CML 的荧光光谱的影响
Fig.3　Fluo rescence spectra of CML w ith the effect o f metal ion
激发波长 280nm;A:pH 7.0;B:pH 5.0;1:天然 CML , 2:未除去 EDTA , 3:去除 EDTA
在去除金属离子后的 CML 中添加Ca2+ 、Mg2+、Zn2+ 、Mn2+ ,CML 的活性恢复程度见表 1.一些金属
离子可以使去离子的 CML 活性恢复 ,说明这些金属离子是 CML 活性所必需的 ,特别是 Ca2+和 Zn2+.豆
科凝集素有两个金属离子结合位点:一个是过渡金属离子的结合位点 ,另一个是钙离子结合位点.在 Con A
中 ,Ca2+可以稳定“紧凑”型(活性构型)构型 ,Mn2+也有这种作用[ 13] .由此看来 ,去离子的 CML可能也存在着“紧
凑”型和“松散”型的平衡 ,Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+都可以稳定 CML的“紧凑”型构型 ,使平衡向有利于“紧凑”型
构型方向移动 ,从而使去离子的CML 活性得到恢复.只是Mg2+、Mn2+的作用不及 Ca2+、Zn2+.
2.3　不同温度处理对 CML 活性及光谱的影响
181第 1期 赵曦等:金属离子和变性条件对野花生豆凝集素活性和构象的影响
CML 经不同温度处理的远紫外圆二色谱见图 4.温度处理导致的活性变化见表 2.在 40℃、60℃处理
10min后的 CML 的远紫外圆二色谱与天然状态的 CML 相比 ,峰的位置没有改变 ,但峰值减小.此时仍然
具有较强的凝血活性.70℃处理的 CML 的远紫外圆二色谱峰蓝移 ,峰值减小 ,峰形变宽 ,这时的 CML 结
构有了较大的变化 ,活性也相应降低.经 80℃处理的 CML 的谱形变化较大 ,不仅峰发生蓝移 ,而且谱峰显
示典型的双负峰 ,分别出现在 216nm 、208nm 处 ,这些都是α螺旋的特征谱型.这时的 CML 的活性有了较
大的改变 ,但未完全失活.不同温度处理后的 CML 的荧光光谱见图 5.
表 2　不同温度处理对 CML活性的影响
Table 2　The hemagglutinating activity of CML w ith the different temperature
温度(℃) 凝集素浓度(×10-4g/mL)
7.16 3.58 1.79 0.895 0.448 0.224 0.112
天然 + + + + + + +
30 + + + + + + +
40 + + + + + - -
60 + + + + + - -
70 + + + + - - -
80 + + + - - - -
　　　　　　　　“ +”表示凝血 “-”表示不凝血
图 4　不同温度处理对 CML 圆二色谱的影响
Fig.4　CD spectra of CM L with different tempera ture
1:天然CM L;2:40℃;3:60℃;4:70℃　5:80℃
图 5　不同温度处理对 CML 荧光光谱影响
　　　Fig.5　F luo rescence intensify of CML with different
　　　　　　temperature
1:天然CM L;2:40℃;3:60℃;4:70℃;5:80℃
2.4　不同 pH 处理对 CML圆二色谱的影响
不同 pH 条件下的 CML 的远紫外圆二色谱见图 6 ,活性变化见表 3.在 pH 4.0时 ,谱峰呈现双负峰 ,
说明在 pH 4.0时 ,CML 的结构显示了 α-螺旋的特征结构 ,而且这时 CML 的活性也有较大的下降.pH
13.0时 ,CML 的远紫外圆二色谱在 202nm 处出现了一个大的负峰 ,这时的 CML 已完全失活.200nm 附
近的负峰是无规卷曲为主的特征曲线 ,因此 pH 13.0条件下的 CML 的分子主要以无规卷曲为主 ,此时
CML 活性中心构象受到破坏 ,导致了活性完全丧失.
2.5　不同浓度的盐酸胍对 CML 圆二色谱的影响
不同浓度盐酸胍处理 CML 的圆二色谱见图 7 ,活性变化见表 4.CML 在盐酸胍达到 3.0mol/ L 时 ,谱
峰出现双负峰 ,并在大约 234nm 处出现一小的负峰.这时 CML 的活性有所下降 ,而活性没有大的变化.从
这里也看出CML 的结构变化先于活性的变化 ,甚至结构变化较大 ,活性变化也不大 ,表明 CML 具有一定
的抗变性能力.当盐酸胍达到 6.0mol/L 时 , CML 在 210nm ～ 250nm 的谱峰出现蓝移 ,峰位置在 210nm
182 四川大学学报(自然科学版) 第 42卷
处.在234nm 处也出现一个小峰 ,这时CML 仍有凝血活性.当盐酸胍达到 8mol/L 时 ,峰值出现在 206nm ,
CML 的活性完全丧失.盐酸胍达 8.0mol/L 时的谱线与 pH 13.0时的谱线很相似 ,都在 200nm 处出现一
个大的负峰 ,这是以无规卷曲为主的特征谱线 ,但是8.0mol/L 盐酸胍时的[θ]值变化不如 pH 13.0时变化
明显 ,说明在这时 CML 未完全变性 ,分子中仍存在部分有序结构.
表 3　不同 pH 对 CM L活性的影响
Table 3　The hemagglutinating activity of CML w ith the different pH
pH
凝集素浓度(×10-4g/ mL)
7.16 3.58 1.79 0.895 0.448 0.224 0.112
4.0 + + + - - - -
5.0 + + + + + + -
天然 + + + + + + +
9.0 + + + + + + -
11.0 + + - - - - -
13.0 - - - - - - -
　　　　“ +”表示凝血 “ -”表示不凝血
图 6　不同 pH 条件下 CML 的圆二色谱
Fig.6 　CD spectra of CML with different
pH
1:天然 CML;2:pH 4.0;3:pH 5.0;4:pH 9.0;
5:pH 11.0;6:pH 13.0
图 7　不同浓度盐酸胍对 CML圆二色谱的影响
Fig.7　CD spectra of CM L w ith different concen-
tration of guanidine-hydrochloride
1:0mol/ L;2:0.5mol/ L;3:1.0mol/ L;4:3.0m ol/ L;5:6.
0mol/ L;6:8.0mol/ L
表 4　不同浓度的盐酸胍对 CML 活性的影响
Table 4　The hemagglutinating activity of CML guanidine-hydrochlo ride
盐酸胍(mol/ L) 凝集素浓度(×10-4g/ mL)
7.16 3.58 1.79 0.895 0.448 0.224 0.112
0 + + + + + + +
0.5 + + + + + - -
1.0 + + + + - - +
3.0 + + + + - - -
6.0 + + - - - - -
8.0 - - - - - - -
　　　　　“ +”表示凝血 “ -”表示不凝血
蛋白质变性经历不同的中间构象阶段.以上不同条件下的研究结果表明 , CML 的变性过程至少经历
两个阶段 ,先是整体构象的变化 ,凝血活性变化有限.然后是活性中心构象的变化 , CML 丧失活性.对比
183第 1期 赵曦等:金属离子和变性条件对野花生豆凝集素活性和构象的影响
CML 在不同变性条件下的远紫外圆二色谱 ,发现在变性过程中都有一个 β-折叠向 α-螺旋转变的状态 ,这
个状态可能就是 CML 变性的一个中间状态 ,这也为 CML 的变性过程具有阶段性提供了证据.
2.6　CML 脲变性的时间扫描荧光光谱
　图 8　CML的时间扫描荧光光谱
　Fig.8　T ime-scanning F luorescence intensify of CM L
　　从图 8是 CML 的时间扫描荧光光谱 ,激发光波
长295nm ,发射波长 335nm ,1:从水溶液到 8.0mol/L
的脲 ;2:从 8.0mol/L 的脲到水溶液.可以看到 ,相对
荧光强度的变化表明 CML 在 8.0mol/L 脲中的变性
过程是一个相对较快的的过程 ,而脲变性的复性过程
则是一个相对缓慢的过程.
参考文献:
[ 1] 　孙册.生物化学与生物物理进展 , 1981 , 1:136.
[ 2] 　周红 , 曾仲奎.生物化学杂志 , 1997 , 13:546-551.
[ 3] 　汪新艳 , 周红.四川大学学报 , 2001 , 38:752-756.
[ 4] 　曾仲奎 , 杨静平.生物化学杂志 , 1988 , 4:489-494.
[ 5] 　Low ry O H , Rosebrough N J , Farr A L , et al.J.Biol.
Chem , 1951 , 193:265-275.
[ 6] 　孙册,朱政.凝集素[ M] .北京:科学出版社 , 1996.15-21.
[ 7] 　Litman G W , Frommel D , Rosenberg A , et al.Biochim Biophys Acta , 1971 , 236(3):647-654.
[ 8] 　鲁子贤 , 崔涛 ,施庆洛.圆二色性和旋光色散在分子生物学中的应用[ M] .北京:科学出版社 , 1987.
[ 9] 　曾仲奎 , 邓俊林.四川大学学报(自然科学版), 1995 , 32:720-724.
[ 10] 　孙建忠 ,王克夷.生物化学与生物物理学报 , 1994 , 26:649-655.
[ 11] 　周红 ,曾仲奎 , 鲍锦库.生物化学杂志 , 1996 , 12:564-568.
[ 12] 　Brown R D , Brewer C F , Koenig S H.Biochemistry , 1982 , 21:465-469.
[ 13] 　Brown R D , Brewer C F , Koenig S H.Biochemistry , 1977 , 16:3883-3896.
The Effects of Metal Ions and Denaturants on the Conformation and
Hemagglutinating Activity of Crotalaria mucronata lectin
ZHAO Xi , RONG Yan-zen , CHANG Li-qing , GAO Shun , WU Chuan-fang ,
LI Yi-in , WANG Chen-j i , BAO J in-ku
(College of Life Science Sichuan Universi ty , Chengdu 610064 ,China)
Abstract:To elucidate the relationship between conformational change and hemagglut inating activity of Cro-
talaria mucronata lectin(CML), the effects of metal ions and denaturants on conformation and hemaggluti-
nat ion of CM L were studied.The agglut inating activity of CM L decreased obviously af ter removing metal ions
from CML.Incubation of the deionized CML with Ca2+ , Mg2+ , Mn2+ , Zn2+respect ively , recovered the ag-
g lutinating activity of CM L to i ts natural level.It show ed that some ions were helpful to stabilize the confor-
mation of CM L.Circular dichroism (CD)spect rum of natural CM L indicated that β-sheets dominated in its
secondary structure.The change of CD spect rum and hemagglutination of CM L at different pH , temperature
and guanidinium hydrochloride concentration indicated that CM L had a comparably stable st ructure despite of
containing high β-sheet and lack of disulfide bond.The denaturation w as a tw o-step process.First , CML
didn t lose activity despite of its st ructural changes because these changes were out of the activity center.Sec-
ond , the activi ty center w as dest royed and CML lost its agglutinating activity completely.And the fluores-
cence spectra(FLS)of CM L at dif ferent temperature also revealed that there were tw o steps during the de-
naturation.
Key words:Crotalaria mucronata lectin;metal ion;circular dichroism;fluorescence spectra;hemagglutinating activity
184 四川大学学报(自然科学版) 第 42卷