全 文 ：收稿日期:2009-04-20;　修订日期:2009-12-30
基金项目:江苏省普通高校自然科学基金(No.06kjd180061)
作者简介:褚衍亮(1976-),男(汉族),山东微山人 ,现任江苏科技大学生
物与环境工程学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事生理生化研究工作.
葎草多糖的超声提取及抑菌活性研究
褚衍亮 ,王　娜 ,张明川
(江苏科技大学生物与环境工程学院 ,江苏 镇江　212018)
摘要:目的 优化葎草多糖的超声辅助提取工艺 , 并研究其抑菌活性。方法 以多糖中的葡萄糖含量为指标 , 对超声波功
率 、料液比和超声时间进行 L9(34)正交实验 ,确定超声辅助提取葎草粗多糖的最佳工艺。用 DE-52交换柱对葎草粗多
糖进行分离 , 以滤纸片法研究葎草粗多糖和多糖分离组分的抑菌能力。结果 以水为提取溶剂 , 料液比 1∶28(g/ml), 超
声功率 120W,超声 90 min提取 2次 , 葎草多糖的得率为 0.755%。葎草粗多糖的抑菌效果具有一定的剂量依赖性;各多
糖组分中 HSP-Ⅰ 、HSP-Ⅲ 、HSP-Ⅳ发挥主要抑菌作用 ,其中 HSP-Ⅰ 效果最显著 , HSP-Ⅱ抑菌效果不明显 , 且各组
分间表现出协同关系。结论 超声波辅助提取葎草多糖方法可行 , 得率高。葎草多糖具有抑菌活性。
关键词:葎草;　多糖;　分离;　抑菌活性
中图分类号:R285.5;R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)02-0342-03
StudyonUltrasound-assistedExtractionandAntibacterialActivityofPolysaccharides
fromHumulusscandens
CHUYan-liang, WANGNa, ZHANGMing-chuan
(ColegeofBiologicalandEnvironmentalEngineering, JiangsuUniversityofScienceandTechnology, Zhenjiang
212018, China)
Abstract:ObjectiveTooptimizetheultrasound-assistedextractionmethodandtostudytheantibacterialactivityofpolysac-
charidesfromHumulusscandens.MethodsTakingthecontentofglucoseasobservationindex, weoptimizedtheextraction
processbyL9(34)orthogonalexperiment.TheHumulusscandenspolysaccharides(HSP)waspurifiedintoHSP-Ⅰ , HSP-Ⅱ ,
HSP-Ⅲ andHSP-Ⅳ byionexchangechromatographywithDE-52.Theantibacterialactivityofeachcomponentwastestedby
meansoffilterpaper.ResultsTheoptimalextractionconditionswereobtainedasfolows:waterrefluxing, aratioofsolid-liquid
as1g:28ml, 120Wfortheintensionofultrasonicpower, extractingtime90minandextractingtwotimes.Underaforesaidoptimiza-
tionconditions, theyieldofpolysaccharideswas0.755%.Antibacterialexperimentsindicatedthattheinhibitoryefectofcrude
polysaccharidesshoweddose-dependent.Amongtheisolatedcomponents, HSP-Ⅰ , HSP-Ⅲ , HSP-Ⅳ playedmainantibac-
terialrolesandHSP-Ⅱ wasineffective.Itwascooperativewithdiferentisolatedcomponents.ConclusionTheyieldofHumu-
lusScandenspolysaccharidesishighwithultrasound-assistedextractionmethod.TheHumulusscandenspolysaccharideshasob-
viousantibacterialaction.
Keywords:Humulusscandens;　Polysaccharides;　Isolation;　Antibacterialactivity
　　葎草 Humulusscandens(Lour.)Merr.又名拉拉藤 , 拉拉秧 ,一
年生或多年生草本植物 , 全国各地几乎均有分布。葎草生长旺
盛 , 富含营养 , 既可以作为饲料 , 提高饲喂动物的生长状况 , 又可
以药用 , 有清热解毒 、利尿消肿之功效 [ 1] 。据文献报道 , 葎草中
含有木犀草素 、葡萄糖苷 、胆碱 、挥发油 、鞣质 、树脂 、天门冬酰胺
等物质 [ 2] , 其提取物具有抗结核菌的功效 [ 3] , 因而渐渐引起人们
的研究兴趣。近年对于葎草中的木犀草素 、黄酮类物质的提取已
有少量研究 [ 4, 5] , 但对葎草中多糖类物质的提取和活性研究还未
见报道。本文采用超声波辅助提取方法制备葎草总多糖 ,并对多
糖的抑菌活性进行研究 ,以期为这一优势植物资源的开发利用提
供一定的理论依据。
1　材料与仪器
1.1　材料 葎草 , 采自江苏科技大学校园内 , 晾干后粉碎过 100
目筛 , 干粉于干燥器中密封保存。大肠杆菌 Escherichiacoli、金黄
色葡萄球菌 Staphylococcusaureus、苏云金芽孢杆菌 Bacillus
thuringiensis、链球菌 Streptococcus,由本校生物与环境工程学院微
生物实验室提供。牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏 3.5 g, 蛋白胨
10.0 g, NaCl5.0g,琼脂 20.0g,水 1 000ml, pH7.0 ～ 7.2, 121℃
灭菌 30min)。
1.2 　试剂 葡萄糖 、硫酸 、苯酚 、活性炭 、乙醇 、牛肉膏 、蛋白胨
等 , 均为国产分析纯。
1.3　仪器 UV-9100紫外分光光度计 , KQ5200DB型数控超声
波清洗器 , FA2104型电子精密天平 , AvantiJ-25高效大容量冷
冻离心机(Beckman), DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱 , 瑞
士 Buchi旋转蒸发浓缩仪 , HWS-20恒温水浴箱 ,超净工作台等。
2　方法
2.1　多糖的提取与纯化
2.1.1　超声波提取工艺 以水为提取溶剂 , 选择超声波提取功
率 、提取时间和料液比 3个因素 ,各取 3个水平 , 以多糖含量为实
验指标 ,进行 L
9
(34)正交实验。
2.1.2　粗多糖的制备 准确称取葎草干粉 500.0 g, 按最优工艺
提取 , 得多糖粗提液。 粗提液减压浓缩至 200 ～ 300 ml后离心 ,
上清液加入 95%乙醇醇沉;沉淀物蒸馏水复溶 , 10%三氯乙酸除
·342·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 2期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.2
蛋白;上清液活性炭脱色 ,透析袋透析后再次醇沉 ,沉淀依次用乙
醇 、丙酮洗涤 ,挥去残余水分 , 真空干燥 , 即得葎草粗多糖(HSP)
干品。
2.1.3　粗多糖的分离纯化 将 70.0g二乙胺基乙基纤维素(DE
-52)依次用 500ml双蒸水 、500 ml0.5mol/L的氢氧化钠 、盐酸 、
氢氧化钠处理 , 0.5 h/次 , 不时搅拌 , 并用双蒸水处理至中性 , 装
柱柱规格:2.5 cm×30 cm。精密称取 HSP100.0 mg上样 , 在室温
下依次用 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0mol/LNaC1溶液梯度洗脱 , 洗脱速
度 5.0 ml/min, 每管收集 5.0 ml。苯酚 -硫酸法 [ 6]跟踪检测 ,收
集洗脱高峰部分 , 透析后减压浓缩 , 即得精制的葎草多糖组分。
2.2 　多糖含量的分析方法
2.2.1 　多糖含量的测定 采用硫酸 -苯酚法 [ 6] 。 精密称取
105℃干燥至恒重的葡萄糖 20.0mg,置于 100 ml容量瓶中 ,蒸馏
水定容为标准溶液。分别量取一定体积的标准溶液 ,配成浓度为
0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 μg/ml的葡萄糖稀释液。精密吸取上述稀
释液各 1.0 ml, 置于 10 ml容量瓶中 , 加入 5%的苯酚溶液 1.0
ml, 摇匀后再加入浓硫酸 5.0ml, 充分混匀后放置 30 min, 冷却到
室温后 , 在波长 490 nm处测定吸光度 , 绘制标准曲线(回归方程
为 Y=0.011 1X-0.014 1, r=0.999 1)。
2.2.2　换算因子测定 精密称取 80℃干燥至恒重的纯化葎草多
糖 HSP-II10.0mg, 加蒸馏水定容至 50ml, 配成葎草多糖储备
液。苯酚硫酸法测定吸光度 , 测得其葡萄糖含量。
换算因子 =W/C×D。式中:W为所取的纯化多糖重量
(mg), C为多糖储备液中葡萄糖质量(mg), D为多糖的稀释因
素。实验测定结果换算因子为 4.47。
2.2.3　 多糖含量计算 多糖含量(%)=(C×D×F/W)×
100%。式中:C为供试液中葡萄糖含量(mg), D为多糖溶液的
稀释倍数 , F为换算因子 , W为供试葎草干粉的重量(mg)。
2.3 　葎草多糖的抑菌活性 [ 7, 8] 将供试菌种分别接种到装有培
养基的试管内 ,进行扩大培养(37℃培养 24 h)。取活化好的菌
种斜面 , 用无菌生理盐水配制成 106个 /ml的菌悬液 , 备用。抑
菌作用的测定采用滤纸片法。将滤纸用打孔器打成直径为 6 mm
的圆形小纸片 , 分装于洁净干燥的小培养皿中 , 干热灭菌(160℃,
2 h)后备用。将葎草多糖配置成不同浓度溶液 ,用无菌镊子将滤
纸片放入溶液中 , 另取滤纸片放入蒸馏水中作阴性对照 , 放入
10mg/红霉素中作阳性对照 , 均浸泡 24 h。取制备好的菌悬液
0.2 ml, 滴入已经倒有固体培养基的平皿表面 , 用涂布器使其均
匀分布。用无菌镊子夹取浸有上述样品的滤纸片 ,放入含菌平皿
中 , 每皿 3片。按上述相应条件培养 ,每种菌作 3个重复试验 ,量
取抑菌圈直径 , 取平均值。
3　结果
3.1　超声波功率对葎草多糖含量的影响 在其他条件一致的情
况下(水为提取溶剂 ,料液比 1∶30,提取时间 90min), 取不同的
超声波功率 80, 100, 120, 140, 160, 180 W和 200W提取多糖 , 提
取两次 , 合并滤液 ,计算多糖含量。实验结果如图 1所示。由图
1可知 ,随着超声波功率的增加 , 葎草多糖的含量呈现出一定的
波动 , 分别在 100W和 160W处出现两个峰值 , 且 100W的含量高
于 160W。超声功率增加 , 对细胞壁的机械剪切作用增强 , 使细
胞内多糖溶出率增加 , 溶液中多糖含量也相应提高。但随着功率
的进一步增加 , 在促进多糖溶出的同时 , 对多糖的破坏作用也在
加强 , 进而导致多糖含量逐渐下降。考虑到多糖含量和能耗多
少 , 多糖的提取功率以 100W较为适宜。
图 1　超声波功率对葎草多糖含量的影响
图 2　提取时间对葎草多糖含量的影响
3.2　提取时间对葎草多糖含量的影响 固定料液比 1∶30,按照
不同的处理时间 ,采用超声波功率 100W分别提取两次 , 合并滤
液 , 计算多糖含量 ,实验结果如图 2所示。由图可知 , 多糖从细胞
的溶出量与超声波作用的时间长短有关 , 随着浸提时间延长 , 由
超声波引起的剪切作用和空化作用导致多糖溶出量持续上升 , 在
处理时间为 120min时多糖含量达到最高 , 比处理 60min实验组
的多糖含量多出 66.9%。 但时间过长 , 游离于溶液中的多糖分
子又受到超声波的持续作用导致分子断裂 , 引起多糖含量下降 ,
浸提 150min后 , 多糖含量只有最高值的 71.4%。由此可以得出
超声波提取时间应以 120min为宜。
3.3 　料液比对葎草多糖含量的影响 按照不同料液比(g/ml),
以超声波功率 100W提取 120min, 合并两次滤液 , 测定并计算多
糖含量 ,结果如图 3所示。溶剂用量对提取液中的多糖含量有较
明显的影响。随着提取溶剂用量的逐渐上升 ,物料与溶剂的接触
面扩大 , 多糖自细胞溶出后能更加充分的扩散到溶液中 , 多糖含
量逐渐上升 , 当料液比 1∶25时达到最大值。此后随着提取溶剂
的继续增加 ,物料过于分散 , 超声波的作用相对减弱 ,使多糖溶出
量较少 , 多糖含量下降。同时 ,液料比过大会导致溶剂浪费 ,多糖
分离困难 ,后续操作成本增加 , 根据图 3结果 , 料液比选择 1∶25
为宜。
图 3　料液比对葎草多糖含量的影响
3.4　正交实验 在单因素实验的基础上 , 以超声波功率 、浸提时
间和料液比作为主要因素进行正交试验设计 ,葎草干粉用量为每
份 1.0g,对提取液中的多糖含量进行测定计算 , 结果见表 1。 由
表 1可知 ,在所试的 3个因素中 , 料液比对提取液中多糖含量影
响最大 , 时间次之 , 功率影响最小。 其理论最优提取工艺为
·343·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.2 时珍国医国药 2010年第 21卷第 2期
A3B1C3 , 即功率 120W, 时间 90min, 料液比 1∶28,其组合条件不
在本次正交实验组中 , 按照 A3B1C3进行补充实验 , 其提取液中
的多糖含量为 0.755%, 高于正交实验中的最高值。因此 , 采用
超声波进行辅助提取时 ,按 1∶28料液比 , 120W超声波功率 ,浸
提 90min时 ,多糖含量达到最高值。
表 1　正交实验结果分析
实验号 A超声波动率 P/W B提取时间 t/min C料液比 Cg∶ml-1
多糖含量
(%)
1 80 90 1∶20 0.652
2 100 120 1∶25 0.671
3 120 150 1∶28 0.702
4 80 120 1∶28 0.667
5 100 150 1∶20 0.604
6 120 90 1∶25 0.700
7 80 150 1∶25 0.616
8 100 90 1∶28 0.730
9 120 120 1∶20 0.606
10＊ 120 90 1∶28 0.755X1 0.645 0.320 0.621X
2 0.668 0.296 0.662X3 0.669 0.293 0.699R 0.024 0.027 0.079
最优水平 A3 B1 C3
主次顺序 C>B>A
　　＊为补充实验结果
3.5 　葎草粗多糖的分离 采用 DE-52进行粗多糖的初步分离。
根据跟踪测量结果 ,以试管编号为横坐标 ,多糖的量为纵坐标做洗
脱色谱图(图 4)。根谱图准确收集了 HSP-Ⅰ、HSP-Ⅱ、HSP-Ⅲ和
HSP-Ⅳ4种组分。各种组分经浓缩醇沉干燥 , 得质量分别为:10.
4, 39.83, 23.58和 8.6mg。用双蒸水洗脱的色谱峰 HSP-Ⅰ为中性
多糖 ,不同离子强度的氯化钠溶液的洗脱峰为酸性多糖。
图 4　葎草多糖的 DE-52洗脱谱图
3.6 　葎草多糖对细菌的作用效果 将制备的葎草粗多糖配成
1.0, 10.0, 100.0 mg/ml3个浓度的水溶液 , 采用滤纸片法进行葎
草粗多糖的抑菌实验 , 结果见表 2。由表 2可知 , 葎草粗多糖对 4
种菌均有不同程度的抑制作用 , 且随着葎草粗多糖浓度的加大 ,
抑菌作用也逐渐增强。相同浓度下 , 多糖溶液对大肠杆菌的抑菌
效果最好 , 明显大于对其他菌种的抑制作用 , 这可能与大肠杆菌
为革兰氏阴性菌 , 其他菌种为阳性菌有关。
将 HSP-Ⅰ 、HSP-Ⅱ 、HSP-Ⅲ 、HSP-Ⅳ均配成 10.0mg/ml
的溶液 , 进行抑菌实验 ,结果如表 3所示。由表 3可知 , 葎草多糖
各组分的抑菌效果存在较大的差异性。 HSP-Ⅰ 和 HSP-Ⅲ对
大肠杆菌具有很强的抑制作用 ,但对苏云金芽孢杆菌的抑制作用
很弱 , 对后者的抑菌圈直径仅为对前者抑菌圈直径的 17%。和
26%HSP-Ⅰ和 HSP-Ⅳ对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强 , 明
显高于 HSP-Ⅱ和 HSP-Ⅲ的抑制效果。此外对链球菌起到抑
制作用主要是 HSP-Ⅰ , 其他组分作用则很弱。而对苏云金芽孢
杆菌的抑菌效果 , 4种多糖组分都很微弱 ,几乎没有 , 但是葎草粗
多糖对其抑菌效果却较好 ,可能是通过 4种组分中的两种或几种
协同作用实现的。总体看来 , HSP-Ⅰ的抑菌作用最为明显 , HSP
-Ⅱ的抑菌效果最小 ,但从分离所得含量上来看 , 后者明显高于
前者 , 因此葎草的抑菌活性更多的应是不同组分之间的协同作
用。
表 2　葎草粗多糖作用于不同菌种的抑菌圈直径 cm
试液 大肠杆菌 苏云金芽胞杆菌
金黄色葡
萄球菌 链球菌
蒸馏水 0.000 0.000 0.000 0.000
葎草粗多糖 1.0mg· ml-1 0.109 0.063 0.088 0.029
葎草粗多糖 10.0mg· ml-1 0.159 0.190 0.089 0.092
葎草粗多糖 100.0mg· ml-1 0.254 0.194 0.232 0.166
红霉素 2.575 2.675 2.272 2.384
表 3　葎草多糖组分作用于不同菌种的抑菌圈直径 cm
试液 大肠杆菌 苏云金芽胞杆菌
金黄色葡
萄球菌 链球菌
蒸馏水 0.000 0.000 0.000 0.000HSP-Ⅰ 0.283 0.047 0.177 0.540
HSP-Ⅱ 0.049 0.031 0.052 0.073
HSP-Ⅲ 0.165 0.043 0.057 0.057
HSP-Ⅳ 0.063 0.033 0.114 0.007
红霉素 2.641 2.455 2.359 2.352
4　结论
葎草叶片超声辅助水提取的工艺简单 ,成本较低 , 得率较高 ,
最佳提取工艺为:料液比 1∶28(g∶ml), 超声波功率 120W,提取
时间 90min,提取两次 , 多糖得率可达 0.755%。
葎草粗多糖经 DE-52柱层析分离后可得四种组分:HSP-
Ⅰ 、HSP-Ⅱ 、HSP-Ⅲ和 HSP-Ⅳ,其中 HSP-Ⅱ含量最大。
葎草叶片多糖对大肠杆菌 、苏云金芽孢杆菌 、金黄色葡萄球
菌和链球菌均有一定程度的抑制作用 ,因而在食品防腐和医药领
域的开发前景广阔。
参考文献:
[ 1 ] 　孙跃春 , 徐彤宝, 王艳玲.葎草的综合开发利用 [ J] .中国林副特
产 , 2003, 3:57.
[ 2 ] 　李俊婕 , 王晓静.葎草的研究进展 [ J].齐鲁药事 , 2007, 26(6):
353.
[ 3 ] 　陈伟光 , 林　霞 , 睢凤英 , 等.葎草抗结核分歧杆菌研究 [ J] .时
珍国医国药 , 2008, 19(1):58.
[ 4 ] 　陈伟光 , 盛　静 , 林　霞 , 等.正交设计研究葎草中总黄酮提取工
艺 [ J] .时珍国医国药 , 2007, 18(3):551.
[ 5 ] 　尹海波 , 康廷国 , 王　冰 , 等.正交实验法优选葎草的提取工艺
[ J] .中药材 , 2005, 28(12):1112.
[ 6 ] 　沈爱英 , 陆根明, 张　珩 , 等.叶面消毒对桑叶有机养分的影响
[ J] .蚕业科学 , 2003, 29(2):189.
[ 7 ] 　沈　萍 , 范秀容 , 李广武.微生物学实验 ,第 3版 [ M] .北京:高
等教育出版社 , 1999.
[ 8 ] 　杨艳彬 , 朱丽莉 , 唐明翔 , 等.蜂胶抑菌作用的研究 [ J].食品科
技 , 1999, 6:33.
·344·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 2期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.2