全 文 ：现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.11
杜梨叶黄酮的提取工艺研究及其初步定性分析
雷林芳 钟晓红△ 张 珉
（湖南农业大学天然产物重点实验室 湖南长沙 410128）
摘要 目的：优化杜梨叶总黄酮提取的工艺及其初步定性分析。方法：研究了浸提温度、乙醇浓度、提取时间、料液比等因素对杜梨
叶中黄酮类化合物提取效果的影响，和正交试验进行优化，所得结果采用方差分析。采用颜色反应的方法进行杜梨叶中黄酮的初
步定性分析。结果：确定了最佳单因素水平，正交实验确定了以乙醇为浸提剂的最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数 60%,料液比
1：22，温度 80℃,浸提时间 1h，在此条件下黄酮含量为 5.03%。结论：杜梨叶中含黄酮类化合物,颜色反应试验表明,其成分主要集
中在黄酮醇类和二氢黄酮类。
关键词：杜梨叶 黄酮 提取工艺 定性分析
中图分类号：S661.2 文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009)11-2087-04
Study on extraction technology of Bunge leaves flavonoids and its
preliminary qualitative analysis
LEI Lin-fang, ZhONG Xiao-hong△, ZhANG Ming
（Key Laboratory of Natural Products of Hunan Agricultural University, Changsha ,410128）
ABSTRACT Objective: To Bunge leaf to optimize the extraction process of total flavonoids and preliminary qualitative analysis.
Methods: We studied the effects of extraction temperature, ethanol concentration, time, ratio of material to liquid and other factors on
extract of flavonoids in Bunge leaves and used the orthogonal test to optimize the results of analysis of variance, making preliminary
qualitative analysis of flavonoids in Bunge leaves by using the method of color reaction. Results: The best single factor to determine the
level of orthogonal experiment to determine the ethanol extraction agent for the optimum extraction conditions are as follows: 60%
volume fraction of ethanol, feed liquid ratio 1:22, temperature 80 ℃, extraction time 1h. Conclusion: Bunge leaf rich in flavonoids, color
reaction test and a preliminary indication of UV spectra, the main ingredients of alcohols and dihydro flavonoid flavonoids.
Key words: Pyrus Betulaefolia Bunge leaf; flavonoids; extraction technology; qualitative analysis
Chinese Library Classification: S661.2 Document code: A
Article ID:1673-6273（2009）11-2087-04
作者简介：雷林芳（1983-），女，硕士研究生，
主要研究方向：天然产物提取 E-mail:763461928@qq.com
△通讯作者：钟晓红，E-mail:Xh-zhong@163.com
（收稿日期：2009-02-28 接受日期：2009-03-31）
前言
杜梨（Pyrus betulaefolia Bge.）属蔷薇科（Rosaceae）梨属
（Pyrus L.）乔木，杜梨药用称棠梨,主治功用为敛肺涩肠、止咳止
痢，常用于治疗久咳、久泻、久痢等[1]。据了解，杜梨叶中含黄酮
类化合物槲皮素衍生物[2]。黄酮类化合物是广泛存在于自然界
的一类重要的天然有机化合物，此类化合物大多呈黄色或淡黄
色，具有很高的生物活性和生理活性，是药用植物中主要活性
成分之一[3]。20世纪 80年代以来，黄酮类化合物日益引起人们
的重视[4]。目前，对杜梨的研究主要集中在种子萌发与幼苗生长
的研究、幼苗根系生长状况的研究。有关杜梨叶中黄酮类化合
物的研究尚未见报道。本研究通过单因素试验，正交试验对杜
梨叶中黄酮类化合物的提取条件进行优化，并对其进行了定性
分析，以期为杜梨叶的开发和综合利用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验仪器 UV-2550P紫外可见分光光度计、LD5-10离心
机、旋转蒸发器、索式提取装置。
1.1.2 试剂与材料试剂 无水乙醇（分析纯）、石油醚、结晶三氯
化铝、芦丁（上海试剂三厂）。材料：杜梨叶采自湖南省张家界慈
利。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的制备 准确称取芦丁 30mg，用 70%乙醇溶解
定容到 50ml容量瓶中，摇匀，配成质量浓度为 0.6mg／ml芦丁
标准液。
1.2.2 芦丁标准曲线绘制 分别吸取标准液 1，2，3，4，5，6，
7，8，9ml于 10ml容量瓶中，分别加入 70%乙醇定容，再分别从
10ml容量瓶中吸取 0.5ml标准液于试管中，加入 10mL1%AlCl3
（1.7567g）,静置 10min 于波长 420nm 处测定吸光度，以 AlCl3
为空白液，以吸光度值（A）为纵坐标，芦丁质量浓度（C）为横坐
标做标准曲线[5]。
1.2.3 黄酮含量的测定 将样品提取液离心后转入 50 ml容量
瓶中,用相应浓度的乙醇定容至刻度,摇匀,每次准确量取 0.5ml
于试管中，加入 10ml AlCl3，静置反应 10min。然后按与标准曲
线相同的方法测定提取液的吸光度，计算总黄酮的提取率[6]。
1.2.4 提取条件选择 将杜梨叶干燥，粉碎，过 60目筛得杜梨叶
粉末。准确称取 0.5g经石油醚脱脂脱色的杜梨叶粉若干份，分
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DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2009.11.006
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别在不同的提取时间、乙醇浓度、液料比、提取温度条件下作单
因子平行试验,按 1.2.3节的方法进行各样品总黄酮含量测定。
根据单因素试验结果选择提取温度、乙醇体积分数、提取
时间、料液比 4因素中有意义的 3水平做正交试验,因素水平
见表 1。应用 L9（34）正交表进行优选,采用方差分析法,确定最
佳提取工艺。
表 1 因素水平表
Table 1 Factors and levels
水平
Level
温度（℃）
Temperature A
乙醇体积分数（%）
Concentration B
时间（h）
Time C
料液比（g/ml）
Ratio D
1 60 50 1 1:18
2 70 60 1.5 1:20
3 80 70 2 1:22
1.2.5 黄酮类化合物的定性试验[7,8] 盐酸 -镁粉试验：取试液 1
ml加入少许镁粉，振摇，再加浓盐酸 4~5滴。观察，至沸水浴中
2min，观察。
与碱反应：取试液 1 ml，加入 10% NaOH 5滴，观察，加热
再观察。
三氯化铝试验：取试液滴于滤纸上,干燥后，喷洒 1%AlCl3
乙醇溶液，观察，再置紫外光下观察。
硼酸柠檬酸试验：取 1ml试液,沸水浴蒸干,加人饱和的硼
酸丙酮溶液和 10%柠檬酸丙酮溶液各 0.5ml，蒸去丙酮,紫外光
下观察
2 结果与分析
2.1 芦丁标准曲线
标准曲线如图 1所示,用最小二乘法作线性回归,结果表明
在 0.06~0.54 mg/ml的范围内, 吸光度与浓度呈良好的线性关
系。
2.2 黄酮提取单因素试验
2.2.1 乙醇浓度的选择 乙醇的溶解性能比较好,对植物细胞的
穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和
部分多糖等外,大多能在乙醇中溶解。无论是以游离的苷元还
是苷存在,黄酮类化合物都易溶于乙醇溶液中,因此总黄酮的提
取一般用有机溶剂乙醇提取[9]。实际操作中可以根据被提取物
质的性质,采用不同浓度的乙醇进行提取。
在 70℃、液料比 20：1（ml/g）条件下,用不同浓度乙醇溶液
回流提取 2h。结果如图 2所示,随着乙醇浓度的升高,黄酮得率
增加,但乙醇浓度超过 60%后黄酮得率反而下降。
由于黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态不同而有
很大差异，而二氢黄酮及二氢黄酮醇等,系非平面性分子，故分
子与分子间排列不紧密,分子间引力降低，有利于水分子进入,
溶解度稍大[10]。所以，随着乙醇浓度的增大黄酮含量反而下降。
2.2.2 浸提温度的选择 温度越高,分子运动越剧烈,渗透、扩散、
溶解速度加快,同时,高温可以引起细胞膜结构的变化,使黄酮
类化合物容易转移到溶剂中,因此,随提取温度的升高,黄酮类
化合物的得率也升高[11]。在 60%乙醇、液料比 20∶1 (ml /g)的
条件下,选用不同的提取温度回流提取 2h,结果如图 3所示。随
着温度的升高,黄酮得率随之增加,特别是到 60℃时黄酮得率
增幅较大。当温度超过 60℃时,黄酮得率有所起伏，这可能是因
为温度超过溶剂沸点时,容易造成溶剂的损失,从而导致浸出率
下降。因此,提取温度选择 60℃左右为宜。
2.2.3 浸提时间的选择 在 60℃、液料比 20：1（ml/g）、60%乙醇
条件下,选用不同的提取时间进行回流提取,得出杜梨叶总黄酮
得率与提取时间的关系如图 4所示。在本试验条件下,提取时
间在 2h时黄酮得率最高。
2.2.4 料液比的选择 在 60℃、60%乙醇条件下, 以能浸没原料
的最低乙醇量为基础,不同液料比回流提取 2h,结果见图 5。黄
图 1 芦丁标准曲线
Fig.1 The Rutin standard curve
图 2 乙醇浓度对浸提效果的影响
Fig.2 The effects of EtOH concentration on extract efficiency
图 3 浸提温度对提取效果的影响
Fig.3 The effect of temperature on extract efficiency
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酮得率随着液料比的增加而增加,因此,确定液料比为 24∶1时
提取黄酮。
2.3 黄酮提取最佳条件的确定
对杜梨叶黄酮提取效果的 4 个主要影响因素是：温度
（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C）、料液比（D）. 选择 L 9
（34）正交表，按表 1所示的因素水平进行正交试验,，计算黄酮
的提取率（%）,结果见表 2。
由表 2. 和表 3可以看出影响杜梨叶黄酮的提取效果主次
因素是 B>D>A>C，通过正交试验得出的最佳组合是 A3B2C1D3。
即温度为 80℃，乙醇体积分数为 60%、料液比为 1：22，提取时
间为 1h。在此条件下提取杜梨叶黄酮含量为 5.03%。
图 4 浸提时间对提取效果的影响
Fig.4 The effect of time on extract efficiency
图 5 料液比对浸提效果的影响
Fig. 5 The effect of ratio on extract efficiency
试验号 温度 A/℃ 乙醇体积分数 B 时间 C /h 料液比 D /(g·ml) 含量M/%
1 1 1 1 1 3.42
2 1 2 2 2 3.97
3 1 3 3 3 4.17
4 2 1 2 3 3.90
5 2 2 3 1 4.08
6 2 3 1 2 3.92
7 3 1 3 2 3.88
8 3 2 1 3 4.49
9 3 3 2 1 3.94
K1 3.853 3.733 3.943 3.813
K2 3.967 4.180 3.937 3.923
K3 4.103 4.010 4.043 4.187
R 0.250 0.447 0.106 0.374
表 2 正交试验结果（n= 4）
Table 2 Results of orthogonal test（n= 4）
因素 偏差平方和 自由度 F比 F 临界值
A 0.094 2 0.587 4.460
B 0.305 2 1.903 4.460
C 0.021 2 0.131 4.460
D 0.221 2 1.379 4.460
E（误差） 0.64 8
表 3 方差分析结果
Table 3 Analysis of variance
2.4 杜梨叶黄酮类化合物的定性分析
黄酮类化合物有多种特殊反应,杜梨叶片黄酮类化合物的
定性分析结果如表 4所示。由表 4的显色结果可知,杜梨叶片
可能含有黄酮醇类和二氢黄酮类化合物，另外可能含有少量的
黄酮及其苷类。
表 4 黄酮类化合物的定性分析结果
Table 4 The result of the systematic tests to flavonoids
反应类型 现象 结果
盐酸一镁粉反应 无色泡沫反应,加热泡沫加剧 可能含有第三位上不带经基的黄酮类化合物
与碱反应 棕黄色,加热颜色加深 可能含有黄酮类、二氢黄酮、黄酮醇类等化合物
三氯化铝试验 黄色,紫外光下呈黄色荧光 可能含有黄酮类化合物
硼酸柠檬酸试验 紫外光下呈黄绿色荧光较暗 含黄酮及其苷类
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3 结语
本研究通过单因素及正交试验,得出 4个因素对黄酮得率
的影响从大到小依次是：乙醇体积分数 >料液比 >温度 >提取
时间。由方差分析表明，乙醇体积分数对总黄酮提取有极显著
影响,其次是料液比，而温度、提取时间也有影响,但无显著差
异。为节约成本,提高效率,我们确定杜梨叶黄酮的最佳提取工
艺条件为:提取时间 2h,乙醇体积分数 60%,液料比为 1：22,温
度 60℃，在此条件下提取黄酮含量为 5.03%。
经过定性初步分析，杜梨叶中黄酮类化合物含量较丰富的
是黄酮醇类和二氢黄酮类化合物。
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