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中药猫眼草抑癌作用的动物实验



全 文 :中国临床康复 第 !卷 第 #期 !#$!$!出版
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中药猫眼草抑癌作用的动物实验!
肖宝红 %,张春玲 %,张 蓉 !,王英年 %
·基础研究·
青岛市中心医院&%呼吸内科& !检验科,山东省青岛市 !##’!
肖宝红!,女,%() 年生,山东省淄博市人,汉族,!* 年青岛大学医学
院毕业,硕士,主治医师,主要从事呼吸内科学的研究。
中图分类号 +,!-* 文献标识码 +. 文章编号 +%#)%$*(!#/!#0)$’-$’
收稿日期+!*$)$# 修回日期+!*$%%$% /*$(($)$*’** 1 2·30
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肖宝红 &张春玲 &张蓉 &王英年 9中药猫眼草抑癌作用的动物实验 OPQ9中国临床康复,
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摘要
目的:探讨中药猫眼草对 D5P?>肺癌小鼠肿瘤的生长、免疫调节、血液系
统的影响,及其对肿瘤细胞周期的作用。
方法:!实验于 !’$%% 1 !*$%在青岛海洋大学食品与药物研究所实
验室(山东省重点实验室)完成。选用 H*)ZD 1 #3纯系小鼠 ) 只。将 )
只小鼠随机分为 ) 组:空白对照组,模型组,猫眼草水提物 )R*,%*,\,
# G 1 [G组及顺铂 % :G 1 [G组&每组 %只。除空白对照组外,其他各组小
鼠均于右腋部皮下注射传代后 %’ B 的 D5P?> 肺癌瘤源小鼠瘤细胞悬液
R! :D以建立荷瘤小鼠模型。#从接种肿瘤次日开始猫眼草水提物a猫眼
草全草:购自青岛同仁堂大药房,产地江苏,产品批号:’(%;北京京兴
中药饮片厂生产(生产许可证号:冀 _!’#);猫眼草水提物:猫眼草
生药 * G 加水煮沸,过滤,浓缩 &制成口服液,每 % :D 含生药 %R Gd
)R*,%*,\,# G 1 [G 组按每日 )R*,%*,\,# G 1 [G 灌胃给予猫眼草水
提物,连续 %! B;顺铂 % :G 1 [G 组每日按 % :G 1 [G 剂量腹腔注射给药
% 次,连续 ) B。每天观察小鼠饮食及肿瘤生长情况。$末次灌胃给药后
!’ K,小鼠称重,处死,剥取瘤块称重,并计算抑瘤率 a/模型组平均瘤
重$治疗组瘤重0 1模型组平均瘤重b%cd。小鼠连续灌胃给药 %! B 后,
处死,取胸腺及脾脏称重,计算脾指数a脾质量 1体质量/:G 1 G0d及胸腺指
数a胸腺重量 1体质量 /:G 1 G0/体质量为小鼠体质量减去肿瘤质量后的
差值0d。%小鼠连续灌胃给药 %! B 后,取眼球血,应用血细胞分析仪进
行血细胞分析。&采用流式细胞仪 T.HJ<89 检测瘤组织细胞周期及凋
亡率。’组内计量资料差异比较采用方差分析,组间差异比较采用配
对 1 检验。
结果:小鼠 ) 只均进入结果分析。!结果显示猫眼草水提物 \ 和
# G 1 [G组及顺铂 % :G 1 [G组瘤重明显小于模型组(= g R*jR%),且
猫眼草水提物 )R*&%*&\&# G 1 [G 组抑瘤率分别为 R#-c&%#R(\%c&
\!R-#c和 *-R!**c,即随药物剂量的增加而增加。猫眼草水提物各
剂量组对荷瘤小鼠胸腺指数无明显影响,猫眼草水提物 \ 和 # G 1 [G
组荷瘤小鼠脾指数明显低于模型组 /= g R*0。#猫眼草水提物各剂量
组白细胞数、红细胞数、血小板数、血红蛋白与模型组比较,差异不明显
/= i R*0;顺铂 % :G 1 [G 组白细胞数明显低于模型组(= g R%)。$猫
眼草 \ 和 # G 1 [G 组和顺铂组的细胞在 4Y. 合成期的比例高于模型
组& 静止期j4Y. 合成前期的比例低于模型组&猫眼草 \ 和 # G 1 [G 组
和顺铂 % :G 1 [G组细胞凋亡率明显高于模型组(= g R*)。
结论:猫眼草水提物对 D5P?> 肺癌有明显的抑制作用,且该种作用随剂
量的增加而增高,有一定的免疫调节作用,并对小鼠血液系统无明显毒
副作用,其抗肿瘤作用与诱导细胞凋亡有关。
主题词:中药学;植物提取物 1药理学;肺肿瘤;细胞周期
C 引言
很多肺癌患者就诊时已经为肺癌中晚期,为延长
KL
!# $%&$’()*% +# *$’$,&- . /
!!!#$%&’(&)* ’(+,,-./-,01234&)* 肖宝红,等!中药猫眼草抑癌作用的动物实验
患者生存期、改善生活质量,应用廉价的中药治疗肺
癌己在临床实践中日益显示出优势。本实验旨在观察
中药猫眼草的抑癌作用。
! 材料和方法
设计:完全随机分组设计。
单位:山东省青岛市中心医院呼吸内科
材料:实验于 *--,’$$ . *--(’-$ 在青岛海洋大学
食品与药物研究所实验室(山东省重点实验室)完成。
选用 +(&01 . %2 纯系小鼠 &- 只,雄性,%34 周龄,体质
量(*-5*)6,由军事医学科学院实验动物中心提供(许
可证号:医动字第 +78 京 *--,’---$)。动物饲养环
境温度 **3*( 9,湿度 &-:34-:。随机分为 &组:空白
对照组,模型组,猫眼草水提物 &;(,$(,<-,%- 6 . =6 组
及顺铂 $ >6 . =6组?每组 $-只。
药品:猫眼草全草:购自青岛同仁堂大药房,产地
江苏,产品批号:-,-)-$;北京京兴中药饮片厂生产
(生产许可证号:冀 @*--,---%);猫眼草水提物的
制备:猫眼草生药 (-- 6 加水 ( --- >1 煮沸 *- >AB,
*次,, 层纱布过滤后,浓缩至 (-- >1?制成口服液,每
$ >1含生药 $;- 6 ,高压蒸汽杀菌后,于 , 9冰箱中贮
存备用。顺铂注射液:生产企业:C;D; CEFGHAB6 I +J;
1KH;KLEHAB6 EM NEOAH 0FGG 1EP,批号:#**$44$。
实验瘤株:1QRAM 肺癌,由中国医学科学院基础医
学研究所引进,青岛海洋大学海洋药物与食品研究所
传代保种;1QRAM 肺癌维持在 +(&01 . % 小鼠体内,每 *
周传代一次。
设计、实施、评估者:实验设计为第二作者,干预
实施为第一、三作者,评估为第四、五作者,均受过专
业培训,采用盲法评估。
方法:
荷瘤动物模型的建立:取传代后 $, H 的 1QRAM 肺
癌瘤源小鼠,颈脱臼处死,固定于鼠板上,常规消毒,
于超净工作台中,从腋部皮下剥取肿瘤组织,剔除纤
维包膜和坏死组织,在无菌平皿中剪碎,置组织研磨
器中加 , 9生理盐水,轻轻研磨过滤,制成瘤细胞悬
液。-;,:锥虫蓝计数,细胞活力S )(:,调整细胞浓度
为 $T$-$- 1’$。除空白对照组外,其他各组小鼠均于右
腋部皮下注射上述瘤细胞悬液 -;* >1。以建立模型。
给药方法 U 从接种肿瘤次日开始猫眼草水提物
&;(,$(,<-,%- 6 . =6 组按 &;(,$(,<-,%- 6 . =6 灌胃给
予猫眼草水提物,连续 $* H;顺铂 $ >6 . =6 组每日
按 $ >6 . =6剂量腹腔注射给药 $次,连续 & H。每天观
察小鼠饮食及肿瘤生长情况。末次灌胃给药后 *, V,
小鼠称重,处死。
计算各组瘤重及抑瘤率U末次给药后 *, V 将小鼠
称重,断颈处死,剥取瘤块称重。
按下式计算抑瘤率U抑瘤率WX模型组平均瘤重’治疗组
瘤重Y .模型组平均瘤重T$--:
计算胸腺指数U 小鼠连续灌胃给药 $* H 后,处死,
取胸腺及脾脏称重,计算脾指数及胸腺指数。胸腺指
数W胸腺重量 .体质量X>6 . 6YX体质量为小鼠体质量减去
肿瘤质量后的差值Y
计算脾指数U取小鼠脾脏,称重,计算脾指数。脾指
数W脾重量 .体质量X>6 . 6YX体质量为小鼠体质量减去肿
瘤质量后的差值Y
静脉血细胞分析U 小鼠连续灌胃给药 $* H 后,取
小鼠称重后摘去眼球取血,用 <;4:枸橼酸钠 $Z) 抗
凝,充分混匀,应用血细胞分析仪进行血细胞分析。记
录数据,分析。
流式细胞仪 C[+JLKX美国 0N公司Y检测瘤组织细
胞周期及凋亡率U组织固定:瘤体剥离称重后,取少许
瘤组织,用体积分数 -;&( 冷乙醇固定;在 *-- 目不锈
网上搓成单细胞悬液;*%& L . >AB 低速离心 ?\0 洗涤
两三遍,取碎片;调细胞数在 $T$-%左右;$ --- L . >AB,
离心 ( >AB;细胞沉淀中加入 \! X(-- >6 . 1Y*-- !1,, 9
避光染色 <- >AB;,--目不锈网过滤;上机测定。
主要观察指标:各组小鼠抑瘤率、胸腺指数、脾
指数、血液细胞数的变化。#各组小鼠瘤组织细胞周期
及凋亡率。$猫眼草对 1QRAM肺癌的抑制作用。
统计学分析:统计学处理由第一作者和青岛市中
心医院呼吸内科的刘加洪采用 \ $$;( 软件完成。
所有数据均以 561 表示;组内差异用方差分析,组间差
异用配对 7检验,8 ] -;-(为差异有显著性。
结果
*;$ 实验动物数量分析 纳入小鼠 &- 只,均进入结
果分析,无脱失值。
*;* 统计推断
*;*;$ 猫眼草水提物对小鼠体内 1QRAM 肺癌增殖的影
响 见表 $。
结果显示猫眼草水提物 <-?%- 6 . =6 组及顺铂
$ >6 . =6 组瘤重明显小于模型组(8 ] -;-(3-;-$),猫
眼草水提物各剂量组抑瘤率随剂量的增加而增高,与
顺铂组比较,差异不明显X8 S -;-(Y。说明猫眼草水提
物对小鼠体内 1QRAM肺癌生长具有不同程度的抑制作
用,并随剂量的增加而增高。
*;*;* 猫眼草水提物对小鼠免疫器官的影响 见
模型组
猫眼草水提物 &;( 6 . =6组
猫眼草水提物 $( 6 . =6组
猫眼草水提物 <- 6 . =6组
猫眼草水提物 %- 6 . =6组
顺铂 $ >6 . =6组
$;44(5-;(((
$;4)%5-;(&*
$;(%%5-;<%(
$;*%&5-;%4)E
-;&4&5-;,*-;&<(5-;*)4P
表 $ 各组小鼠体内 1QRAM肺癌生长情况比较 (56193W$-)
组别 瘤质量(6) 抑瘤率(:)
-
-;%-45<-;<,%
$%;)<$5$);<&&
<*;4-%5<%;(&*
(4;*((5**;,%,
%-;))*5$(;&)%
与模型组比较,E8 ] -;-(?P8 ] -;-$
#
!# $%&$’()*% +# *$’$,&- ./ !!!#$%&’(&)* 中国临床康复 *--%年 *月 *-日 第 $-卷 第 &期
表 *。
表 * 结果显示模型组脾指数明显高于空白对照
组(+ 0 -1-(),猫眼草水提物 2-,%- 3 . 43 组荷瘤小鼠
脾指数明显低于模型组 5+ 0 -1-(6;荷瘤小鼠胸腺指数
低于空白对照组,但无显著性差异5+ 7 -1-(6,猫眼草
水提物 &1( 3 . 43组胸腺指数高于模型组,其余猫眼草
各组胸腺指数低于模型组,但差异不明显5+ 7 -1-(6。
顺铂 $ 83 . 43组荷瘤小鼠脾指数及胸腺指数明显低于
模型组(+ 0 -1-$)。
*1*12 猫眼草对小鼠血液系统的影响 见表 2。
表 2 结果显示,荷瘤小鼠白细胞数明显高于空白
对照组(+ 0 -1-(),顺铂组白细胞与空白对照组比较,
差异不明显(+ 7 -1-()。各荷瘤小鼠组红细胞数、血小
板数、血红蛋白均明显低于空白对照组(+ 0 -1-$);
各猫眼草组与模型组小鼠的白细胞数、红细胞数、血
小板数、血红蛋白比较,差异不明显 5+ 7 -1-(6;顺铂
$ 83 . 43组白细胞数明显低于模型组(+ 0 -1-$)。
*1*1, 流式细胞仪检测 9:;<=肺癌组织的细胞周期及
凋亡率 见表 ,及图 $。
与模型组相比,猫眼草 2- 和 %- 3 . 43 组和顺铂组
的细胞在 >#?合成期的比例增高@ 静止期A>#? 合成
前期的比例降低@ 猫眼草 >#? 合成后期A有丝分裂期
的比例变化不大@ 而顺铂 $ 83 . 43 组 >#? 合成后期A
有丝分裂期比例增高,猫眼草对 9:;<=肺癌细胞周期
的影响是使肿瘤细胞静止期A>#? 合成前期细胞减
少@细胞阻滞在 >#? 合成期,并诱导部分肿瘤细胞凋
亡。猫眼草 2-和 %- 3 . 43组和顺铂 $ 83 . 43组细胞凋
亡率明显高于模型组(+ 0 -1-()。
! 讨论
大量的研究实践表明,天然植物中存在具有治疗
价值的抗癌成分,如喜树碱、三尖杉、紫杉醇等。近年从
天然植物、动物、微生物和海洋生物中分离出大量的新
型天然化合物,其中的抗肿瘤活性成分如生物碱、内
酯、多糖、黄酮、木脂体、皂甙苦瓜素、蛋白质、醌类、鞣
质等,主要集中于植物类药材。
猫眼草又名泽漆,是大戟科植物猫眼草的全草,
性微寒,味苦,有毒,入肺、肝经,生长在山坡草地,价
格低廉。在中国民间,已有人用猫眼草组方治疗癌症,
如纵隔肿瘤、食管癌及乳腺肿瘤等,猫眼草全草化学
成分含黄酮类成分、猫眼草素、山柰粉、槲皮素、山柰
粉’2’单’9鼠李糖甙及槲皮素’2’单’9’鼠李糖甙,还
含有甾醇、挥发油、酚类物质、有机酸及蜡质等。在汉
方外用药中,猫眼草有抗菌、抗病毒作用;外用于淋巴
结结核、皮癣、灭蛆。近年来,人们开始了对猫眼草及
其提取物的抗肿瘤作用的研究。在英国,?B<=C;C 等 D$E
从猫眼草中提取出黄酮化合物及一种细胞毒成分 !F
G:HIJKJL4对体外不同人体癌细胞株的细胞毒性,证明该细胞毒
成分对 P:IQF? 小鼠纤维肉瘤的抗肿瘤作用。如该细
胞毒成分和丝裂霉素 + 和 R/F,2* 联合进行治疗,结
果能增强 +(&S9 . % 小鼠对 S$%FS9% 小鼠黑瘤的抗肿
瘤作用D*E。另外,有泽宗久D2E也从猫眼草中分离出了有
抗促癌作用的黄酮类成分。高志良 D,E应用大剂量猫眼
草治疗早期弥漫性肝癌取得了满意的疗效。蔡鹰等 D(E
对泽漆根水提物进行了体外及体内抗肿瘤作用研究,
发现泽漆根水提物体外有直接细胞毒作用,并与时
间、剂量呈正相关;在体内不仅能抑制体内肿瘤生长,
还发现其降低荷瘤小鼠的脾指数使其接近正常组,升
高荷瘤小鼠的胸腺指数,但仍低于正常组,有提高机
体免疫能力的作用 D%E,与本实验结果基本相符,说明猫
眼草能抑制肿瘤生长,且其中有调节机体免疫力的成
分。过去很多研究证明在肿瘤早期阶段或肿瘤很小
时,机体的全身免疫功能正常或接近正常。文献报道,
肿瘤生长早期机体免疫反应增强,是由于肿瘤移植抗
原刺激所致。肿瘤所引起的免疫反应有其增强与消失
的变化过程D&,TE。本实验发现,不同剂量的猫眼草可不
同程度地降低荷瘤小鼠的脾脏指数,并随剂量的增加
而逐渐降低,逐渐接近空白对照组脾脏指数;低剂量
猫眼草可升高荷瘤小鼠胸腺指数,但剂量加大后胸腺
指数降低,考虑可能与猫眼草毒副作用有关。但本实
验样本量较小,且未对小鼠细胞免疫功能进行进一步
的研究,所以不能确定猫眼草对免疫的调节是完全的
空白对照组
模型组
猫眼草水提物 &1( 3 . 43组
猫眼草水提物 $( 3 . 43组
猫眼草水提物 2- 3 . 43组
猫眼草水提物 %- 3 . 43组
顺铂 $ 83 . 43组
21(T&U*1$),
$21,2(U$1T()C
$*1*)$U*12%)
$*1,-&U*1(**
$$1T2,U*12,&K
T1)$$U21))2K
,1,$$U-1&$(N
表 * 各组小鼠脾脏指数和胸腺指数比较 (,-./0V$-)
组别 脾脏指数(83 . 3) 胸腺指数583 . 36
$1,$$U-1T%T
$1$-&U-12)2
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-1TT$U-1,*$
-1($$U-1*&-N
与空白对照组比较,C+ 0 -1-$;与模型组比较,K+ 0 -1-(@ N+ 0 -1-$
空白对照组
模型组
猫眼草水提物 &1( 3 . 43组
猫眼草水提物 $( 3 . 43组
猫眼草水提物 2- 3 . 43组
猫眼草水提物 %- 3 . 43组
顺 铂 $ 83 . 43组
&12(U-1,*
,1--U-1&TK
21&TU-12-K
,1$TU$1$TK
,12)U$1,%K
,1%2U$1$%K
,1(*U$1$-K
表 2 各组小鼠血液系统测定指标比较 (,-./0V$-)
组别 红细胞5W$-$* 9’$6
白细胞
5W$-) 9’$6
与空白对照组比较,C+ 0 -1-(@K+ 0 -1-$X与模型组比较,N+ 0 -1-$
血小板
5W$-) 9’$6
血红蛋白
53 . 96
(1%(U$1*T
$,1-2U%1%$C
$21-%U,1)-C
$-1)2U21)TC
$-1&&U*1T$C
$,1$-U(1%%C
&1-(U*12$CN
&T(1**U$&-1-,
2),12&U$-*1)%K
2TT1T-U)&1%-K
2&T1T-U$(%1))K
(2&1T-U$$*1((K
2&-1T&U$T,1(-K
,&T1)-U$$&1%2K
$2-1$$U%1)(
&%1T)U$*1**K
&(1*-U,1%%K
T-1--U$T1-&K
T%1%-U*%1((K
T(1&TU$T1$,K
T*1,-U*-1-&K
模型组
猫眼草水提物 &1( 3 . 43组
猫眼草水提物 $( 3 . 43组
猫眼草水提物 2- 3 . 43组
猫眼草水提物 %- 3 . 43组
顺 铂 $ 83 . 43组
表 , 各组流式细胞仪检测 9:;<= 肺癌组织的细胞周期变化及凋亡率
比较 50V$-@Y6
组别 静止期A>#?合成前期
>#?合
成期
与模型组比较,C+ 0 -1-(
>#?合成后
期A有丝分裂期 凋亡率
(%1*&
*&12T
*T1T&
221,*
*)1))
**1-,
2-1T&
$,12,
*$12,
(T1-(
(%1-$
,(1T*
$*1T(
(T1*T
,)1&)
T1(,
$,1--
2*1$,
$1$)U$-12,
)1,,U$(1((
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中国临床康复 第 !卷 第 #期 !#$!$!出版
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本刊组稿重点!
! 在组织工程研究方面重点突出:
组织工程与干细胞的相容性研究、支架
材料研究、组织构建研究、组织工程生物
活性因子研究、组织工程分子生物学研
究、组织工程骨研究、组织工程软骨研
究、组织工程肌腱研究、组织工程化血管
研究、组织工程毛发研究、组织工程实质
性器官研究、组织工程管道系统研究、组
织工程皮肤研究、组织工程角膜研究、组
织工程神经研究、组织移植与组织再生
研究、生长因子与组织愈合研究、骨支架
重建与骨愈合研究、关节功能重建与人
工关节置换研究、组织损伤与功能重建
研究(术后肌腱粘连、失神经肌肉萎缩、
骨不连、软组织缺损、皮肤不愈合、类风
湿性关节畸形、指关节疼痛与僵直、股骨
头无菌性坏死、周围神经硬化症、糖尿病
足)及其实验技术方法研究等。
! 在康复工程研究方面重点突
出:机械辅助神经$肌肉康复技术与设
备研究、假肢仿生智能控制技术与智
能假肢研究、低成本假肢矫形器研究、
残疾人工作与学习环境的设计工程研
究、认知功能的康复技术与设备研究、
老年人室内安全监护技术与设备研
究、适应不同功能障碍者交流的人机
接口技术与设备研究、语音增强与替
代交流技术与设备研究、电子人工耳
蜗及其汉语识别技术研究、电子助视
技术与设备研究。
·本刊信息·
抑制,也可能是双向、整体的调节,需行进一步探讨。
本实验发现,各荷瘤小鼠组的白细胞数明显高
于空白对照组,除顺铂 % &’ ( )’ 组与空白对照组相
比*差异不明显外,其余各组差异均明显(= + ,-);
而红细胞数、血小板数、血红蛋白均明显低于空白对
照组(= + ,%),猫眼草各组的白细胞、红细胞数、血
小板数、血红蛋白与模型组比较,差异不明显.= / ,-0,
顺铂 % &’ ( )’组白细胞数明显低于模型组(= + ,%),
符合应用杀伤性药物顺铂的毒副作用。由此可见,荷
瘤小鼠血液系统的变化与接种肿瘤的外来刺激有关,
与猫眼草的应用无关,即猫眼草对小鼠的血液系统无
明显杀伤作用。
近年的研究表明 *细胞周期失控是细胞增殖失控
而导致癌变的重要原因 123。细胞周期调控与细胞周期
不同时相间存在的关键调控点密切相关*其中最重要
的调控点是 456 合成前期 ( 456 合成期调控点 *细
胞在该点分析细胞内、外的各种复杂信号以及 456
损伤情况 *以决定细胞是进入分裂程序、处于静止的
静止期或诱发细胞凋亡。肿瘤细胞与进行分裂的正
常细胞一样 *也按一系列步骤进行 *其细胞周期同样
分为 456 合成前期、456 合成期、456 合成后期、
有丝分裂期 7 期。由于调控其细胞周期的某些基因
发生变异 * 导致肿瘤细胞不能在 456 合成前期 (
456 合成期调控点等细胞周期的关键部位对细胞
内、外的各种信息进行正确反映 *导致了肿瘤细胞周
期的失控。因此*影响和改善肿瘤细胞周期及其调控
机制在肿瘤治疗中具有重要意义。近年来,对中药的
抗肿瘤作用机制的研究已深入到细胞周期的变化及
有无诱导细胞凋亡的方面,如中药金安等的研究1%3。本
实验流式细胞仪检测结果显示:猫眼草水提物 8 和
# ’ ( )’ 组对肿瘤细胞的细胞周期有较明显的影响*使
静止期9456 合成前期细胞比例减少* 456 合成期细
胞比例增高,对肿瘤细胞周期的作用与顺铂 % &’ ( )’
组所示较类似;猫眼草水提物 :,-*%-*8*# ’ ( )’ 组的
凋亡率随药物剂量的增加而升高。细胞凋亡是在多
种基因调控下发生的细胞主动死亡过程。近年来的
研究表明 ;多种结构不同、作用靶点各异的抗肿瘤药
均可能诱导某些细胞发生凋亡。虽然诱发凋亡的分
子机制还不十分清楚*但诱导肿瘤细胞凋亡已成为治
疗肿瘤的新靶点。
总之,本实验发现猫眼草水提物对 <=>?@ 肺癌有
明显的抑制作用,且提示猫眼草水提物抑制肺癌的作
用随剂量的增加而增高,有一定的免疫调节作用,并对
小鼠血液系统无明显毒副作用,其抗肿瘤作用与诱导
细胞凋亡有关。
(图 % 见封三)
! 参考文献
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