全 文 ： 研究原著 文章编号:1000-2790(2007)12-1091-03
椒目油对大鼠气道重建的防治作用
陈洪谦 ,戚好文 ,王　立 ,赵　睿 ,方丽萍　(第四军医大学西京医院呼吸内科 ,陕西 西安 710033)
收稿日期:2006-10-18;　接受日期:2006-12-15
通讯作者:戚好文. Te l:(029)84775577　Em ail: qih aow en@ fmm u.
edu. cn
作者简介:陈洪谦. 硕士生 (导师戚好文 ), 主治医师. Tel:(029)
84775327　Emai l:hongq ian@ fmm u. edu. cn
Effect of bunge pricklyash seed oil on
airway remodeling in rats
CHEN Hong-Qian , Q I Hao-Wen , WANG Li, ZHAO R ui, FANG
Li-P ing
Departm ent o f Respiratory D isea ses, Xijing H ospita l, Fourth
M ilitaryM ed ica l Un ive rsity, Xian 710033, Ch ina
【Abstract】AIM:To study the effect of bunge prick lyash seed
o il on the expressions o f co llagen type III, p ro liferating ce ll
nuc lea r antigen (PCNA) and a irw ay rem ode ling, so as to prov ide
theo re tical evidence fo r its c lin ica l app lication. METHODS:
M ale SD ra ts(n =30)w ere random ly divided into 3 g roups(n =
10):asthm a g roup, treatm ent group and contro l g roup. W em ade
the asthm a m ode ls by intraabdom ina l in jec tion o f ova lbum in
(OVA) fo r a llerg iza tion and OVA aero sol inha la tion fo r chal-
lenge, then analyzed the expression o f co llagen type III and the
thickne ss o f airway w all by imm unochem istry and im age quantita-
tive ana lysis m e thods. RESULTS: Imm unochem istry o f co llagen
type III show ed tha t the ave rage o f asthm a g roup(19. 24 ±0. 24)
w as much highe r than that in contro l group (2. 75 ±0. 22, P <
0. 01) and tha t in treatm ent g roup (10. 16±0. 37, P <0. 05).
PCNA in asthm a g roup was much highe r than tha t in contro l g roup
(P <0. 05), while that of treatment group w as low er than tha t in
asthm a group(P <0. 05). Thickne ss of b ronchia lw a ll in asthm a
g roup(10. 24±2. 05) w as much highe r than tha t in con tro l group
(5. 81±0. 73, P <0. 01), and that in treatment g roup(8. 45 ±
1. 67, P <0. 01). CONCLUSION:Bunge prick lyash seed o il
could effec tive ly manage a sthm a and prevent airw ay remodeling,
m aybe through inhibiting the produc tion o f PCNA and co llagen
type III.
【Keywords】bunge prickly ash seed o il;a sthm a;a irw ay rem ode-
ling; pro life ra ting ce ll nuclear antige r; co llagen
type III
【摘　要】目的:研究椒目油对哮喘大鼠模型Ⅲ型胶原 、增殖
细胞核抗原(PCNA)的表达水平及气道重建的影响 , 为椒目的
临床应用提供理论依据. 方法:将雄性 SD大鼠 30只随机分
为 3组:哮喘组 、治疗组 、对照组 , 每组动物 10只 , 用卵白蛋白
(OVA)腹腔注射致敏和雾化吸入激发建立哮喘大鼠模型 , 采
用计算机图像分析免疫组化气道璧中Ⅲ型胶原的表达 ,并测
量各组支气管壁的厚度. 结果:免疫组化结果显示 , Ⅲ型胶原
阳性表达的平均吸光度:哮喘组大鼠(19. 24±0. 24)明显高于
对照组(2. 75±0. 22, P <0. 01);治疗组 (10. 16±0. 37)明显
低于哮喘组 (P <0. 01) . PCNA的表达哮喘组明显高于对照
组(P <0. 05);治疗组低于哮喘组 (P <0. 05). 哮喘组支气管
壁厚度(10. 24 ±2. 05)明显高于对照组 (5. 81 ±0. 73, P <
0. 01);治疗组 (8. 45 ±1. 67)明显低于哮喘组 (P <0. 01).
结论:椒目油不但能有效治疗哮喘 , 而且还能有效防止气道
重建 , 其作用机制可能是抑制了Ⅲ型胶原和 PCNA的生成 .
【关键词】椒目油;哮喘;气道重建;增殖细胞核抗原;胶原
Ⅲ型
【中图号】R562. 25　　　【文献标识码】A
0　引言
中药椒目治疗支气管哮喘历史悠久 ,具有很好的
疗效 ,目前国内许多单位相继开展了椒目治疗哮喘研
究 ,取得一定成果 [ 1] . 从国内大量的文献报道以及研
究成果显示 ,无论从分子生物学的角度或是从临床的
角度都说明了椒目能有效治疗哮喘.但是椒目是否能
有效地防止气道重建 ,目前还少见报道. 为此我们进
行了这方面研究 ,以探讨椒目油对气道重建的影响.
1　材料和方法
1. 1　材料　健康雄性 SD大鼠 30只 ,体质量 200 ～
250 g(第四军医大学实验动物中心);椒目油(第四军
医大学西京医院药剂科 ,批号:20050221);卵白蛋白
(ovalbum in , OVA ,美国 Sigma公司);超声雾化器 (上
海鱼跃医疗设备有限公司 );SP-2000彩色图像分析
系统(上海世珈医疗设备有限公司 );小鼠抗大鼠 Ⅲ
型胶原 , 增殖细胞核抗原 (pro lifera ting cell nuc lear
antigen, PCNA)多克隆抗体 , SABC免疫组化试剂盒
(武汉博士德生物有限公司 ).
1. 2　方法
1. 2. 1　分组　将大鼠随机分为 3组:哮喘组 ,治疗组
和对照组 ,每组大鼠各 10只.
1. 2. 2　模型建立　参考文献 [ 2]的方法 ,用 10 g /L
OVA和 10 g /L氢氧化铝溶液 0. 5mL大鼠腹腔注射和
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0. 5mL前腿内侧皮下注射 ,第 8日重复注射 1次 ,至
15 d开始吸入 10 g /L OVA溶液激发 5 m in. 10 g /L
的 OVA溶液需每日配制 ,雾化时将大鼠置于特制塑
料容器内雾化吸人.治疗组在雾化激发后 1 h给予椒
目油和熟精油的混合物 (按 1:1混合 ),以 3 mL /kg
灌胃. 对照组以生理盐水代替 OVA致敏和雾化.
1. 2. 3　大鼠气管和支气管病理组织观察　3组大鼠
在激发 3 mo后处死并制作病理标本. 经右主支气管
注入 100 mL /L的中性甲醛溶液 10 mL至肺适度膨
胀 ,将右肺连同右主支气管剪下放入 100mL /L中性
甲醛固定 7 d.从右侧下肺叶开口处以水平位取材 ,制
成石蜡切片 , 行 HE染色作病理观察. HE染色切片
放大 100倍 ,选择 R<0. 2 mm ,横断面完整的小支气
管测量气道内周长(Pi)和最大直径上相对的两个管
壁厚度 (T1, T2),计算(T1+T2) /P .i
1. 2. 4　免疫组化检测 PCNA和 Ⅲ型胶原含量　用
ABC法 ,以 PBS代替一抗作为空白对照 ,小鼠抗大鼠
Ⅲ型胶原抗体工作浓度为 1∶100. 组织切片按序以
PBS漂洗 , 300mL /L羊血清 ,一抗 、二抗孵育后浸入
ABC液中 1 h,取出经 PBS, T ris-HC l缓冲液漂洗 ,再
以 DAB显色 ,苏木精复染 ,常规脱水 ,透明 、封盖. 每
例标本取 2张切片 ,每张切片随机选取直径在 100 ～
200 pm的小支气管 5支 ,应用彩色图像分析系统测
定黏膜下层吸光度确定Ⅲ型胶原的含量 ,以平均吸光
度 (A值)表示 ,取其平均值作为测定值.
统计学处理:实验数据用 x ±s表示 ,应用 SPSS
10. 0软件进行 t检验分析 , P <0. 05为差异具有统计
学意义.
2　结果
2. 1　肺组织 HE染色及嗜性粒细胞浸润　哮喘组大
鼠肺切片 HE染色可见支气管上皮细胞肿胀 、脱落 ,
管壁增厚 ,管腔变窄 ,管壁内及管周有大量炎性细胞
浸润 ,以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主;治疗组大鼠
的肺组织可见支气管上皮细胞的炎症反应较哮喘组
为轻 ,支气管壁及管腔内的炎症细胞也大为减少;对
照组大鼠的肺组织则无上述改变.
2. 2　大鼠支气管平滑肌厚度的变化　哮喘组 (图
1A)大鼠哮喘组大鼠气道壁厚度较对照组明显增加
(P <0. 05),治疗组 (图 1B)大鼠气道壁厚度较哮喘
组明显降低 (P <0. 05),但与对照组 (图 1C)相比仍
较高(P <0. 05,表 1).
2. 3　Ⅲ型胶原的表达　各组动物气道及其周围肺组
织均可见呈深棕色圆形颗粒的 Ⅲ型胶原阳性反应细
胞 ,主要分布在气道壁黏膜下层.
灰度分析结果显示哮喘组表达明显高于对照组 ,
治疗组低于哮喘组略高于对照组 (P <0. 01,表 1).
A:哮喘模型组;B:椒目油治疗组;C:对照组.
图 1　各组大鼠支气管病理组织切片　HE ×400
表 1　Ⅲ型胶原在支气管肺组织的阳性表达及支气管平滑肌
厚度的变化 (n=10, x±s)
组别 Ⅲ型胶原时性 气道壁厚度(%)
对照 2. 75±0. 22 5. 81±0. 73
治疗 10. 16±0. 37b 8. 45±1. 67b
哮喘 19. 24±0. 24bd 10. 24±2. 05bd
bP <0. 01 vs对照;dP <0. 01 vs治疗.
2. 4　PCNA表达的变化　各组动物气道及其周围肺
组织均可见染色呈棕黑色圆形颗粒的 PCNA蛋白阳
性反应细胞. 分布于上皮下基底膜 、平滑肌细胞及外
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周成纤维细胞.哮喘组阳性细胞颗粒数目及灰度明显
高于对照组 (P <0. 01);治疗组明显低于哮喘组 (P <
0. 01),略高于对照组(P <0. 01).
3　讨论
气道重建又称气道重塑或重构 [ 3] ,它是哮喘病
理特征之一 ,哮喘气道重建是一个集合性术语 ,特指
哮喘患者气道壁结构的改变不同于正常气道组织学
改变 ,在哮喘患者气道中除有炎症性细胞浸润外主要
表现为上皮脱落 ,气道平滑肌层的增生 、肥大以及基
底膜增厚和玻璃样变. 气道重建是顽固性哮喘反复
发病的基础 ,因此防止哮喘气道重建是目前国内外研
究的一大热点.而目前评价任何一个治疗哮喘药物 ,
除了它的平喘 、止咳之外 ,还要评价它能否有防止哮
喘气道重建的作用.
哮喘气道重建的机制非常复杂 ,涉及到多种细
胞 、细胞因子及炎症介质等.在哮喘反复发作过程中 ,
气道反复损伤和修复 ,由于各种致上皮损伤因素持续
存在 ,引起损伤修复不平衡 ,导致气道重建. 其主要
特征是平滑肌细胞增殖及细胞外基质沉积[ 4] . 细胞
外基质沉积主要由胶原及少量纤连蛋白等构成 [ 5] .
细胞外基质中胶原的沉积主要为Ⅲ型 、Ⅴ胶原的显著
增生 ,其部位主要位于黏膜下层 ,基底层和肺间质中
增加不明显 , Ⅲ型胶原的增生成为细胞外基质沉积的
主要病理基础[ 6] . 气道重建是气道受到慢性炎症反
复刺激的结果 ,可溶性生长因子 、炎性因子等在其中
发挥着重要作用 ,它们具有诱导成纤维细胞 、气道平
滑肌的有丝分裂作用 ,或促进结缔组织的合成. 转化
生长因子的表达与成纤维细胞数相关 ,并能增加气道
平滑肌细胞 DNA合成以促进细胞分裂增殖.
PCNA是一种分子质量为 36 ku的蛋白质 ,在细
胞核内合成 ,并存在于细胞核内 ,为 DNA聚合酶 δ的
辅助蛋白. PCNA表达仅见于增殖细胞且细胞周期密
切相关 ,其表达量与 DNA的合成一致 ,因此 PCNA表
达情况可作为评估组织中细胞增殖状态的一个可靠
指标.
我们的结果发现 ,哮喘组支气管上皮细胞肿胀 、
脱落 ,管壁增厚 ,管腔变窄 ,管壁内及管周有大量炎性
细胞浸润 ,以 EOS和淋巴细胞为主;治疗组支气管上
皮细胞的炎症反应较哮喘组为轻 ,支气管壁及管腔内
的炎症细胞也大为减少;对照组则无上述改变. 免疫
组化结果显示 Ⅲ型胶原 , PCNA的表达哮喘组明显高
于对照组 (P <0. 01);治疗组低于哮喘组略高于对照
组 (P <0. 01).说明早期服用椒目油不仅可以有效地
治疗哮喘 ,而且可以有效地预防气道重建.
中国特有的中西医结合疗法针对哮喘 “急则治
标 (西医解痉 ,中医降气 ),缓则治本 (补肾固本)”的
方法 ,使哮喘患者获得较长时间的缓解期 [ 7] . 有许多
关于椒目治疗哮喘的报道[ 8 -9]大多数是从临床效果
来说明 ,而缺乏药理学基础. 我们从抑制 Ⅲ型胶原增
生 、基底膜增厚 ,降低 PCNA、预防气道平滑肌肥大 ,
从而低气道重建出发研究椒目油治疗哮喘的机制 ,通
过研究其抑制 Ⅲ型胶原增生达到预防基底膜增厚 、减
少 PCNA ,预防气道平滑肌肥大 ,为椒目治疗哮喘提
供了药理学基础.
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编辑　王　睿
1093第四军医大学学报( J Fourth M ilM ed Un iv)2007, 28(12)　http:/ /journa.l fmm u. edu. cn