全 文 ：收稿日期:2007-12-14　　　作者简介:袁建琴(1970-), 女 ,讲师 , 硕士 , jane666887@yahoo.com.cn
基金项目:农业部第五批部级质检中心筹建计划(农市发[ 2005] 14 号);山西农业大学科技创新基金(2004060)
研究
简报
转基因棉子油的快速 PCR检测研究
袁建琴 , 唐中伟1 , 许冬梅1 , 刘建东1 , 高斌战2
(1.山西农业大学生命科学学院 ,山西太谷 030801;
2.山西隆克尔生物制药有限公司 ,山西 太谷 030800)
摘要:以棉子油为原料 ,探索出了一种快速 、简便的转基因棉子油的 PCR检测方法 。该方法能
从 15 mL 棉子油中提取 0.4 μg 高纯度 DNA ,用于 PCR检测。针对 18S rDN A 、CaMV35S 、
NOS 、N PTⅡ和 Cry1A(c)等基因进行了棉子油中内外源基因 PCR检测 ,分别扩增出不同的
目的片段。本研究为油脂类产品的外源基因检测提供了可行方法。
关键词:棉子油;转基因成分;DNA 提取;PCR;检测研究
中图分类号:S565.1　　　文献标识码:A
文章编号:1002-7807(2009)02-0153-03
Study of Rapid Detection of Transgene Sequences in CottonseedOil Using PCR
YUAN Jian-qin1 , TANG Zhong-wei1 ,XU Dong-mei1 , LIU Jian-dong 1 ,GAO Bin-zhan2
(1.Collegeo f L i fe Science ,S hanx i Agricultural Universi ty , Taigu , Shanxi 030801 ,China;2.Lucker
Pharmaceutical Stock Factory , Taigu , S hanx i 030800 ,China)
Abstract:A simple and rapid-me thod which could ext ract DNA from cot tonseed oil had been devel-
oped.A y ield o f 0.4 μg DN A could be obtained from 15 mL oil.PCR amplification of sequences of
CaMV35S , NOS , N PT Ⅱ , Cry1A(c), and an endogenous reference gene 18S rDNA in refined cot ton-
seed oil was perfo rmed.Results show ed that the sequence-specific f ragments we re amplif ied in the
samples , demonst ra ting that the method could be applied for de tection of t ransgene sequences.There
are some DNA fragments in ref ined co ttonseed oil , and PCR amplif ication can detect the foreign
DNA.
Key words:co ttonseed oi l;t ransgene sequences;DNA ex traction;PCR;detection study
　　由于转基因抗虫棉棉子油成分特殊 ,目前国
内尚缺乏检测试剂盒和相关的规范研究 。针对以
上情况 ,本研究以棉子油为材料 ,探索出一种快
速 、简便的提取棉子油 DNA 的方法 ,并提取十种
棉子油的 DNA ,针对 CaMV35S 、NOS 、NP T Ⅱ、
和 Cry1A(c)等外源基因和内源基因 18S rDNA
进行了 PCR检测 ,为油脂类产品的外源基因检测
提供了可行方法[ 1-4] 。
1　材料和方法
1.1　材料
棉子油:品种有晋棉 26 、中棉所 38 、中棉所
41 、中棉所 42 、晋棉 7号 、晋棉 12 、晋棉 37 、晋棉
38 、永丰棉 5号和永丰棉 998。
1.2　棉子油 DNA的提取
取 15 mL 精练棉子油 ,加入 15 mL 正己烷 ,
磁力搅拌器上不断振荡混合 2 h;加入 30 mL
NaCl(1.2 mol· L-1),继续于磁力搅拌器上振荡
混合 2 h;12000 r·min-1离心 20 min ,使有机相和
水相分离 ,小心取出下层水相;加入与水相溶液等
体积的异丙醇 ,轻缓颠倒混匀 ,室温放置 10 min
后 ,12000 r ·min-1离心15 min ,弃上清液 ,保留沉
淀;待沉淀稍微干燥后用 1 mL TE溶解沉淀 ,加
入 1 mL 异丙醇 ,轻缓颠倒混匀 ,室温放置 10 min
　棉 花 学 报　Co tton Science　　2009 , 21(2):153 ～ 155
后 ,12000 r ·min-1离心15 min ,弃上清液 ,保留沉
淀;待沉淀稍微干燥后加入 60 μL TE ,充分溶解
沉淀 ,2 min 后过 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试
剂盒(仅进行纯化部分),最后将离心获得的溶液
(经核酸蛋白浓度检测仪检测浓度)取 7 μL 进行
琼脂糖凝胶电泳 , 同时可作为 PCR 反应的模
板[ 5-6] 。建议一个 PCR反应使用 1 μL DNA 。
1.3　PCR反应条件
从 10份棉子油中分别提取 DNA ,电泳后进
行 PCR 扩增。 18S rDN A 、CaMV35S 、NOS 和
N PT Ⅱ引物反应条件:95℃10 min , (94℃30 s ,
54℃40 s ,72℃1 min)×40 个循环 , 72℃10 min。
Cry1A(c)引物反应条件:95℃10 min ,(94℃30 s ,
60℃40 s ,72℃1 min)×40 个循环 , 72℃10 min。
PCR反应体系为 25 μL[ 7-8] 。 PCR 后 , 取 7 μL
PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析 。
2　结果与分析
2.1　棉子油 DNA提取电泳图
由于棉子油成分特殊 ,目前国内尚缺乏检测
试剂盒和相关的规范研究。本研究经过反复试
验 ,开发出离心柱法提取棉子油 DNA 的方法 ,已
从 15 mL 油中提取出 0.4 μg DNA(核酸蛋白浓
度检测仪检测),将获得的溶液取 7 μL 进行琼脂
糖凝胶电泳(图 1)。
1 晋棉 26;2 中棉所 38;3 中棉所 41;4 中棉所 42;
5 晋棉 7号;6 晋棉 12;7 晋棉 37;8 晋棉38;9 永丰棉 5号;
10 永丰棉 998;M DL-2000 DNA Marker。
图 1　棉子油 DNA的提取电泳图
Fig.1　Agarose gel of cottonseed oil DNA extraction product
2.2　不同品种的棉子油扩增结果
从 10份棉子油中分别提取 DNA ,电泳后进
行 PCR扩增(表 1)。
表 1　不同引物和不同品种棉子油 PCR扩增结果
Table 1　PCR results of dif ferent cottonseed oil by using different primers
18S rD NA CaM V35S NOS NP T Ⅱ Cry1A(c)
晋棉 26 + + + + +
中棉所 38 + + + + +
中棉所 41 + + + + +
中棉所 42 + + + + +
晋棉 7 号 + - - - -
晋棉 12 + - - - -
晋棉 37 + + + + +
晋棉 38 + + + + +
永丰棉 5 号 + + + + +
永丰棉 998 + + + + +
转基因棉子 + + + + +
非转基因棉子 + - - - -
　　结果表明 ,在 10个品种中 ,除用内源基因扩
增均呈阳性外 ,其余四个引物扩增均呈阳性的有
8个品种 ,分别为:晋棉 26 、中棉所 38 、中棉所 41 、
中棉所 42 、晋棉 37 、晋棉 38 、永丰棉 5 号 、永丰棉
998;晋棉 12和晋棉 7号的其余 4个引物扩增均
呈阴性。目前 ,棉子油多为转基因棉子压榨而成 ,
而棉子油中含有转基因成分的含量有待进一步
研究 。
3　结论与讨论
本文首次报道了一种快速 、简便的检测棉子
油转基因成分的方法 ,该方法能从 15 mL 棉子油
中提取 0.4 μg 高纯度 DNA ,从而用于 PCR检
测。在提取底层沉淀时适当延长了离心时间 ,实
验结果显示 ,增加离心时间有利于 DNA 量的提
取。经过 10 种棉子油 DNA 提取 , 针对 18S
rDNA 、CaMV35S 、NOS 、N PT Ⅱ和 Cry1A(c)基
因进行了 PCR检测 ,分别扩增出不同的目的片
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段。以上方法可用于其它油脂类产品的检测 。
在 PCR检测中 ,样品 DNA 的数量和纯度是
检测成功的关键 。直接从组织中提取 DNA 比较
容易 ,而深加工的转基因产品(例如:油 、蜂蜜 、牛
奶 、酱油 、土豆片等),在加工过程中由于物理 、化
学或发酵的操作使得 DNA 的提取变得非常困
难 ,从而制约着这类产品的检测。本研究以棉子
油为原料 ,选用既可以和油相溶又可以和 NaCl
(1.2 mo l·L-1)溶液有一定的溶解度的正己烷处
理样品 ,使残存在油中的 DNA 交换到缓冲液中 ,
最后用 UNIQ-10柱式 DNA 胶回收试剂盒对缓
冲液纯化处理 ,得到高品质的 DNA 。该方法同时
适用于油脂含量较高的产品。目前国内外尚未有
成功从棉子油产品中提取 DNA 且进行该产品转
基因成分检测的报道 。后续研究可以从以下几个
方面进行:(1)进一步优化条件 ,以便得到更加稳
定 、纯度更高的 DNA ,同时开发研制试剂盒(可提
取油类作物及其产品)。(2)PCR产物的酶切鉴
定。以本文研究结果为基础 ,将棉子油的 PCR产
物回收 ,进行 PCR产物的酶切鉴定 。(3)PCR产
物的克隆和测序 。对 PCR产物片段按 PCR产物
回收试剂盒说明进行琼脂糖凝胶回收 ,连接到 T-
easy 载体上进行序列测定 ,并对序列结果进行比
对和分析 。
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1552 期　　　　　　　　　　　　　　袁建琴等:转基因棉子油的快速 PCR检测研究