全 文 ：大豆油中转基因成分的 Nested PCR和
Sem-i nested PCR检测方法研究
闻伟刚 崔俊霞 赵秀玲
(宁波出入境检验检疫局,宁波 315012)
摘 要: 对大豆油中 DNA提取方法进行了研究 ,结果表明 CT AB、SDS 和 Wizard 试剂盒提取大豆油 DNA
均具有良好的效果。利用 nested PCR和 sem-i nested PCR 检测大豆( Roundup Ready)油中的转基因成分发现, 该
方法能够检测到大豆原油中的 L ectin 基因( 112bp)、CaM V35S 基因( 147bP)和 CP 4-EPS PS 基因( 205bp) , 检测灵
敏度达到 10- 6 ng /Ll;但该方法未能从人豆成品油 (一级)中扩增到上述基因, 当中的转基因成分 DNA 含量低于
10- 12 ng/Ll。
关键词: 大豆油 转基因成分 Nested PCR Sem-i nested PCR 检测
Detection of Transgenic Ingredient from Soybean
Oil by Nested PCR and Sem-i nested PCR
Wen Weigang Cui Junxia Zhao Xiuling
( Ning bo Ent ry-ex i t I nsp ec tion and Quarant ine B ureau, N ingbo 315012)
Abstract: Methods fo r DNA ext raction fr om soybean o il w as studied, the r esult showed t hat a favo rable effect
could be obtained using w ith CT AB, SDS or W izard kit . The nested PCR and sem-i nested PCR tests wer e used to de-
tect the transgenic ingr edient in Roundup Ready soybean oil, t he results show ed that Lectin gene( 112bp) , CaM V35S
gene ( 147 bp) and CP4-EP SPS gene( 205 bp) could be amplified fr om crude soybean oil but no t f rom finished prod-
uct of soybean oil. Its detection sensitiv ity is 10- 6 ng/Ll, and the transgenic ing redients DNA in finished product o f
so ybean o il is lowed than l0- 12 ng /Ll.
Key words: Soybean oil T ransgenic ing redient Nested PCR Sem-i nested PCR Detect ion
目前,国内外对大豆、玉米等食品原料的转基因 PCR检测方法已非常成熟[ 1, 2] ,但是, 由于普通 PCR方
法的灵敏度限制,在对经过深加工的转基因食品进行检测时往往会出现假阴性的结果 [ 3]。由转基因大豆经
过工艺处理而来的大豆油, 其中所含有的转基因成分 DNA 已非常少,因此, 需要研究一种灵敏度和稳定性
更高的 PCR方法来对其进行检测。
Nested PCR是在普通 PCR基础上发展起来的一种 PCR技术, 在分子生物学研究和医学检测方面应用
较多[ 4~ 6] 。其原理是设计两对引物,其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上,通过二轮 PCR 反应对
某个基因进行检测。通常第一次采用能扩增较大片段的引物,经过 20~ 30次循环扩增后, 将第一次扩增的
产物作为模板进行第二次扩增。sem-i nested PCR的原理与 nested PCR相同, 只是 sem-i nested PCR只有
一对半引物,有一条引物被用于二轮 PCR反应中。这两种方法不但可以减少假阳性的出现,而且可以使检
测灵敏度提高几个数量级。
本研究对 nested PCR和 sem-i nested PCR检测大豆( Roundup Ready )油中的转基因成分进行了详细的
研究,包括大豆油 DNA 的提取和目的基因引物的设计等,以期建立一套快速、灵敏和简便的检测体系,为
收稿日期: 2005-04-10
作者简介:闻伟刚( 1975- ) ,男,博士,高工,研究方向:从事转基因产品与疫病分子生物学检测
生物技术通报
# 研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
口岸进口大豆油的转基因符合性检测和转基因标识提供技术支撑。
1 材料和方法
1. 1 材料
转基因大豆( Roundup Ready )来自美国、阿根廷和巴西等国。大豆油为从美国、阿根廷和巴西等国进口
的大豆原油或购自超市的大豆色拉油、大豆调和油等一级大豆成品油。PCR 引物由上海生物工程公司合
成。TaqDNA 聚合酶和 dNT P 等 PCR试剂购自上海博亚生物技术公司。
1. 2 DNA 的提取
转基因大豆 DNA的提取采用 CT AB法[ 1] 。取 10Ll DNA溶液,在 Helio s Y 型( Thermo Spectr onic)紫
外分光光度计上测定 OD260值,估算 DNA 含量,并用双蒸水稀释成 10- 1ng/Ll、10- 2ng/Ll、10- 3 ng/ Ll、10- 4
ng /Ll、10- 5ng/Ll、10- 6ng/Ll、10- 7ng/ Ll等不同浓度梯度。
大豆油 DNA 的提取分别采用下面四种裂解液: CT AB裂解液( CT AB20g/ L, NaCl 1. 4mol/ L , T ris-HCl
0. 1 mo l/ L , EDT A 0. 02 mol/ L, pH 8. 0) , SDS裂解液( SDS 5g/ L, T ris-H Cl 0. 1 mol/ L, EDTA 0. 02mol/ L,
pH 8. 0) , Nuclei lysis so lut ion( Wizard试剂盒) ,异硫氰酸胍裂解液( GuSCN 5 mol/ L , T ris-HCl 0. 1 mol/ L,
EDTA 0. 02mo l/ L , pH 8. 0)。提取方法如下:取 1 m l油于 1. 5 m l离心管中,加入 200 Ll裂解液,充分混匀
后, 12 000r/ m 离心 10 m in,取下层水溶液:于 65 e 水浴 30 min,然后加入 100 Ll蛋白质沉淀液(本室研制) ,
混匀后, 12 000r/ m离心 10min, 取下层水溶液: 用等体积氯仿抽提一次, 取上清,再加入等体积异丙醇,室温
沉淀 10min, 然后 12 000r/ m离心 10min, 弃上清: 70%乙醇洗涤一次,晾干后,加入 20Ll双蒸水溶解。
1. 3 Nested PCR和 sem-i nested PCR扩增
第一轮 PCR反应体系包括: DNA 模板 l Ll, 10 @ PCR buffer( M g2+ , plus) 2. 5 Ll, dNT P( 10mmo l/ L ) 0. 5
Ll, Taq酶( 5U/ Ll) 0. 2Ll,引物( 20 Lmo l/ L )各 0. 5 Ll, ddH2O 19. 8 Ll, 总体积为 25Ll。nested PCR 和 sem-i
nested PCR引物的序列和来源(见表 1)。
表 1 大豆油转基因成分的 nested PCR和 sem-i nested PCR检测引物
引物序列 组合 扩增产物 来源
大豆内源基因( Lectin )
L1: 5c-GAT GGAT CTGAT AGAATT GAC-3 L1/ L2 412bp Van Hoef et al . [7] ( 1998)
L2: 5c-GCCGAAGCAACCAAACATG-3 Van Hoef et al . ( 1998)
L3: 5c-CAT CT GCAAGCCT T TT TGT 6-3 L3/ L4( nested) 112bp 本研究设计
L4: 5c-CT CT ACTCCACCCCCATC-3 本研究设计
花椰菜花叶病毒启动子墓因( CaMV35S)
T 1: 5c-TGT GCTGT AGCCACTGATGC-3 T1/ T 2 343bp Van Hoef et al . ( 1998)
T 2: 5c-TGAT GTGAT ATCT CCACT GAC-3 Van Hoef et al . ( 1998)
T 3: 5c-TGT ATCCCTT GAGCCAT GTT GT-3 T3/ T 4( nested) 147bp 本研究设计
T 4: 5c-CTGACGT AAGGGATGACGC- 3 本研究设计
抗草甘膦基因( CP4-EPSPS)
E1: 5c-CT T CTGT GCT GTAGCCACT GATGC- 3 本研究设计
E2: 5c-CCACTAT CCT TCGCAAGACCCT TC- 3 E1/ E2 320bp 本研究设计
E3: 5c-CAACATGGCTCAAGGGATACAA-3 本研究设计
E3/ E4( nested) 205bp
第二轮 PCR反应体系与第一轮 PCR反应体系一致, DNA 模板为第一轮 PCR 反应产物。反应时, 第一
轮 PCR反应条件为: 95 e 预变性 5min; 95 e 变性 30s, 60 e 复性 60s, 72 e 延伸 60 s, 30个循环; 最后 72 e 延
伸5 m in。第二轮 PCR反应条件为: 95 e 预变性5 min: 95 e 变性30 s, 60 e 复性30 s, 72 e 延伸 45 s, 35个循
环;最后 72 e 延伸 5min。
852005年第 6期 闻伟刚等:大豆油中转基因成分的 Nested PCR和 Sem-i nested PCR检测方法研究
1. 4 Nested PCR和 sem-i nested PCR结果分析
PCR反应结束后,取 15 Ll扩增产物进行 1. 5%琼脂糖
凝胶电泳,在 GelDoc-EQ( Bio-Rad)凝胶成像系统上观察并
记录结果。
2 结果与分析
2. 1 四种裂解液提取大豆油 DNA的效果比较
异硫氰酸胍裂解液与大豆油互溶,因此,不能用于大豆
油 DNA 的提取。其它三种裂解液提取的大豆油 DNA, 经
过第一轮普通 PCR扩增大豆内源 L ect in 基因,没有条带产
生:再经过 nested PCR 扩增, 均能够特异性得到一条分子
量为 112 bp的谱带(图 1) , 且亮度相近, 由此,判断 CT AB、
SDS 利 Nuclei lysis solut ion 这二种裂解液提取大豆油
DNA 均具有很好的效果。
2. 2 CaMV35S 启动子基因的 nested PCR扩增
CaMV35S 启动子基因的普通 PCR扩增灵敏度为 1~
10ng/Ll, 其片段大小为 343bp;经过 nestedPCR扩增,能够
得到一条分子量为 147bp 的特异性条带(图 2) ,其扩增灵敏
度达到 10- 6 ng/Ll, 比普通 PCR 方法灵敏度高出 6个数量
级以上。
2. 3 CP4-EPSPS 目的基因的 sem-i nested PCR扩增
普通 PCR扩增 CP4-EPSPS 目的基因的灵敏度为 1~ 0
ng /Ll,其片段大小为 320 bp; 经过 sem-i nested PCR扩增,
能够得到一条分子量为 205bp 的特异性条带(图 3) ,其扩增
灵敏度同样达到 10- 6 ng/ Ll,比普通 PCR方法灵敏度高出
6个数量级以上。因此, nested PCR和 sem-i nested PCR在
扩增灵敏度上差别不大。
3 结论与讨论
大豆油分大豆原油和大豆成品油。利用 nested PCR
和 sem-i nested PCR对大豆原油中的转基因成分进行检测
表明(表 2) , 15份样品的检测结果与其申明一致, 另外有 3
份样品的检测结果与其申明不同,经追溯查证,结果发现是
申明错误。因此,本研究建立的 nested PCR和 sem-i nested PCR方法完全能够满足大豆原油中转基因成分
的检测。
表 2 Nested PCR和 sem-i nested PCR检测大豆油中转基因成分情况
样品名称 样品数(份) 不溶性杂质( % ) 申明 L ec tin基因
( 112bp)
CaM V35S 基因
( 147bp)
CP 4-EPSPS 基因
( 205bp)
大豆原油 15 [ 0. 2 原料为转基因大豆 + + +
大豆原油 2 [ 0. 2 原料为转基因大豆 + - -
大豆原油 1 [ 0. 2 原料为非转基因大豆 + + +
大豆成品油 20 [ 0. 05 原料为转基因大豆 - - -
(一级)
/ + 0代表阳性,检测到该基因/ - 0代表阴性,未检测到该基因
86 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
Nested PCR和 sem-i nested PCR方法对大豆成品油(一级)的检测结果表明(表 2) , 20份申明原料为转
基因大豆的样品均没有阳性条带产生, 即未检测到转基因成分 DNA。同时, 本研究还对这些样品进行了三
级 PCR扩增,即利用 L1/ L2、L1/ L4、L3/ L4三对引物的一轮 PCR和二轮 sem-i nested PCR扩增, 在理论上
其灵敏度可达到 10~ 12 ng /Ll,结果均没有扩增得到特异性阳性条带,这表明, 大豆成品油(一级)中的转基
因成分 DNA 含量已极低,是否有更好的检测方法,有待进一步的研究。
相比普通 PCR而言, nested PCR和 sem-i nested PCR方法具有非常好的重复性和抗干扰性, 对反应体
系和模板 DNA 的要求均不是很苛刻。同时, nested PCR和 sem-i nested PCR具有很高的特异性,其结果一
般不需要再用其它方法检验[ 8] 。但是,由于 nested PCR和 sem-i nested PCR方法的高灵敏特性, 在实际检
测中,一定要规范操作,避免污染, 注意设置阴性对照和空白对照,防止假阳性结果的产生。
参 考 文 献
1 Lipp M, Brodmann P, Piet sch K, et al. Journ al OfAOAC Internat ional , 1999, 82( 4) : 923~ 929.
2 H ur st CD, Knight A Bruce IJ . Moleclar Breeding, 1999, 5: 579~ 586.
3 Pauli U, Liniger M Zimm ermann A. Z Lebensm U ntersForschA, 1998, 207: 264~ 267.
4 Tanzer A. Eppendorf A pplicat ionNotes, 2000, 6: 3~ 4.
5 Khan JA, S rivastava P, Singh SK. Cu rrent Science, 2004, 86( 11) : 1530~ 1533.
6 M ayer CL, Palmer C J. Applied and Environmental M icrobiology, 1996, 62( 6) : 2081~ 2085.
7 Van H oef AMA, Kok EJ, Bouw E, et al . Food Addit ives Contaminants, 1998, 15: 767~ 774.
8 M art in-Sanch ez J, Vis eras J, Adrother FJ, et al. Parasitol Res, 1999, 85: 243~ 245.
(上接第 68页)
并可以研究 RNA 干扰作用途径中的成分及影响因素。总之,利用 RNA 干扰机制干扰内源性 GFP 表达的
体系,为进一步研究 RNAi作用机制及其影响因素奠定了基础。
参 考 文 献
1 H annon GJ. Nature, 2002, 418: 244~ 251.
2 Donald K. Science, 2002, 298: 2283.
3 Gilt in L, Karelsk y S, Andin o R, et al. Natu re 2002, 418: 430~ 434.
4 E lbashir SM , H arb orth J , Lendeckel W , et al. Natu re, 2001, 411: 494~ 498.
5 唐霓,黄爱龙,张秉强,等.中华医学杂志, 2003, 83( 15) : 1309~ 1312.
6 闫歌,黄爱龙,蒲丹,等. 生物化学与生物物理进展, 2004, 31( 9) : 829~ 833.
7 Jam es CC, Victor A. Science, 2003, 301: 336~ 338.
8 M at thew NP, L ena E, Jan K, et al. Nature, 2004, 432: 226~ 230.
9 Vicki V, H erve V. S cien ce, 2001, 292( 22) : 2277~ 2280.
10 H ongw ei L, Wanxiang L, S houw ei D. Science, 2002, 296: 1319~ 1321.
11 Wanxian g L, H on gw ei L, Rui L, et al. Pr oc Nat l Acad Sci U SA , 2004, 101( 5) : 1350~ 1355.
12 Allison CM, Brenda JR, David B, et al . Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99( 23) : 15225~ 15233.
13 Dan iel S, At t ila M , Alessandra L, et al . T he EM BO Journal, 2002, 21( 12) : 3070~ 3080.
14 Sui G, Soohoo C, Af far EIB, et al. Proc Nat i Acad Sci, 2002, 99: 5515~ 5520.
872005年第 6期 闻伟刚等:大豆油中转基因成分的 Nested PCR和 Sem-i nested PCR检测方法研究