全 文 ：· 中药与天然药物·
草多糖的分离纯化及组成分析
段国峰 ,李宝军 ,翟松涛 ,邬瑞斌 (中国药科大学高职院 江苏 镇江 212003)
摘要: 目的　对 草多糖的提取、分离纯化和单糖的组成进行了分析。 方法　 草经热水提取乙醇沉淀得多糖组品 ( HSW ) ,经脱蛋白、透析、
DEAE-纤维素柱和 Seph adex G-100层析进行纯化 ,纯化多糖通过色谱等方法进行分析。 结果　粗多糖主要含 HSW1、 HSW2、 HSW3、 HSW4四
个组分。结论　各组分经高效凝胶色谱、薄层层析、气相色谱等分析得知: HSW1由葡萄糖 ( Glu)、半乳糖 ( Gal)组成 ,其摩尔比为 1. 00∶ 0. 21,
HSW2～ 3均由鼠李糖 ( Rha)、阿拉伯糖 ( Ara)、甘露糖 ( Man)、葡萄糖 ( Glu)、半乳糖 ( Gal) ,其摩尔比分别是 0. 73∶ 0. 99∶ 0. 69∶ 0. 80∶ 1. 00及
0. 51∶ 0. 31∶ 0. 48∶ 1. 00∶ 0. 45, HSW4主要由甘露糖 ( Man)、葡萄糖 ( Glu)、半乳糖 ( Gal) ,其摩尔比 1∶ 0. 42,为 草多糖更深的研究打下了基
础。
关键词: 草 ;多糖 ;分子量 ;组分
中图分类号: R931. 71　文献标识码: A　文章编号: 1006-3765( 2006) 05-0085-03
Separation Purification and Composition Analysis of Polysaccharides From
Humulus scandens(Lour . ) Merr .
DUAN GUO -feng ,LI Bao -jun ,ZHAI Shong -tao ,WU Rui -bing (Altitude Vocat ional School ,China Pharamaceutical
University Jiangsu Zhenjiang 212003,China )
ABSTRACT: OBJECTIVE　 To puri fy and analysis the polysaccharides f rom Humulus scandens ( Lour. ) Merr.
METHODS　 The crude poly saccharides( HSW ) w ere obtained by ex t racting hot w ater and precipitating wi th
alcohol. The cleared HSW were purified by DEAE-cellulose, Sephadex G-100 column, and it w ere analyzed by
ch romatog raphy. RESULTS　 The purified four pro teins ( HSW1～ 4) w ere removed from crude polysaccharides.
CONCLUSION　 Analy sis by. HPGC, T LC and GC, The molecular weights of HSW1～ 4 were 2. 0× 104、 5. 6×
104、 6. 8× 105、 and 1. 4× 106 , respectively. The chemical components and the molar ratio show ed follow s: HSW1
∶ Glu∶ Gal= 1. 00∶ 0. 21; HSW2 S and HSW3 S component w ere. Rha、 Ara、 Man、 Glu、 Gal, the molar ratios
show ed 0. 73∶ 0. 99∶ 0. 69∶ 0. 80∶ 1. 00 and 0. 51∶ 0. 31∶ 0. 48∶ 1. 00∶ 0. 45; All these w ork could establish
foundation for the further study of the Humulus Polysaccharides.
KEY WORDS: Humulus scandens( Lour. ) Merr; Po lysaccharides; molecula r w eight; Com ponent
　　中药 草为桑科植物 草 Humulus scandens ( L our. )
Mer r.的全草。 始载于《新修本草》 ,分布于全国绝大部分地区
(青海、新疆以外 )。味甘、苦 ,性寒。具有清热解毒 ,利尿通淋。
主治肺热咳嗽 ,肺痈 ,虚热烦渴 ,热淋 ,水肿 ,小便不利 ,湿热泻
痢 ,热毒疮疡 ,皮肤瘙痒。 草生命力强 ,资源丰富 ,分布广泛 ,
提示其可能含有免疫成分 , 草民间尚有治疗消渴症的应
用〔1〕 ,但未见有关药理及多糖的研究报道。而多糖一般具有免
疫促进、降糖活性 ,故本实验对其多糖进行研究 ,有一定的意
义。
本文对 草多糖进行了提取纯化及组成研究 , 草脱脂
后经水提、醇析 ,经 DEAE-纤维素和 Sephadex G-100柱层析
得到 HSW1～ 4 4个多糖组分 ,并经高效凝胶色谱、薄层色谱
作者简介:段国峰 ,男 ( 1968-)。硕士 ,讲师。主要从事中药有效成分研
究 ,联系电话: 0511-4448327。 E-mai l: dgf1208@ 163. com
和气相色谱等分析确定 草多糖的分子量及单糖组分 ,为进
一步研究其化学结构和生物活性提供了依据。
1　材料与仪器
1. 1　材料与试剂　 草采集于镇江郊区 ,经本院黄达芳副教
授鉴定为菊科植物 草 Atractylodes lancea ( Th unb. ) DC.的
全草。 干燥粉碎 ,过 40目筛 ,备用。 DEAE纤维素 ( Wha tman
公司 )、 Sephadex G-100、分子量标准品葡聚糖 Dex tranT系列
( Pha rmacia)、单糖标准品 ( Sigma公司 ) ,三氯乙酸等化学试剂
为国产 AR。
1. 2　仪器　 JASCO LC1500高效液相色谱仪 ,日本分光公
司 ; TSK-G4000PW ,日本 TOSOH公司 ; Ava ta r 360红外光谱
仪 ,美国尼高力公司 ; GC-14B气相色谱仪 ,日本岛津公司 ;
N2000色谱处理工作站 ,浙江大学智能研究所 ;紫外可见分光
光度计 ,日本岛津公司 ;恒流泵、自动分部收集器 (上海沪西仪
器厂 ) ;冷冻干燥机 ,德国 Christ公司。
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　 Strait Pharmaceutical Journal Vol 18 No. 5 2006
2　实验方法
2. 1　 草粗多糖的提取　取 草粉末 ( 500g ) ,无水乙醇回流
脱脂 ,残渣晾干后入 10倍量蒸馏水 , 80℃提取 4次 ,合并提取
液 ,真空浓缩至适量。 冰浴条件下进行三氯乙酸脱蛋白 ,离心
除去变性蛋白 ,上清液迅速用 NaO H调至中性 ,浓缩至适量 ,
透析 ,再减压浓缩 ,加 4倍体积的 95%乙醇 ,冰箱冷藏放置过
夜 ,离心收集沉淀 ,沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤 ,挥干乙
醚后 ,复溶于水 ,冷冰干燥。 即得水提粗多糖 HSW。
2. 2　 HSW分离纯化　取 HSW加水溶解 ,以 DEAE-52纤维
素柱 ( 50× 2. 6cm )层析 ,依次用不同浓度的 NaCl溶液洗脱 ,
分别收集洗脱液 (每管 10m L) ,以改良的苯酚 -硫酸法〔7〕跟踪
检测 ,根据洗脱曲线收集。取 0. 02～ 0. 20mol· L- 1 NaCl溶液
洗脱部分 ,透析 ,冷冻干燥 ,再经 Sephadex G-100柱层析 ( 60
× 1. 0cm ) , 0. 1mol· L- 1 NaCl洗脱 ,以改良的苯酚 -硫酸法〔2〕
跟踪测定 ,根据洗脱曲线收集 ,透析 ,并经 HPLC凝胶柱检
测 ,得到较为纯化的 草多糖 HSW1、 HSW2、 HSW3 和
HSW4。
2. 3　 草多糖的分子量测定　色谱条件: JASCO PU-1580
泵 , JASCO RI-1530示差检测器 , TSK-G4000PW色谱柱 ,柱
温 30℃ ,流动相 0. 003mol· L- 1醋酸钠 ,流速为 0. 5ml·
min- 1。
2. 3. 1　标准曲线的制作: 分别称取平均分子量为 2000
KDal, 500 KDal, 70 KDal, 40 KDa l, 10 KDal的 Dex t ran系列
标准葡聚糖 3. 0mg ,用 1m L流动相溶解 , 0. 45μm滤膜过滤
后 ,吸取 20μL注入高效液相色谱中 ,以分子量的对数为纵坐
标 ,以各糖的保留时间为横坐标 ,绘制标准曲线。
2. 3. 2　样品分子量测定: 取纯化后的样品各 3mg与 1m L流
动相溶解 ,按与 Dex tran标准品相同的色谱条件操作 ,求得各
自相应的保留时间 ,按标准曲线计算分子量。
2. 4　 草多糖组成单糖的组分分析
2. 4. 1　红外色谱分析: 分析称多糖各 1mg干燥样品 ,与 KBr
研磨混合后压片 ,采用 Ava ta r 360红外光谱仪扫描分析 ,波
长范围为 4000cm- 1～ 400cm- 1 ,观察 800cm- 1～ 900cm- 1的吸
收峰。
2. 4. 2　多糖的水解: 取 HSW1、 HSW2、 HSW3和 HSW4各
5mg干燥样品 ,加入 2. 0mol· L- 1的 H2 SO4溶液 0. 5mL ,封
管 , 100℃水解 12h,取出 ,加入 BaCO3中和 , 3000rpm离心除
去 BaSO4沉淀 ,上清液冷冻干燥 ,供分析用。
2. 4. 3　薄层色谱分析〔3〕:分别称取 L-鼠李糖、 D-阿拉伯糖、
D-甘露糖、 D-葡萄糖、 D-半乳糖和 D-木糖各 10mg ,分别定容
于 10m L容量瓶中 ,得各单糖标准品溶液。另取各单糖标准品
溶液 1mL等量混合 ,得单糖标准品混合溶液。
取单糖标准品溶液和混合单糖标准品溶液 ,分别点于含
0. 3mo l· L- 1的磷酸二氢钠的硅胶 G板上 ,以丙酮∶水= 24
∶ 1及正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶醋酸∶水∶吡啶 = 7∶
20∶ 12∶ 7∶ 6∶ 7进行二次展开 ,取出 ,晾干后 ,喷苯胺 -邻苯
二甲酸显色 ,计算 Rf值。
样品 HSW1、 HSW2、 HSW3和 HSW4水解液和混合单糖
标准品溶液 ,按相同的方法展开、显色 ,计算各 Rf值并进行样
品与标准品可见光与荧光下的对比。
2. 4. 4　气相色谱分析: 糖腈乙酰的衍生物制备〔4〕　分别称取
标准单糖和多糖水解后的糖样各 10mg ,加入盐酸羟胺 10mg、
内标肌醇 7mg和吡啶 0. 5m L,于 90℃水浴加热 30min并振
荡 ,取出冷却至室温 ,加入醋酸酐 0. 5m L,在 90℃继续加热
30min进行乙酰化 ,产物浓缩至干 ,加入 0. 5mL氯仿溶解 ,溶
液经 0. 45μm滤膜过滤后 ,注入气相色谱进行分析。
色谱条件: DB-5 30000mm× 0. 53mm弹性石英毛细管色
谱柱 ;载气:高纯氮气 ;检测器: 氢火焰离子化检测器 ( FID );
程序升温: 100℃ ( 5℃ /min)→ 190℃ , 190℃ ( 4℃ /min)→ 240℃
( 5min) ;汽化温度 280℃ ;检测器 260℃。
3　结果
3. 1　 草多糖的提取纯化　 草粉末经脱脂、水提、脱蛋白、
醇沉 ,冷冻干燥后得到 HSW多糖组分为 11. 25g ,收率为
2. 25%。 HSW经 DEAE-52纤维素柱层析 ,以改良的苯酚 -硫
酸法跟踪检测 ,得 4个主要组分 HSW1～ 4,再过 Sephadex G-
100凝胶柱纯化 ,以改良的苯酚 -硫酸法跟踪测定 ,收集液经
HPLC凝胶柱检测为单一对称峰。
3. 2　 草多糖的分子量测定　由保留时间 t对标准分子量
的对数做图 ,得标准曲线 Y= 34. 785- 3. 4367X , R= 0. 995,
其中 X为分子量的对数 ( 1gMw ) , Y为保留时间 (见图 1)。
　　 HSW1～ 4的保留时间分别为 20. 012、 18. 473、 14. 763、
13. 713min,代入回归方程得平均分子量分别约为: 2. 0× 104、
5. 6× 104、 6. 8× 105、 1. 4× 106。
3. 2　 草多糖 HSW1、 HSW2、 HSW3和 HSW4单糖的组成
分析
3. 2. 1　多糖中如有甘露糖组分 ,其红外光谱均呈现 810
cm- 1及 870 cm- 1左右的特征吸收峰〔5〕。红外扫描显示 , HSW2
～ 3 草多糖均有该特征吸收峰 ,说明均含有甘露峰组分。
图 1　多糖的标准曲线
3. 2. 2　薄层色谱分析结果: 各标准单糖在薄层板上获得了良
好的分离 ,各标准单糖的 Rf值 (见表 1)。
表 1　各标准单糖的 Rf值
鼠李糖 木糖 阿拉伯糖 甘露糖 葡萄糖 半乳糖
Rf值 0. 83 0. 50 0. 33 0. 28 0. 23 0. 12
　　通过各单糖标样斑点与 草多糖水解所得单糖斑点的颜
色和 Rf值比对 ,确定 草多糖样品中的单糖组成。结果表明 ,
草多糖纯化得 HSW1主要由 Glu、 Gal组成 , HSW2～ 3主要
由 Rha、 Ara、 Man、 Glu、 Gal组成 ; HSW4主要由 Man、 Gal组
成。
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海峡药学　 2006年　第 18卷 第 5期　
图 2　标准单糖乙酰化物的 GC图
1. 鼠李糖 ( Rha)　 2. 阿拉伯糖 ( Ara)　 3. 木糖 ( Xyl)　 4. 甘露糖
( Man )　 5.葡萄糖 ( Glu)　 6. 半乳糖 ( Gal)　 7.肌醇 ( Inosi tol)
图 3　 草多糖 HSW1乙酰化物的 GC图
5. 葡萄糖　 6. 半乳糖 ( Gal)　 7.肌醇 ( Inosi tol)
3. 2. 3　气相色谱分析结果: 标准单糖及 草多糖 HSW1、
HSW2、 HSW3、 HSW4的气相色谱 (见图 2～ 6)。 由色谱图可
以看出各单糖在此色谱条件下获得了良好的分离。
图 4　 草多糖 HSW2乙酰化物的 GC图
1. 鼠李糖 ( Rha)　 2. 阿拉伯糖 ( Ara)　 4. 甘露糖 ( Man)　 5. 葡萄
糖 ( Glu)　 6.半乳糖 ( Gal)　 7. 肌醇 ( Inositol )　　根据各标准单糖的气相色谱图确定各单糖的保留时间和
响应因子 (见表 2)。
表 2　标准单糖、内标糖腈乙酰化物结果分析表
Rha Ara Xyl Man Glu Gal Inositol
保留时间 15. 86 16. 19 16. 46 20. 71 20. 98 21. 43 23. 68
响应因子 1. 15 0. 78 0. 98 0. 83 1. 27 1. 33 1
　　多糖的气相色谱通过与标准单糖的保留时间和响应因子
对比确定糖的种类和摩尔比。 结果表明 , HSW1由葡萄糖
( Glu)、半乳糖 ( Gal)组成 ,其摩尔比为 1. 00∶ 0. 21, HSW2、
HSW3主要由鼠李糖 ( Rha )、阿拉伯糖 ( Ara )、甘露糖 ( Man)、
葡萄糖 ( Glu)、半乳糖 ( Gal) ,其摩尔比分别为 0. 73∶ 0. 99∶
0. 69∶ 0. 80∶ 1. 00和 0. 51∶ 0. 31∶ 0. 48∶ 1. 00∶ 0. 45,
HSW4主要由甘露糖 ( Man)、葡萄糖 ( Glu)、半乳糖 ( Gal) ,其
摩尔比 1∶ 0. 42。
图 5　 草多糖 HSW3乙酰化物的 GC图
1. 鼠李糖 ( Rh a)　 2. 阿拉伯糖 ( Ara)　 4. 甘露糖 ( Man)　 5. 葡萄
糖 ( Glu)　 6. 半乳糖 ( Gal)　 7. 肌醇 ( Inosi tol)
图 6　 草多糖 HSW4乙酰化物的 GC图
4. 甘露糖 ( Man)　 6. 半乳糖 ( Gal)　 7. 肌醇 ( Inosi tol)
4　讨论与小结
4. 1　 Sevag法、三氯乙酸法最常用于多糖的脱蛋白 , Sevag法
对多糖影响较小 ,但是操作次数多 ,且有氯仿等有毒溶剂的使
用 ;对于植物多糖 ,本实验中的三氯乙酸法 ,控制在冰浴条件
下 ,具有操作简便、效率高的优点。
4. 2　在分子量的测定中 ,由于多糖分子的组成及空间结构的
不同 ,以葡聚糖为对照所得的分子量并非是分子量的绝对值 ;
而且温度对示差器检测有一定的影响。
4. 3　多糖的红外光谱 , 730～ 960 cm- 1数据特别有意义 ,不仅
可以区别α及 β型吡喃环 ,而且多糖中有甘露糖组分的 ,均呈
现 810cm- 1及 870cm- 1特征吸收峰。气相中糖腈乙酸酯法 ,具
有制备简单、试剂易得的优点 ,且每种糖能得到单一的色谱
峰 ;另外对反应物浓缩至干 ,加入适量氯仿可有效减少溶剂峰
的拖尾。
4. 4　本实验初步弄清了 草多糖的分子量及各自单糖组成 ,
为 草多糖的进一步结构分析和活性研究提供了基础。
参考文献
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