全 文 ：喜树叶黄酮的微波辅助提取、分离纯化
及抗氧化活性研究
朱冬雪1,2， 顾采琴1， 柯德森2
（1.广州大学化学化工学院， 广东 广州 510006； 2.广州大学生命科学学院， 广东 广州 510006）
摘 要：以喜树叶为原料，研究了黄酮的微波辅助提取工艺参数，提取液中黄酮的分离、纯化及抗氧化活性。结果表明，微波辅
助提取喜树叶黄酮的最优工艺参数为：料液比 1∶70、乙醇浓度 30%、微波时间 5 min，在此条件下，黄酮得率 2.47%，提取率 92.4%。
提取物经大孔树脂和不同浓度的乙醇分离纯化后，确定最适宜的乙醇洗脱浓度为 30%，黄酮纯度最高可达 79.83%，其抗氧化效果
最好，过氧化值（POV 值）明显低于对照。 不同纯度的黄酮对羟基自由基的清除率也随添加量的增加明显增强，最高达 80%。
关键词：喜树叶； 黄酮； 微波辅助提取； 分离纯化； 抗氧化性活性
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2011）24-0087-03
Study on extraction, separation, purification and antioxygenation
of flavones from Camptotheca acuminata by microwave
ZHU Dong-xue1,2， GU Cai-qing1， KE De-sen2
(1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China；
2.School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China）
Abstract: The optimal technology of flavonoid extraction from Camptotheca acuminata leaf by microwave, separation, purification and
it’s antioxygenation were studied. The results showed that the best technical parameter for flavonoid extraction could be obtained with
ratio of raw materials and solution as 1 ∶70, 30% alcohol and extraction period for 5 min, which flavonoid production rate was 2.47%,
extracting rate was 92.4%. The best flavonoid production with 79.83% purification degree was obtained by separating and purification the
flavonoid extract with big hole resin and 30% ethanol. All purified flavonoid production displayed antioxygenation, the POV value were
lower than control obviously and scavenging hydroxyl radical·OH with 80%.
Key words: Camptotheca acuminata leaf； flavonoids； microwave extraction； separation and purification； antionxygenation
喜树（Camptotheca acuminata Decne）是我国特有树
种，主要分布于我国长江流域及以南地区，为我国阔叶树
中的珍品之一，具有很高的观赏价值，是绿化、美化环境
的优良绿荫树和风景树， 也是广东省主要的生态树种之
一 [1]。 目前对喜树的开发利用仅限于提取抗癌药物喜树
碱 [2]，其资源没有得到充分利用，特别对叶子的开发利用
较少。
大量研究显示，黄酮类化合物具有抗肿瘤、护肝、抗
炎、抗病毒、调节内分泌系统等功效，同时还能抑制脂质
过氧化作用、血小板凝集、毛细管渗透性以及脆性等[3]。 本
课题组前期研究表明， 喜树叶黄酮含量高达 2.5%～2.7%
（以干重计），与银杏黄酮含量接近 [4]。 而目前对喜树叶黄
酮的研究仅见少量的提取工艺方面的报道 [5-7]，对喜树黄
酮的分离、 纯化及其抗氧化活性研究迄今未见报道。 因
此，对喜树叶黄酮进行提取、分离纯化及功能性的研究和
探讨对开发喜树叶资源具有一定的研究价值和现实意
义。
本研究报道了利用微波辅助技术提取喜树黄酮工
艺、 采用大孔树脂及乙醇对黄酮提取物进行分离纯化以
及纯化后黄酮产品的抗氧化活性， 以期对喜树叶资源的
开发利用及提高其附加值提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验原料： 喜树叶采自广州华南植物园， 经清洗、烘
干、粉碎备用。
主要试剂：芦丁（生化试剂，上海生化试剂二厂)，其他
试剂均为分析纯。
主要仪器与设备：UV-1800 型紫外分光光度计（日本
松下），NJL07-3 型实验专用微波炉（南京杰全微波设备有
限公司），R206D 型旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）
等。
1.2 试验方法
1.2.1 喜树叶黄酮的微波提取 准确称取一定量喜树叶
粉于 500 mL 微波专用烧瓶中， 加入 250 mL 不同浓度的
乙醇溶液，搅匀，放入微波炉中加热一定时间，取出过滤，
得到提取液。
1.2.2 黄酮含量的测定 标准曲线的绘制：参照文献[8-9]
的方法，以芦丁为标样。 分别取芦丁标样液（1 mg/mL）0、
50、100、150、200、250 μL，加入 50%乙醇至 2.5 mL，加入
5% NaNO2 0.150 mL，静置 6 min；加入 10% Al (NO3)3 0.15
mL， 静置 6 min； 加入 4% NaOH 2 mL。 15 min 后于 510
nm 处测定吸光度。 以芦丁质量浓度（μg/mL）为横坐标、吸
光度为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线回归方程为：Y=
收稿日期：2011-11-05
基金项目：广州市教育局科技计划项目（08C036）
作者简介：朱冬雪(1962-)，男，硕士，副教授，E-mail：zhudongxue
@163.com
广东农业科学 2011 年第 24 期 87
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2011.24.005
C（料液比，g/mL）
1∶50
1∶60
1∶70
B（乙醇浓度，%）
20
30
40
A（提取时间，min）
4
5
6
水平
1
2
3
表 1 喜树黄酮微波辅助提取正交试验因素水平
因素
黄酮提取
率（%）
80.43
88.74
90.88
92.41
87.01
88.67
88.37
90.71
87.49
黄酮含
量（%）
2.15
2.37
2.43
2.47
2.33
2.37
2.36
2.43
2.34
空列
1
2
3
1
2
3
1
2
3
261.21
266.46
267.04
87.07
88.82
89.01
5.83
C（料液比，
g/mL）
1
2
3
3
1
2
2
3
1
254.93
265.78
274.00
84.97
88.59
91.33
19.07
B（乙醇浓
度，%）
1
2
3
2
3
1
3
1
2
259.81
268.64
266.26
86.60
89.54
88.75
8.83
A（提取时
间，min）
1
1
1
2
2
2
3
3
3
260.05
268.09
266.57
86.68
89.36
88.85
8.04
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
k1
k2
k3
R
表 2 喜树叶黄酮提取正交试验结果
12d
2.92
2.85
2.67
2.76
2.79
2.94
3.83
10d
2.56
2.41
2.39
2.47
2.51
2.67
3.44
8d
1.92
1.78
1.69
1.84
1.89
1.97
2.91
6d
1.38
1.28
1.21
1.32
1.41
1.57
2.33
4d
0.68
0.62
0.59
0.64
0.78
0.88
1.79
2d
0.44
0.43
0.42
0.46
0.49
0.53
0.94
黄酮含量
（%）
67.26
72.52
79.83
69.93
61.31
53.44
乙醇浓度
（%）
10
20
30
40
50
60
对照
表 3 不同浓度乙醇洗脱纯化的喜树叶黄酮含量及抗氧化活性比较
不同贮藏天数的 POV 值（%）
382.65X-1.1474，相关系数 r2=0.999。
喜树叶黄酮含量的测定： 准确称取 2.0 g 喜树叶粉
末，分别装入 200 mL三角瓶中，加入 80%的乙醇 60 mL，
摇匀后在 70℃恒温振荡水浴锅内加热提取 1.0 h， 过滤，
滤渣重复提取 2次，合并滤液并定容至 200 mL。取提取液
200 μL，按黄酮标准曲线的制作方法进行测定，并计算黄
酮含量。
提取液和纯化液中黄酮含量的测定：按照标准曲线的
测定方法，取相同体积的样液进行测定。
黄酮提取率 （%）=提取液中黄酮含量/喜树叶黄酮含
量×100
1.2.3 试验设计 喜树黄酮微波辅助提取单因素试验：影
响因素确定为提取时间、乙醇浓度和料液比。 提取时间设
3、4、5、6、7 min 共 5 个水平；乙醇浓度设 10%、20%、30%、
40%、50%共 5个水平；料液比设 1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、
1∶100共 6个水平。
正交试验：根据单因素试验结果，将提取时间、乙醇浓
度、料液比作为 3因素，每个因素取 3个水平，即按三因素
三水平 L9（34）进行正交试验。 具体因素水平见表 1。
1.2.4 黄酮的分离、 纯化 按照固液比 1∶70 加入 30%的
乙醇， 搅拌均匀后放入专用微波炉，650 W 加热至 70℃，
保温 10 min， 趁热用滤布过滤， 冷却后真空浓缩除去乙
醇，取浓缩的提取液以设定的流速经过装填有 AB-8 大孔
树脂的层析柱进行吸附，待柱层析树脂吸附饱和后，用水
洗至流出液无色，然后用 10%~60%的乙醇进行梯度洗脱，
收集洗脱液，于旋转蒸发器中减压浓缩，真空干燥得黄酮
产物。
1.2.5 总抗氧化性测定 采用烘箱储藏法， 将纯化后的
喜树叶黄酮产物配成 2 mg/mL 的溶液，取 3 mL 加入 60 g
纯猪油中，以纯猪油为空白，置于 60℃左右的烘箱强化培
养，每隔 2 d 取样，按照 GB/5009.37-1996 [10]碘量法测定
油脂的过氧化值（POV 值），并以 POV 值的大小表示油脂
的氧化速度以衡量喜树叶黄酮的抗氧化作用。
1.2.6 羟自由基清除率的测定 参照文献[11]的方法，在
50 mL 比色管中依次加入 2 mmol/L 的 FeSO4 1.5 mL，1
mmol/L 的 H2O2 1.5 mL， 摇匀后加入 6 mmol/L 的水杨酸
1.5 mL，摇匀，于 37℃水浴加热 15 min，取出，以蒸馏水为
空白液，测其吸光度 A0。 将纯化后的喜树叶黄酮产物配成
1 mg/mL 的溶液，然后加入 0.2 mL 此溶液，按相同的方法
测其吸光度 Ax，计算清除率为：
羟自由基清除率(％)=(A0-Ax)/Ao×100
式中，A0为反应体系原来的吸光度，Ax为加入提取液后的
吸光度。
2 结果与分析
2.1 微波辅助提取喜树叶黄酮工艺参数的优化
经测定，喜树叶中黄酮含量为 2.68%（以干重计）。 以
提取液的黄酮含量和黄酮提取率为考核指标， 在单因素
试验的基础上， 进行了三因素三水平的正交试验，比较了
提取时间、乙醇浓度和料液比极差值（R）的大小。 由表 2
可知，极差最大的为 C因素（料液比），其次为 B因素(乙醇
浓度)和 A 因素（提取时间），说明料液比对喜树叶黄酮提
取率的影响最大，其次为乙醇浓度和提取时间。 根据正交
试验结果， 喜树叶黄酮提取工艺最佳组合条件为 A2B2C3，
即提取时间 5 min、乙醇浓度 30%、料液比 1∶70。 在此条件
下黄酮提取率达到 92.41%。
2.2 喜树叶提取物中黄酮的分离、纯化及抗氧化活性
采用大孔树脂和不同浓度的乙醇作为洗脱液对喜树
叶黄酮粗提物进行层析分离和纯化处理， 获得了不同黄
酮含量的产品，结果见表 3。 由表 3可知，30%乙醇洗脱获
得的产品中黄酮含量最高，达 79.83%，60%乙醇洗脱所得
产品中黄酮含量最低，只有 53.44%，说明洗脱所用乙醇的
浓度以 30%最适宜。
88
80
70
60
50
40
30
20
10
0
清
除
率
（ ％
）
10 20 30 40 50 60
乙醇浓度（%）
图 1 不同浓度乙醇纯化的喜树叶黄酮对羟基自由基的清除率
90
80
70
60
50
40
30
20
10
00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
添加量（mg）
图 2 纯化黄酮不同添加量对羟基自由基的清除率
清
除
率
（ ％
）
从表 3可以看出，不同浓度乙醇洗脱出来的黄酮产品
添加到猪油中后，POV 值都比对照的低，说明不同浓度乙
醇洗脱得到的喜树叶黄酮都具有明显的抗氧化效果，与
对照差异显著； 同时 30%乙醇洗脱的黄酮含量最高，POV
值最低， 说明 30%乙醇洗脱的黄酮抗氧化效果最好，60%
乙醇洗脱的黄酮含量最低，其 POV 值最高，说明抗氧化效
果最差。由此可见，30%乙醇是分离、纯化喜树叶黄酮最佳
的洗脱溶剂。
2.3 纯化黄酮对羟基自由基的清除作用
由图 1可知，不同浓度乙醇洗脱所得的纯化黄酮产品
对羟基自由基都有明显的清除效果， 其中 40%乙醇洗脱
的黄酮对羟基自由基的清除作用最大， 10%乙醇洗脱的
黄酮清除作用最小， 前者的清除率是后者的 1倍多。 由
此可见，40%乙醇洗脱得到的喜树叶黄酮产品具有较强的
清除羟基自由基的能力。
2.4 纯化黄酮不同添加量对羟基自由基的清除作用
由图 2 可知，随着纯化黄酮添加量的增加，其对羟基
自由基的清除作用逐渐增强， 增加幅度随添加量的增加
有所降低， 说明喜树叶黄酮对羟基自由基的清除作用与
使用量有关。
3 结论与讨论
通过单因素和多因素正交试验， 优化了喜树叶黄酮
的微波提取工艺， 结合经济合理性的考虑，确定最佳提取
条件为：微波时间 5 min、乙醇浓度 30%、料液比 1∶70，此
提取工艺使喜树叶黄酮提取率高达 92.41% ， 产率为
2.47%，比用喜树果得到的黄酮产率高 1 倍多 [7]；同时本研
究优化的提取工艺比传统的提取方法省时、节能 [5-6]，与超
声-微波法提取喜树果中黄酮的时间接近 [7]。
采用 AB-8 大孔树脂和不同浓度的乙醇作为洗脱液
对喜树叶黄酮粗提物进行层析分离和纯化，30%乙醇是分
离、纯化喜树叶黄酮最佳的洗脱溶剂，可使纯化后的产物
黄酮含量高达 79.83%， 与采用相同方法纯化杭白菊黄酮
的纯度接近[12]。纯化后的喜树黄酮产品具有较强的抗氧化
作用和清除羟茎自由基的活性， 尤其是 30%乙醇和 40%
乙醇洗脱得到的黄酮产品表现最好。
综上所述，本研究优化得到的微波辅助提取、分离、纯
化喜树叶黄酮的工艺具有节能、高效、操作简便、成本低等
优点， 同时得到的黄酮还具有较强的抗氧化和清除羟基
自由基的作用，因此其可开发成为无毒、安全的天然抗氧
化剂，具有较好的开发应用前景。 本研究结果为喜树叶资
源的开发利用提供了科学依据。
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