全 文 ：doi:10.3969/ j.issn.1005-8141.2013.03.003
星点设计 ———响应面法优化 草黄酮的提取工艺
陆　波 ,李玲玉 ,焦娟娟 ,赵梓氵育 ,刘丹楹 ,刁立超 ,张崇禧
(山东大学(威海)海洋学院 ,山东威海 264209)
　　摘要:为了探究并优化 草中黄酮的提取工艺 ,在单因素实验的基础上 , 采用星点设计—响应面法设计实验 , 最终确定了 草
黄酮的最优提取工艺。回归分析和实验结果表明 ,最佳提取工艺为∶乙醇浓度=72%、料液比(W/V)=1∶28、提取时间=1.2h ,实际
黄酮/生药提取率为 2.64235。该方法优于现有的提取方法 ,得到的工艺条件具有实际应用价值。
关键词: 草;黄酮;优化提取;响应面;星点设计
中图分类号:　　文献标志码:A　　文章编号:1005-8141(2013)03-0230-03
Optimization of Extraction Process of Flavone from Humulus Scandens(Lour.)Merr Response Surface Methodology
LU Bo , LI Ling-yu , JIAO Juan-juan , ZHAO Zi-yu , LIU Dan-ying , DIAO Li-chao , ZHANG Chong-xi
(Marine College , Shandong University at Weihai ,Weihai 264209 , China)
Abstract:In order to explore and optimize the extraction process of Humulus scandens(Lour.)Merr flavone , on the basis of single factor experi-
ments , this paper used the response surface methodology for design of experiments to determine the final optimal extraction process of the flavone.The
optimum extraction condition were found:Ethanol concentration=72%, liquid ratio(W/V)=1:28 , extraction time=1.2h , the actual flavone/ crude
drug extraction rate was 2.64235.This method was superior to the existing extraction method , and had actual value.
Key words:Humulus scandens(Lour.)Merr;flavone;optimization extraction;response surface;central composite design
　　收稿日期:2013-01-17;修订日期:2013-02-14
基金项目:山东大学(威海)科技立项项目(编号:SRTPA12040)。
第一作者简介:陆波(1991-),男 , 山东省平邑人 , 本科 ,研究方向
为天然药物品质评价。
通讯作者:张崇禧(1954-),男 ,吉林省长春人 ,博士 ,教授 ,硕士生
导师 ,执业药师 ,研究方向为药用动植物功能食品开发利用及新药研
究 ,天然药物品质评价和质量标准制定。
　　 草为桑科植物 草[ Humulus scandens(Lour.)
Merr]的全草 ,一年生或多年生草本植物 ,别名很多 ,主
要有拉拉秧 、拉拉藤 、锯子草 、五爪龙 、降龙草等 ,始载
于《唐本草》[ 1] 。 草的生命力很顽强 ,资源丰富 ,广泛
分布于全国(除青海 、新疆以外)各地区[ 2] ,日本 、朝鲜 、
北美洲等也有分布 。 草具有清热解毒 、利尿消肿等
功效 ,可用于治疗肺结核潮热 、胃肠炎 、痢疾 、淋证 、痔
疮 、小便不利 、皮肤瘙痒等症。
据报道 , 草全草含有青兰苷 、天门冬素 、挥发油 、
鞣质及树脂 , 草叶含有木犀草素葡萄糖苷 、大波斯菊
苷 、牡荆素等黄酮类成分[ 3 ,4] 。在研究草提取物的抗
菌作用时发现 ,其水提取液对革兰阳性菌具有较强的
抗菌活性 ,并证实抗菌作用与草中所含的黄酮类成分
有关。据已有的报道 ,不同月份的 草中含有黄酮的
量不同。本实验采用了黄酮含量最高的 9月份的 草
进行提取[ 5 ,6] 。本研究通过单因素试验 、正交响应面
优化试验考察了乙醇体积分数 、溶剂用量 、提取时间三
因素对草中总黄酮提取率的影响 ,建立紫外可见分光
光度法测定 草总黄酮量的方法 ,从而为合理开发利
用 草资源提供科学依据 。
1　实验材料与实验仪器
1.1　实验材料
草采自山东大学(威海)校园 ,经韩晓弟副教授
鉴定为桑科 草属 草;乙醇 、亚硝酸钠 、氢氧化钠 、硝
酸铝 、芦丁对照品(上海金穗生物科技有限公司),均为
国产分析纯。
1.2　实验仪器
电热鼓风干燥箱(杭州汇尔仪器设备有限公司),
分析天平(上海楚柏实验室设备有限公司),SWB 5200
型超声清洗机(上海必能信超声有限公司),RE-52AA
旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),DK-8AD电热恒
温水槽(上海精密仪器仪表有限公司), 752型紫外可
见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。
2　实验方法
2.1　标准曲线绘制
精密称取干燥至恒重的无水芦丁 20mg , 置入
100mL的容量瓶中 ,加入 60%的乙醇至刻度 ,摇匀 ,即
得0.20mg/mL 对照品溶液[ 7] 。精密吸取该对照品溶
液0 、4mL 、8mL 、12mL 、16mL、20mL 分别置于 50mL的容
量瓶中 ,加入 5%亚硝酸钠溶液 2.0mL 摇匀 , 放置
6min;加入 10.0%的硝酸铝溶液 2.0mL , 摇匀 , 放置
6min;加入 4%的氢氧化钠溶液 20.0mL ,用 60%的乙醇
稀释至刻度 ,摇匀 ,静置 10min。
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2.2　供试样品液的制备
精确称取干燥且经粉碎的 草 10g ,于 80℃温度
下在一定量的乙醇中提取一定时间 ,回流提取 2次;过
滤 ,合并提取液 ,回收乙醇 ,水浴蒸干 , 70℃干燥 3h ,干
燥器中冷却即得浸膏。取 草浸膏 ,加入 60%乙醇 ,
超声助溶 ,定容于 50mL 的容量瓶中 , 3000r/min 离心
15min ,精密吸取上清液 1.00mL ,按标准曲线制备项下
处理测定黄酮含量。
2.3　 草黄酮提取的单因素实验
乙醇浓度对 草黄酮提取率的影响:分别精确称
取干燥且经粉碎的 草 10g , 选择体积分数为 45%、
55%、65%、75%、85%、95%的乙醇 ,料液比为 1∶20 ,在
80℃下回流提取 2次 ,每次提取 2h。提取液按照以上
方法处理测定黄酮的提取率。
料液比对 草黄酮提取率的影响:分别精确称取
干燥且经粉碎的 草 10g ,选择料液比为 1∶1 、1∶10 、
1∶20 、1∶30 、1∶40 、1∶50 的 75%乙醇 ,在 80℃下回流提
取2次 ,每次提取 2h。提取液按照以上方法处理测定
黄酮的提取率。
提取时间对 草黄酮提取率的影响:分别精确称
取干燥且经粉碎的 草 10g ,选择 75%的乙醇 ,料液比
为1∶20 ,在 80℃下回流提取 2次 ,每次提取时间分别
为0.5h 、1h 、2h 、3h 、4h 。提取液按照以上方法处理测定
黄酮的提取率。
2.4　响应面法对 草提取条件进行优化
综合单因子实验结果 ,选取乙醇体积分数 、料液
比 、提取时间三个因素 ,根据 Box -Benhnken 的中心组
合实验设计原理 ,采用响应面法在三因素三水平上对
草黄酮提取工艺进行优化[ 8-10] ,结果见表 1。
表 1　响应面分析因素及水平
因素 水平-1 0 1
A 乙醇浓度(%) 55 75 95
B料液比(W/V) 1∶10 1∶20 1∶30
C提取时间(h) 1 2 3
3　结果及分析
3.1　标准曲线的绘制
在512nm 处测定吸光度(图 1)。以浓度为纵坐
标 ,吸光度值为横坐标进行线性回归 ,得回归方程为:
A=11.18C-0.0017 ,A 为吸光度 , C 为对照品芦丁浓
度(mg/mL),R2=0.9998。结果表明 ,该标准曲线线性
关系良好 。
3.2　 草黄酮提取的单因素实验
乙醇浓度对 草黄酮提取率的影响:固定料液比 、
提取时间 、提取次数和温度等因素 ,分多次提取研究乙
醇浓度对 草黄酮提取得率 ,实验结果见图 2。结果
显示 ,乙醇为 75%时 ,黄酮的提取量最大。在此基础
上随着乙醇量增大 ,黄酮提取量显著减少 。考虑到提
取效果和产物得率 ,乙醇浓度选取 75%为宜。
图 1　标准曲线与回归方程
图 2　乙醇浓度对 草黄酮提取率的影响
料液比对 草黄酮提取率的影响:固定乙醇浓度 、
提取时间 、提取次数 、温度等因素 ,分多次提取研究料
液比对 草黄酮提取得率 ,实验结果见图 3。从图 3
可见 ,料液比为 1∶20时 ,黄酮的提取量最大;低于 1∶20
时随着料液比的增加 ,黄酮提取量增加;超过 1∶20时 ,
随着乙醇量的增大 ,黄酮提取量趋于平稳 ,说明料液比
为1∶20时的黄酮已基本提取完毕 。考虑到提取效果
和节省资源 ,料液比为 1∶20为宜。
图 3　料液比对 草黄酮提取率的影响
提取时间对 草黄酮提取率的影响:固定乙醇浓
度 、料液比 、提取次数及温度等因素 ,分多次提取研究
提取时间对 草黄酮提取得率 ,实验结果见图 4。结
果显示 ,在提取时间为2h左右时 ,黄酮的提取量最大。
从0.5—2h ,随着提取时间的增加 ,黄酮的提取量也持
续增加 。但超过 2h后 ,黄酮的提取量反而有所下降。
考虑到提取效果和节省资源 ,提取时间为2h为宜。
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资源开发与市场 Resource Development &Market 2013 29(3)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　·实验与技术·
图 4　提取时间对 草黄酮提取率的影响
3.3　正交试验设计 草黄酮提取工艺
在单因素实验结果基础上 ,以 A=乙醇浓度 、B=
料液比(W/V)、C=提取时间(h)为自变量 ,以 草黄
酮提取得率为响应值 R ,进行响应面分析实验优化
草黄酮提取工艺 ,实验结果见表2 。
表 2　响应面分析方案及实验结果
实验号 A乙醇浓度(%) B料液比(W/V) C提取时间(h) R 草黄酮提取得率
1 95 1∶20 1 1.86355
2 95 1∶10 2 1.55675
3 95 1∶20 3 1.42695
4 95 1∶30 2 1.71015
5 55 1∶20 3 2.43585
6 55 1∶20 1 2.50665
7 55 1∶10 2 2.34735
8 55 1∶30 2 2.64235
9 75 1∶10 3 2.17035
10 75 1∶30 1 2.67775
11 75 1∶10 1 2.62465
12 75 1∶30 3 2.32375
13 75 1∶20 2 2.76625
14 75 1∶20 2 2.76035
15 75 1∶20 2 2.76035
　　表中 15个实验点分为析因点和零点 ,实验 1—12
为析因实验 , 13—15为中心实验 ,即零点实验重复 3
次 ,用以估计实验误差。采用 SPSS Statistics 17程序对
所得数据进行ANOVA分析 ,结果见表 3 、表 4。
表 3　响应面二次模型的方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Prob>F
Model 2.92 9 0.32 84.15 < 0.0001
A-A 1.42 1 1.42 369.17 < 0.0001
B-B 0.054 1 0.054 13.90 0.0136
C-C 0.22 1 0.22 56.11 0.0007
AB 5.013E-003 1 5.013E-003 1.30 0.3059
AC 0.033 1 0.033 8.67 0.0321
BC 2.515E-003 1 2.515 E-003 0.65 0.4560
A 2 1.090 1 1.09 283.89 < 0.0001
B 2 0.087 1 0.087 22.60 0.0051
C 2 0.094 1 0.094 24.37 0.0043
Residual 0.019 5 3.856E-003
Lack of Fit 0.019 3 6.420 E-003 553.25 0.0018
Pure Error 2.321E-005 2 1.160E-005
Cor Total 2.94 14
表 4　模型的可信度分析
因素 值 因素 值
标准差 0.062 复相关系数 0.9934
变异系数 2.69 较正相关系数 0.9816
PRESS 0.31 信噪比 27.253
　　3 个因子经过拟合得到的回归方程为∶R=2.76
-0.42A +0.082B -0.16C +0.035AB -0.091AC
+0.025BC-0.54A2-0.15B2-0.16C2 。分析表 3中的
回归分析数据 , “Model”项和“Lack of Fit”项的 Prob>F
值小于 0.05 ,说明方程回归性显著 ,使用建立的回归
方程模拟三因素三水平实验结果分析是可行的。分析
表中的P 值可知 ,A 、B 、C 、AC 、A 2 、B 2 、C 2项对 草黄
酮提取率的影响显著 ,三因素对结果的影响由大到小
为:乙醇浓度>提取时间>料液比 ,二次项对结果有较
大影响 ,交互项影响相对较小 ,各因素对响应值的影响
不是简单的线性关系 。
图5—7直观地给出了各个因子交互作用的响应
面的 3D和等高线分析图。由Statistics17软件分析 ,使
响应值 R取最大值时因素 A 、B 、C 对应的编码值分别
为A=-0.13 、B=0.78 、C=-0.78 ,与其对应的提取
条件为:乙醇浓度=72.4%,料液比(W/V)=27.8 ,提
取时间 =1.22h , 理论上最大的黄酮/生药提取率为
2.79003。
图 5　R=f(A , B)的响应面和等高线分析图
图 6　R=f(A ,C)的响应面和等高线分析图
(下转第 236页)
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·实验与技术·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　资源开发与市场 Resource Development &Market 2013 29(3)
差异却呈现出扩大的趋势 。
我国区域碳生产率的总体分布差异主要是由地区
内差异引起的 ,而地区内差异又主要来自东部地区差
异。地区间差异贡献率较小 ,保持在 20%左右 ,但近
年来呈上升趋势 ,表明东 、中 、西部地区的差异总体上
在不断扩大 ,对未来我国碳生产率差异的变化趋势会
产生重要影响。经济发展水平 、资源禀赋 、产业结构和
能源消费结构的地域差异性 ,决定了地区碳排放量和
碳生产率的差异性。为了实现我国 2020年减排目标 ,
必须制定相应的地区政策 。对东部经济发展水平较高
的地区 ,应做好产业结构升级换代 ,淘汰落后产能;加
大研发投入 ,提高能源利用效率 ,降低产品能耗;逐步
降低高耗能行业的比重 ,积极发展现代服务业 。对能
源禀赋条件较好 、节能潜力较大 ,但经济发展水平较低
的中西部地区要进行产业结构优化 ,建议加大财政转
移支付力度 ,避免这些地区依靠高能耗来换取经济总
量的增长。同时 ,应进一步改革和完善能源消费税收
政策 ,使能源价格能够反映能源开发利用及环境治理
成本。通过财政及税收手段 ,鼓励地区发展资源节约
型 、环境保护型产业 ,以实现国家的产业政策导向 。
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(上接第 232页)
为验证方法的可行性 ,同时考虑到实际生产操作
的便利 , 采用实验条件为:乙醇浓度 =72%、料液比
(W/V)=1∶28 、提取时间=1.2h进行验证实验 ,平行 5
组 ,同时与中心点实验组做对照。结果表明 ,实际黄酮
/生药提取率为 2.64235 ,对照组为 2.76035 ,与理论值
相差 0.13258 ,与对照值相差 0.118 ,因此使用响应面
法优化牡蛎粗多糖提取工艺是可行的 ,得到的工艺条
件具有实际应用价值 。
图 7　R=f(B ,C)的响应面和等高线分析图
4　结论
本文实验选取乙醇浓度 、料液比 、提取时间三个因
素 ,采用芦丁标准溶液法并经星点设计实验最终确定
了 草黄酮的最优提取工艺。实验结果表明 ,三因素
的二次项对提取率有较大影响 ,交互项影响相对较小 ,
各因素对于提取率的影响不是简单的线性关系。回归
分析和实验结果表明 ,最佳提取工艺为:乙醇浓度=
72%、料液比(W/V)=1∶28 、提取时间=1.2h ,实际黄
酮/生药提取率为 2.64235。该方法优于现有的提取方
法 ,得到的工艺条件具有实际应用价值 。
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