全 文 ：论　　著
蛇葡萄根对 ConA诱导小鼠肝损伤模型
Fas抗原表达的影响*
张赤志 1　李之清1　张亚兵 2
1湖北中医学院肝病研究所 ,武汉　 430061
2武汉大学中南医院中医科 ,武汉　 430070
　　摘要　目的: 探讨蛇葡萄根对刀豆蛋白 A( Con A)诱导小鼠肝损伤模型肝组织 Fas抗原表达的影响。方法:采用
ConA诱导建立小鼠肝损伤模型 ,与地塞米松对照 ,观察蛇葡萄根高、中、低剂量组对小鼠肝脏病理变化和肝组织中
Fas抗原表达的影响。 结果: 蛇葡萄根高、中剂量组可减轻肝脏病理变化 ,减少肝细胞 Fas抗原表达 ,与地塞米松组
比较差异无显著性意义。 结论: 蛇葡萄根可通过抑制肝细胞 Fas抗原表达来阻断肝细胞凋亡的发生。
　　关键词　蛇葡萄根 ;　刀豆蛋白 A;　 Fas抗原
　　中图分类号　 R282. 71; R575
Effects of Ampelopsis Brevipedunculata Trautv on Fas Antigen
Expression in Liver Tissue of Micc Liver Injury Models
Induced by Concanaval in A( ConA)
Z HAN GChizhi , LI Zhiqing, Z HANG Yabing
Liver Diseases Research Insti tute of Hubei College of TCM , Wuhan 430061
　　 Abstract Objective: To investigate the effects of Ampelopsis Brevipedunculate Trautv of Fas anti-
gen expression in liver tissue of mice liver injury models induced by Con A. Metheods: Liv er injury
models w ere induced by ConA in mice in v iv o and treated wi th high, medium , low dosage Ampelopsis
Brevipedunculate Trautv o r Dexamethasone. Histopathological changes of the liver samples w ere ob-
srved. Results: High and medium dosage Ampelopsis Brevipedunculata Trautv alleviated the
histopathological changes and decreased Fas antig en expression in liv er tissue, and had no different
f rom Dexamethasone used as control. Conclusion: Ampelopsis Brevipeduncluata Trautv rest rain hepa-
tocyte apoptosis by decreasing hepatocy te Fas antig en expression.
　　Key words　 Ampelopsis Brevipedunculata Trautv ; Concanavalin A; Fas Antigen
　　我们前期工作研究表明 ,蛇葡萄根具有较好的
护肝降酶 ,抗自由基损伤及抗乙肝病毒作用 [1～ 4 ]。为
了进一步探讨该药护肝降酶的作用机制 ,开展了蛇
葡萄根对刀豆蛋白 ( ConA)诱导实验小鼠肝损伤模
型肝组织 Fas抗原表达影响的研究 ,现报告如下。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
Balb /C小鼠 60只 , 9～ 10周龄 ,体重 25～ 30 g,
均为雄性 ,由湖北省医学科学院动物中心提供。
*湖北省自然科学基金资助项目 ( No. 96 J099)
ConA为美国 Sigma公司产品 ;地塞米松磷酸钠注
射液为上海信谊药厂产品 ;蛇葡萄根浸膏提取液由
湖北中医学院药学系提供 ; Fas抗原免疫组化检测
试剂套盒购自武汉博士德公司。
1. 2　动物模型建立及分组
将小鼠随机分成 6组 ,每组 10只 ,即正常对照
组 ( A组 ) ,造模组 ( B组 ) ,地塞米松组 ( C组 ) ,蛇葡
萄根高、中、低剂量组 ( D、 E、 F组 ) ,其中 A～ C组小
鼠以生理盐水 0. 2 ml /10 g, D～ F组小鼠相同条件
下以蛇葡萄根浸膏提取液 21 g /kg、 14 g /kg、 7 g /kg
剂量灌胃 , 1次 /d,连续 14 d。第 14天全部小鼠禁食
·67·中国中西医结合消化杂志第 9卷第 2期
不禁水 16 h, B～ F组小鼠均采用 ConA 20 mg /kg
进行静脉注射制作小鼠肝损伤模型 ; C组在 ConA
注射前 1 h按地塞米松 0. 5 mg /kg行尾静脉注射 ;
A组仅注射无菌磷酸盐缓冲液 ( PBS) 0. 3 ml。
1. 3　实验方法
注射 PBS或 ConA 8 h后处死小鼠 ,取肝脏同
一叶固定于 4%甲醛溶液中 ,石蜡包埋 ,连续切片用
于苏木精-伊红染色和免疫组化。
Fas抗原表达检测:切片经二甲苯脱蜡 ,梯度乙
醇入水 , H2 O2处理 ,继以 Fas抗原免疫组化检测试
剂检测 ,依次用正常山羊血清 (阻断 )、兔抗 Fas蛋白
抗体、生物素 -山羊抗兔 IgG(连接 )、过氧化物酶-链
亲合素反应后 , DAB显色 ,以苏木精复染。
1. 4　统计学处理方法
等级资料用 Ridit分析。
2　结果
2. 1　肝组织病理变化 (光镜 )
A组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列 ,
肝窦未见异常。B组肝组织出现明显病变 ,小叶内大
多数肝细胞肿胀 ,细胞质疏松化 ,有的呈气球样变 ,
可见明显的灶状坏死 ,坏死处可见大量中性粒细胞 ;
淋巴细胞和单核细胞浸润、肝窦内可见红细胞堆集。
D、 E、 F组及 C组见散在点、灶状坏死 ,部分肝细胞
肿胀变性 ,其损伤程度与 B组相比损伤程度明显减
轻。
2. 2　肝组织 Fas抗原表达
Fas抗原表达的强度与肝损害的严重程度有一
定的关联 , B组的 Fas抗原阳性肝细胞数量多 , Fas
抗原主要表达于肝细胞质内 ,含棕黄色颗粒 ,弥漫而
不规则 ,细胞膜上也可有连续表达 ;而 A组仅偶见
Fas抗原阳性肝细胞 ;各组小鼠肝细胞 Fas抗原表
达 ,见表 1。
表 1　各组小鼠肝细胞 Fas抗原表达　　例
组别 例数 　　 Fas抗原表达强度±　　　+ 　　　 　　　 　　
A　 10 10 0 0 0
B　 10 0 0 3 7
C2) 10 1 7 2 0
D2) 10 0 7 3 0
E2) 10 1 6 3 0
F2) 3) 10 0 1 6 3
　　与 B组比较 2) P < 0. 01;与 C组比较 3)P < 0. 05
　　±:极少 Fas抗原阳性肝细胞 ;+ : Fas抗原阳性肝细胞
仅见于中央静脉周围 ,或少数在碎屑坏死区 ; :坏死灶周边
有 Fas抗原阳性肝细胞 ; : 在肝小叶内 Fas抗原阳性肝细
胞有弥漫分布
3　讨论
ConA是一种能在体外激活 T细胞并促进 T细
胞和单核细胞产生 TN F-α等细胞因子的有丝分裂
原 ,它诱导实验性小鼠肝损伤模型的发病机制与病
毒性肝炎、自身免疫性肝炎有类似之处 [ 5] ,故可用来
研究护肝药物的作用机制并为筛选护肝药物提供可
靠的实验依据。
形态学上 ConA诱导的肝损伤突出表现为肝细
胞凋亡和坏死 ,且以前者更为突出 ,并与细胞毒性 T
细胞 ( CTL)有关 ,现知 CTL可介导肝损伤 , CTL介
导的肝细胞凋亡是早期肝损害发生机制之一 [5 ]。 Fas
与 Fas配基 ( FasL)结合 ,可导致 Fas的细胞凋亡 ,较
广泛地分布在全身淋巴细胞、肝胆管细胞、卵巢细
胞、内皮细胞、皮肤组织细胞等 ,某些细胞经活化后
可诱导表达 Fas。 FasL则主要表达在活化的成熟 T
淋巴细胞 ,尤其是 CD4+ Th1亚群。 目前研究认为
FasL是死亡因子 , Fas则是它的受体。 Fas和穿孔素
途径是 T细胞介导的细胞毒性作用的两个重要机
制。 Fas过程可分为两步 ,首先 ,效应细胞 ( T细胞 )
通过 T细胞受体 ( T R)识别携带可致敏抗原靶细胞
的组织相容抗原 ( MHC)并被激活表达 FasL,成为
CTL;然后 CTL的 FasL与靶细胞表面的 Fas特异
结合 ,传导死亡信息 ,激活靶细胞内在的死亡程序 ,
并以此清除感染细胞。研究表明 , Fas系统介导的细
胞凋亡是病毒性肝炎发生发展的重要机制之一 [6 ]。
乙型、丙型肝炎病毒在肝细胞表面表达可能一方面
刺激肝细胞大量表达 Fas,另一方面激活 CT L大量
表达 FasL,两者结合导致细胞凋亡。 这一过程正常
发生 ,感染病毒的细胞将被清除 ;过程若被放大则可
能导致暴发性肝炎。本研究表明 ,造模小鼠肝组织病
变重 , Fas抗原阳性肝细胞数多 ,表达信号强。 同时
还发现用蛇葡萄根高、中剂量及地塞米松预处理后 ,
小鼠肝组织损伤减轻 , Fas抗原阳性肝细胞数显著
减少 ,提示蛇葡萄根可通过抑制 Fas表达 ,达到阻断
CTL对肝细胞的杀伤 ,阻断 ConA诱导的肝细胞凋
亡 ,这可能是蛇葡萄根对肝损伤起治疗作用的机制
之一。
参 考 文 献
1　陈科力 ,张秀明 ,李瀚 ,等 . 三种蛇葡萄根抗 D-DalN
致急性肝损伤的实验研究 . 中药材 , 1999, 22( 7): 353.
2　陈科力 ,李瀚 ,张赤志 . 蛇葡萄根的保肝降酶及抗氧自
由基损伤作用 . 中国药师 , 1999, 2( 5): 225.
3　陈科力 ,李瀚 ,陈艳明 ,等 . 蛇葡萄根提取物抗鸭乙型
肝炎病毒的作用 . 中药材 , 2000, 23( 1): 41.
(下转第 70页 )
·68· 中国中西医结合消化杂志第 9卷第 2期
休息 1 h,再采血 5 m l。空白对照组过程一样 ,只是
不给针刺。
观察仪器:刺激仪器为上海医用电子仪器厂生
产的 G6805-2治疗仪。刺激参数:疏密波 ,疏波 4Hz,
密波 20Hz,脉冲宽度 0. 5 ms,输出电压 60 V , 0～ 60
峰峰 ( 1kΨ负载 )。
血中相关物质指标检测: 针刺前后各采血 5
ml,检测血浆 MLT、 GAS的含量 ,采用放射免疫分
析法测量 ,药盒由北京华英放免公司提供。
1. 3　统计学处理方法
针刺前后比较采用配对 t检验。
2　结果
各组针刺前后血浆 MLT及 GAS含量的变化 ,
结果见表 1。
表 1　各组针刺前后血浆 MLT及 GAS含量的变化　　　　　 pg /ml, x-± s
组别 例数 M LT针刺前 针刺后
GAS
针刺前 针刺后
四白组　　 10 309. 73± 139. 97 551. 34± 252. 451) 28. 66± 10. 20 29. 55± 12. 91
足三里组　 10 190. 14± 101. 84 259. 89± 147. 051) 34. 43± 34. 04 49. 01± 44. 91
四白旁组　 10 176. 01± 99. 59　 159. 90± 98. 361)　 28. 48± 13. 17 　 57. 92± 23. 742)　
足三里旁组 10 210. 39± 195. 37 222. 21± 103. 431) 7. 59± 5. 53 5. 19± 7. 22
空白对照组 10 215. 27± 180. 90 246. 89± 203. 26　 2. 30± 2. 89 2. 11± 2. 64
　　与针刺前比较 1) P < 0. 05, 2) P < 0. 01
3　讨论
为了探讨足阳明经与胃运动内在联系的物质基
础 ,我们在以往研究的基础上更进一步观察了针刺
足阳明经穴前后对健康人血浆 MLT、 GAS含量的
影响 ,其目的是想进一步寻求经穴 -脏腑相关的物质
基础 ,结果表明: ①针刺四白与足三里穴后血浆
MLT含量明显升高 ,与针刺前相比差异有显著性意
义 ( P < 0. 05)。②针刺四白旁后血浆 GAS含量明显
升高 ,与针刺前相比差异有非常显著性意义 ( P <
0. 01) ,针刺四白和足三里穴后 ,血浆 GAS含量呈上
升趋势 ,但与针刺前相比差异无显著性意义 ( P >
0. 05)。
MLT是由 22个氨基酸组成的多肽 [ 3] ,其细胞
主要分布在小肠上段 ,是一种由小肠上部 EG细胞
所分泌的脑肠肽 ,属于消化间期激素 ,对胃肠运动的
影响主要通过消化间期周期性释放 ,引起胃和小肠
上部产生肌电复合体三相 ( IMC)。血中 MLT水平在
一定程度上可反应胃肠道的运动和功能状态。 本研
究结果表明 ,针刺足阳明经四白、足三里穴后 ,可使
血浆 MLT含量上升 ,与胃运动增强呈平行关系 ,提
示胃运动增强有 MLT的参与。
GAS也是一种重要的胃肠道内分泌激素 [4 ] ,主
要由胃窦部 G细胞分泌 ,入血后对消化系统的分泌
及运动功能起到重要的调节作用。本研究结果表明 ,
针刺四白旁组后 ,血浆 GAS含量明显上升 ,而针刺
四白与足三里穴后虽与针前差异无显著性意义 ,但
都呈上升趋势。提示针刺能激活人体血浆 GAS的释
放 ,并与胃运动功能有其相关性 ,两者间互为激发。
本研究结果提示:在针刺传出通路中有肽能神
经参与 ,针刺传入信号可能激活脑干或延髓孤束核
等中枢内肽能神经释放 MLT、 GAS等脑肠肽 ,进而
激活外周肠神经系统肽能神经元 ,启动胃肠收缩活
动。
参 考 文 献
1　严　洁 ,常小荣 ,藏敬跃 ,等 . 针刺足阳明经不同部位腧
穴对人体胃窦容积变化的动态观察 . 针刺研究 , 1995, 20
( 1): 60.
2　林亚平 ,针力伟 ,韦志群 ,等 . 针刺足阳明经足背段对人
体幽门括约肌压力的影响 . 湖南中医学院学报 , 1995, 15
( 4): 61.
3　陈元方 ,主编 . 胃肠肽类激素基础与临床 . 北京: 北京医
科大学　中国协和医科大学联合出版社 , 1997. 317.
4　陈元方 ,主编 . 胃肠肽类激素基础与临床 . 北京: 北京医
科大学　中国协和医科大学联合出版社 , 1997. 143.
(收稿日期: 2000-03-29)
(上接第 68页 )
4　张亚兵 ,李之清 ,张赤志 . 蛇葡萄根对 Con A诱导小鼠肝
损伤的防护作用 . 中西医结合肝病杂志 , 2000, 10( 1):
26.
5　 Gantner F, Leist M , W ilhelm A, et a l. Concanevalin A in-
duced T-cell mediated hepa tic injur y in mice: He ro le of
tumo r cecro sis facto r. Hepa to log , 1994, 20: 160A.
6　胡瑾华 ,张岭霞 ,王慧芬 . FasL、 Fas介导的细胞凋亡与肝
脏疾病 . 中西医结合肝病杂志 , 1997, 7( 2): 122.
(收稿日期: 2000-10-17)
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