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蛇葡萄根对Con A诱导小鼠肝损伤的防护作用



全 文 :。
26
, 中西医结合肝病杂志 2 0 0 0 年第 1。 卷第 1 期
蛇葡萄根对 C o n A 诱导小鼠肝损伤的防护作用 `
张亚兵 李之清 张赤志
1 湖北中医 学院肝病研究所 (武汉 . 4 3 0 0 61 ) 如
.
,
摘 要 目的 : 探讨蛇葡萄根 对肝损伤的防护作 用及机制 。 方 法 : 采用刀 豆蛋白 A ( C o n八 ) 诱导小 鼠建立 实验性
肝 损 伤 的 动物模 型 , 以 地塞米 松对照 , 观察高 、 中 、 低 剂 量蛇 荀萄根组 血菜种瘤坏 死 因 子 一 Q ( T N F一曰 、 一氧 化 众
( N O ) 含 圣 、 丙孰酸转孰缭 (川 T ) 活性及肝胜病理 变化 。 结 果 : 高 、 中荆1 蛇荀萄可减轻肝胜 病理改 变 . 明显降低血
浆 T N F 一 a 、 N O 含量及 八 L T 活性 . 与地塞米松组相 比 无显著 差异 。 结 论 : 蛇荀萄根具有较好 的保护 C on 入 诱导小 鼠肝
才适伤 尾乍用 。
关健词 蛇 葡萄根 刀 豆 蛋白 八 肿瘤坏 死 因子 一 Q 小 鼠 一载化氮
P r o t e e t i v e E f f e c t s o f A 矛牡P e lop s is B r e v勿e d ` , n e u l a t a o n M i e e l · i v e r I n j u r y I n -
d u c e d b y C o n c a n e r a l i n A ( C o n A )
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. 勺阅国内外研究表明 , 病毒性肝炎患者体内 . T N F 一 a ,
N O 等多种影响细胞凋亡及 坏死的发生 和发展的生物
活性 因子升高 tl, 鱿 . 其相互作用加重了肝损伤 。 本实验
以 C o n 八 诱导小鼠肝 细胞调亡 和坏死 模型进行蛇葡
萄根影响肝细胞 凋亡和坏死的研究 。
1 材料与方法
1
.
1 材料 Ba l b / e 小白鼠 . 周龄 9一 1 0周 , 共 6 0 只 ,
均为雄性 , 体重 2 5~ 3 0 9 , 由湖北省医科院动物中心提
供 。 刀 豆 蛋 白 八 ( C o n 八 ) 为美国 S ig m a 公司产 品 。 地
塞米松磷酸钠注射液为上海信谊药厂产品 。 蛇葡萄根
浸膏提取液由湖北 中医学院中药鉴定室将蛇葡萄根粉
碎成极 细粉 , 用 8 0 % 乙醇 室温 ( 1 5 C ~ 2 5 C ) 渗透提
取 , 回收溶剂得到浸膏 , 将其适当溶于水后成浸膏提
取液 。
1
.
2 试验方 法 将小鼠随 机分成 B 组 . 每组 10 只 :
①正常对照组 ; ②模型 组 ; ③高剂量蛇葡萄根组 ; ④
湖北省自然科学墓 金课 题 ( 9 6 Jo 99 )
中剂量蛇葡萄根组 ; 、亏低剂量蛇葡萄根组 ; “ 地塞米
松组 。 按临床成人应用 剂量参 照陈氏口推荐转换因 子
法 , ⑧一云组 小鼠在造模前分别以 2 1。 ,k/ 。 、 1 9 /k只 、
7 9 /k g 剂量蛇葡萄根浸膏提取液灌 胃 , 1 次 / 天 . 连续
n 天 ; ① 、 ② 、 通相 同条件下 以 生理盐水灌 胃 . 第 川
天 , ①一⑧组小鼠禁食不禁水 1 6 h 后 . ②一厄组小鼠
均采用 C o n A 注射前 l }: 按 )` . s n 、 g “ k g 尾 静脉注 射地
塞米松 ; ①组仅注射无菌磷酸盐缓冲液 ( P B S ) 0 . 3m l .
所有试剂均 以 P B S 溶解稀释为 0 . 3 m l 注射 。
1
.
3 观察指 标 了血浆 T N F 一 。 测定 : 注射 C ol l 八 或
P B S 后 4 h , 对全部小鼠均作眼眶 采血 , 迅速离心 分离
血浆后置 一 ZO C 冻存以备检 T N F 一 Q 用 , 采用 双抗体夹
心 E I J IS 八 法 , 试剂盒由军事医学科学院提供 。 萝血浆
N O 测定 : C o n 八 注射后 s h 在 2%戊 巴 比妥钠腹腔麻
醉下剖腹 开胸 、 以肝素化的注射器穿刺心脏采血 , 分
离血 浆后采用 比色法 检测血浆亚硝酸盐 和硝酸盐 <
训匕勺
中西医结 合肝病杂志 20 0年第 0 1卷第 1期
NO牙 / NO矛含量间接反映血清 NO水平 。 NO代谢产
物 NO:/ NO于蔡乙烯二 胺盐酸盐显色法测定药盒由
北京帮定公司提供 。 ③血浆 A L T检测 : Con A注射后
s h穿刺心脏采血 , 分离血浆后 以生化白动分析仪测定
A L T 活性 。 ④病理检查 : 取小鼠肝脏同一 叶固定于
4% 甲醛溶液中 , 常规脱水 , 石蜡包埋并切片 , 经 H E
染色后行光镜观察 。
1
.
4 统计学方 法 组间数据比较采用 t 检验 , 相关比
较用相关系数显著性检验 。
2 结果
2
.
1 血菜 T N F 一 a 、 N O 、 A l , T 的检测 见表 l , 造模
组小鼠 T N F 一 a 、 N O 水平及 A L T 活性较正 常对照组明
显升高 , 两者比较差异极 显著 (尸 < 0 . 0 1 ) 。 高 、 中 、
低剂量蛇葡萄根组小鼠 T N F 一 。 、 N O 水平及 八 L T 活性
与地塞米松组相 比无显著差异 (尸> 0 . 0 5 ) ; 低剂量蛇
葡萄根小鼠 T N F 一 Q 、 N O 水平及 IA 丁 活性较高 、 中剂
量蛇葡萄根组及地塞米松组高 (尸 < 0 . 05 ) 。
襄 1 各组小服血桨 T N F 一 a 、 N O 水平及 A L T 活性比较 〔牙士 , )
T N F
一 a ( Pg 八 . ) N O (拌m o l / I ) \ T I , ( U ,’ L )
正常组 2 3
.
8 2士
1 7
.
3 3
7 1
.
5士
1 4
.
5 8
3 1
.
3 6士
1 4 2 8
造模组 2
1 3 5 6 士
3 4
.
28 。
3 5 3
.
4 盆士
3 4
.
7 5△
8 7 8
.
5 2士
18 5
.
3 6八
高剂量组 8 5
.
9 5士
2 7
.
3 9。 ,
1 7 8
.
5 2士
2 1
.
3 3 △ `
25 6
.
4 2士
1 4 0
.
64
`飞 ’
中剂量组 9 2
.
5 5士
3 6
.
5 4△ `
1 6 7
.
6 3士
2 9
.
3 2 、 .
2 3士
36
`一 “
低剂量组 12 5
.
7 1士
4 6
.
8 3 。 ’ .
2 4 3
. 了l士
2 1 8 , 凸 ’ .
3 5 2
.
78士
] 6 6
.
7 8△二
地 塞米松组
7 8
.
7 5士
4 0
.
38△ .
1 5 6
.
2 5士
1 8
.
9 6 0
·
2 3 7
.
38士
1 30
.
8 9
`玉 .
注 : 与正常 .Xt 照组对比 , △ P < 0 . 0 01 ; 与造模组对 比一 尸 < 。 . 01 ;
与地塞米松组 相比 , # 尸 < 0 . 05
2
.
2 N O 与 T N F 一 a 含量间相并性比较 造模组及各
药物实验组小 鼠血浆 N O 与 T N F 一 。 含量间均呈明显
正 相关 。 其中造模组相关系数 ( r 一 0 . 0 2) 有显著意义
(尸 < 0 . 0 5 ) ; 各药物实验组均有显著意义 (尸 < 0 , 05 ) 。
2
.
3 组织病理变化 光镜下正常组无肝组织损害 ,造
模组的肝组织病变最为严重 ,大多数肝细胞明显肿大 ,
胞浆疏松化 , 有的呈气球样变 , 可 见明显 的灶状坏死 ,
坏死处可见大量中性粒细胞 , 淋巴细胞和 单核细胞浸
润 ; 高 、 中 、 低剂量蛇葡萄根 及地塞米松组也均有一
定程度的肝损害病变 , 有时可 见肝细胞点状坏死 , 但
与造模组相比损害程度明显减轻 。
3 讨论
C o n A 是一种得到广泛应用的有丝分裂原 . 在体
内可诱导小鼠 T 细胞依赖性肝损伤川 。 C o n A 性肝损
伤模型可用来研究体内免疫病理过程的主要规律 , 如
通过细胞因子网络实现的 T 细胞依赖性细胞内信息
交流或体内免疫系统异常调节反应所引起的细胞毒性
作用 、 故可用来研究保肝 药物的作用机理并为筛选保
肝药物提供可靠的实验依据 。
形态学上 C o n 八 诱导 肝损伤突 出表现为肝 细 胞
凋亡 和 坏死 , 且 以前 者更为 突 出 。 辅 助 性 T 细胞
( T H ) 和巨 噬细胞是 C o n 八 性 肝损伤模型 的效应细
胞 。 当 C o n A 活化 lT , 细胞后刺激 lT , 细胞和 巨噬细
胞 、 肝细胞共同产生大量的 T N F 一 a 等细胞因子 , T N F -
Q 已 被证实为细胞因子 网络 中介导肝损 伤的终 末介
质 , 它既是细胞凋亡的正性触发因子 ( 当 T N F a 过量
生成时即充当肝细胞凋亡 刺激因子 ) 、 且直接损伤血管
内皮细胞 . 亦可 活化中性粒细胞促进其趋化聚集于肝
脏 , 释放蛋白酶或氧白由基引起肝细胞凋亡或坏 死比 。
T N F

a 、
l
J 及 I F N 一 a 等细胞因子 及内毒素等刺激物可
诱导非 C a卜依赖性 的诱导型 N O S 产生 大量 N () 民 , 我
们实验证明造模组 及各药物组小 鼠血浆 N O 含 量与
T N F
一 a 水平 相关性 分析二 者呈密 切 正 相关 , 提示
T N F
一。 可能参与 N () 诱生 。 X O 是一 种新型的细胞信
使分子和细胞毒性 因子 . 高水平 N 〔) 导致 细 袍毒性作
用 , 介导免疫损伤 。 体外实验表明 , N O 对肝细胞功能
的影响是多方面的 , 如 N O 抑制肝细胞蛋白质合成 、 线
粒体功能 , 抑制核糖核普酸 还原酶及破坏 D N A 双螺
旋结构 , 诱导肝细胞凋亡及坏死 6j[ 。
地塞米松可能通过直接抑制 T 淋 巴细胞 、 巨噬细
胞及 iN O S 的活性从而抑制 T N F 一。 的 大量 产生 及 N ()
的 诱生起到 保护 C o n A 所诱 导肝损 伤的 作用 , 而
A I
J
T 正是反映肝细胞损伤的经 典指标 。 蛇葡萄根始载
于 《浙江天 目山药物志 》 , 性甘 、 酸 、 平 . 人肺 、 肝 、
大肠经 , 功能清热解毒 、 活血散疲 、 祛风除湿 、 民间
广泛应用于抗炎抗菌 。 杨氏比从 12 0 味植物体中选出
了一些具有显 著保护 和抗肝细胞毒性的药物 , 其中包
括蛇葡萄根 。 我们的实验表明 . 单味中药蛇葡萄 根浸
膏溶液 可 以 明显降 低 C o n A 诱 导肝损 伤小 鼠 血浆
丁N F 一 Q 、 N ( ) 水平及 A L T 活性 , 且高 、 中剂量组与地
塞米松组相 比无显 著性差异 。 ( 下 转第 2 9 页 )
中西医结合肝病杂 志 2 0 0 0年第 10卷第 1期
尸呼
用 Z o mg / ml 的 2一甲基甘露糖的 R P MI 一 6 1 40培养液 ,
洗涤 3 次 , 把细胞浓度调整为 5 x 10 5 / m l 置 40 孔板的
孔 中 , 每孔 1 0 0产l , 然后再加人上述待测的 11广 2 1 0 0拜l ,
置人 5 % CO : 37 ℃培养 4 8 小时 , 取出后用 M T T 比色
法测定 。
2 结果
结果见附表 , 模 型组 C 3、受体花 环率较正常组下
降 , I C 花环率上升 (尸 < 0 . 05 及 尸 < 0 . 01 ) , 表明荷瘤
鼠的红细胞免疫缺陷为继发性的 。 而 F A P 组 C 3 、受体
花环率较 N S 组升高 , IC 花环率降低 (尸 < 0 . 0 1 ) 。 上
述结果表明 F A P 确有调节红 细胞免疫功能的作用 。 而
且 , N S 组大鼠 .1I 一 2 水平均较正 常组降低 (尸 < 0 . 01 ) ,
而 F A P 组较 N S 组升高 (尸 < 0 . 01 ) , 正常组较 F A P 组
为高 (尸 < 0 . 0 5 ) , 表明 F A P 有升高荷瘤鼠 H广 2作用 ,
但仍不及正常组 H厂 2 水平 。
附裹 各组大限 R B( 二一 C 3b R R 、 R B C一 I C R R 及 I L 一 2 检侧结果比较 ( n =
10
. 牙士 : )
R B C

C 3、 R R (% ) R B C一 IC R R (% )
正常组 7 . 2 3 5士 1 . 83 6 4 . 9 99士 1 . 1 4 1
I L

2 ( O D 值 )
0
.
5 1 4士 0 . 0 8 8
N S 5
.
7 5 6士 1 . 32 7 . △乙 7 . 3 ] 5士 1 . 6 8 2入么
F A P 7
.
6 8 4士 1 . 36 3 4 . 8 67士 0 . 7 8 1
0
.
3 2 8士 0 . 0 6 5人么
0
.
4 74士 0 . 07 6 ’
与正常组 对比 , , P < 0 . 05 , , , 尸 < 0 . 01 ; 与 F A P 组对 比 , △△ P
( 0
.
0 1
3 讨论
大鼠移植性肝癌模型复制容易 , 成功率高 , 很适
合抗肿瘤药物的筛选 5[] 。 红细胞免疫功能主要通过 C 3b
受体实现 , 红细胞的某些免疫功能是其它细胞所不能
代替的 , 其数量巨大 , 其免疫功能在肿瘤免疫反应中
不容忽视 。 F A P 提高红细胞免疫功能可能是通过以下
几方面实现的 : ① F A P 可纠正荷瘤鼠存在的红细胞粘
附功能紊乱 , 解除或减轻红细胞对免疫复合物降解 、 释
放障碍 , 故 IC R 降低 。 ②荷瘤鼠自身免疫反应产生 C 3 b
受体抗体 , 封闭或破坏了 C 3 b , 从而 C b3 R 下降 , 而 F A P
通过抑制肿瘤 自身免疫反应 , 抑制 C 3 、受体抗体的产
生 , 解除了对 C 3、受体封闭或破坏作用 。 ③ F A P 可能通
过红细胞对 C 3、降解 、 参与补体系统对细胞体液调节的
枢纽作用 , 从而起到抗肿瘤作用 。
I L

2 是机体免疫应答的中心环节 , 是免疫调控的
中枢 。 我们观察 F A P 对 I L 一 2 产生的影响 , 发现 F A P
能促进 IL 一 2 产生 。 已有资料表明困 , 红细胞参与 .I 一 2
产生的调控 。 我们的研究初步证实了 F A P 对大鼠红细
胞免疫功能有促进作用 , 而 n J 一 2 产生的增加 , 很可能
是与红细胞参与免疫调控密切相关或者由于 F A P 直
接影响 I L 一 2 的产生 有关 , 也 可能是两种因素共同作用
的结果 。
本研究结果进一步证实了荷瘤 鼠红细胞免疫缺陷
为继发性免疫缺陷 , F A P 有提高红细胞免疫功能及对
-I

2 产生有促进作用 , F A P 抗肿瘤作用可 能与此有
关 , 因而本实验为 F A P 治疗肿瘤提供了实验依据 。
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(上接第 27 页 ) 病理学检查 : 光镜下观察 , 蛇葡萄根
组与模型组相比肝损害明显减轻 , 提示蛇葡萄根可通
过抑制 T N F一 。 的产生和 N O 的诱生对 C o n A 诱导小
鼠肝损伤起保护作用 , 从而为蛇葡萄根治疗慢性肝炎
及免疫性肝损伤等肝细胞肝胆疾病提供了理论基础 ,
具有一 定的临床应用价值 。
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