全 文 ：收稿日期:2006-11-19
作者简介:蒋益花 (1965-), 女 , 浙江东阳人 , 讲师 , 从事天然产物研究工作。
草总黄酮的提取工艺和含量测定研究
蒋益花 , 陈敏明
(浙江省丽水学院 医学部 , 浙江丽水　323000)
　　摘　要:利用 L9 (34)正交试验设计和 Duncan法检验 , 确立了 草中黄酮的最佳提取条件及其产率。结果
表明 , 用1∶15(g ml)的50%乙醇水溶液 , 提取温度 80℃, 提取时间 1 h , 提取效率较好。最佳工艺条件下黄酮产
率为0.656 3%。
关键词: 草;总黄酮;正交试验;提取工艺;含量测定
中图分类号:S687.3　　　文献标识码:A　　　文章编号:0528-9017(2007)02-0150-04
　　 草 [ Humulus scandens (Lour)Merr] 为桑科
植物 , 又名拉拉藤 、 拉拉蔓 、 五瓜龙 、 拉拉秧 、 过
沟龙 , 一年生或多年生蔓性草木 , 长达数米 , 有倒
钓刺 , 生于沟边 、路旁 、 荒地 。我国大部分地区均
有分布 , 生命力极强 , 生长密集 , 极易采收 。 草
是一种有经济价值的杂草 , 不仅可用作优质蜜
源[ 1] , 还具有甘 、 苦 、 寒的性能 , 有清热解毒 、 消
肿 、 利尿功效 、 有抗革兰氏阳性细菌的作用 , 可药
用[ 2 ,3] 。而且营养丰富 , 可作蔬菜[ 4] 、 饲料[ 5 , 6] 。据
文献报道[ 4 , 6] , 草全草含有木犀草素 、 葡萄糖甙 、
胆碱 、挥发油 、 鞣质 、树脂 、 天门冬酰胺 , 但对其
中黄酮类化合物研究报道很少 。本文以乙醇为溶
剂 , 以 草地上部分为原料 , 对影响其黄酮提取的
主要因素用正交试验 , 以黄酮含量为指标 , 用方差
分析方法进行分析 , 从而优选 草总黄酮的提取条
件 , 并测其黄酮含量 , 为 草资源的合理利用提供
科学依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
草采自丽水学院医学部校园 。芦丁对照品购
自中国药品生物制品检定所。所用试剂均为国产分
析纯。所用仪器为北京瑞利UV-9100型紫外可见光
谱仪 , AL204 型电子分析天平 , 数显恒温水浴锅
HH-2。
1.2　方法
1.2.1　 草地上部分化学成分预试
称取一定量的 草地上部分粉末 , 各加 50%
乙醇在 80℃浸提一定时间后 , 过滤得预试供试液 ,
进行系列颜色反应 , 检识有无总黄酮化合物。
1.2.2　标准曲线的制备
精密称取芦丁对照品 20 mg , 置 100 ml 量瓶
中 , 加 80%乙醇溶解至刻度 , 摇匀即得对照品溶
液[ 7 , 8] 。分别精密吸取 1.0 , 2.0 , 3.0 , 4.0 和 5.0
ml分别置于 10 ml 比色管中 , 各加 80%乙醇至 5
ml , 加 5%NaNO2 溶液0.5 ml , 摇匀放置 6 min 。再
加 10%Al (NO3)3 溶液 0.5 ml , 摇匀 , 再放置 6
min。加 4%NaOH 溶液 4 ml , 摇匀放置 15 min , 在
510 nm 波长处。以同法配制空白对照 , 测定吸光
度值 , 得回归方程 C=0.848 9A+0.006 905。其线
性范围为0 ～ 0.5 mg , 相关系数 r=0.999 5。
1.2.3　样品的处理及黄酮含量测定
提取:新鲜 草地上部分※清洗※干燥※粉碎
※精密称取干燥 、 粉碎的 草粉末0.500 0 g置于锥
形瓶中※按表 1 、 表 2选择的因素和水平进行水浴
加热※过滤※提取液※用相应提取剂定容至 50 ml ,
即得黄酮提取液。
样品测定:精密吸取黄酮提取液 1.0 ml于 10
ml比色管中 , 按各加 80%乙醇至 5 ml方法进行操
作 , 同时精密吸取黄酮提取液 1.0 ml于 10 ml比色
管中 , 加 80%乙醇至 5 ml , 再加 1 ml水 , 4 ml4%
NaOH溶液 , 作样品空白测定吸光度值 。按回归方
程计算样品液中黄酮含量。
1.2.4　提取条件选择
平行试验 。称取0.500 0 g 草粉末若干份 , 分
别在不同的温度 、 提取时间 、提取次数 、 提取剂用
150　 　　2007年第 2期
量等条件下做单因子平行实验 , 按 1.2.2的方法进
行各样品测定。
根据平行试验的结果 , 采用正交试验设计 , 应
用L9 (34)正交表 , 对提取剂 、 提取温度 、 提取时
间 、提取剂用量 4因子在 3 个水平进行优选 (表
1)。结果采用直观分析和方差分析 , 影响色素提取
因子的显著性检验采用 Duncan法[ 9] 。
1.2.5　验证试验
按选定的提取条件进行验证试验 , 重复测定
3次。
表 1　正交试验的因子与水平
序号 A:提取剂 (%) B:提取剂用量 (g ml) C:提取时间 (h) D:提取温度 (℃)
1 50 1∶15 1 60
2 60 1∶25 2 70
3 70 1∶35 3 80
2　结果与讨论
2.1　 草黄酮类化合物颜色反应检识
表2的颜色反应与黄酮类化合物的颜色反应相
似 , 说明 草中含有黄酮类化合物 。
表 2　 草总黄酮的检识
试剂 结果
HCl+Mg , 微热 黄色
3%AlCl3 黄绿色
1%FeCl3 蓝色
1%醋酸铅 1% 黄色沉淀
浓硫酸 橙色
4.3%NaOH 棕红色
2.2　最佳提取条件的选择
2.2.1　平行实验
提取剂浓度的选择。料液比 1∶25 、 水浴 80℃
提取相同时间 , 对不同乙醇浓度提取剂 30%、
50%、 70%、 90%进行了平行实验 , 测其总黄酮分
别为0.421 3%、0.481 2%、0.476 8%、0.397 4%。为
了确定在多因子条件下与单因子条件下的最佳提取
剂是否吻合 , 因此选定提取浓度 50%、 60%、 70%
作为正交试验的 3个水平。
提取温度的选择。料液比 1∶25 、 用 50%乙醇
溶液作提取剂提取相同时间 , 对提取温度 20℃、
40℃、 60℃、 80℃、 100℃进行了平行实验 , 测其
总黄酮分别为 0.151 2%、 0.243 5%、 0.315 8%、
0.407 6%、0.246 8%。由此看出 , 在 80℃时其总黄
酮含量最大 , 说明提取温度以 80℃最佳。为了确
定在多因子条件下与单因子条件下的最佳温度是否
吻合 , 因此选定提取温度 60℃、 70℃、 80℃作为正
交试验的3个水平 。
提取时间的选择。在料液比 1∶35 、 80℃用
50%乙醇溶液提取时对提取时间 0.5 h 、 1 h 、 1.5
h 、 2 h 、 3 h进行了平行实验 , 测其总黄酮分别为
0.387 2%、 0.544 2%、 0.572 5%、 0.608 9%、
0.580 2%。结果显示提取时间为 2 h时总黄酮含量
最大。为了确定在多因子条件下与单因子条件下的
最佳提取时间是否吻合 , 因此选定提取时间 1 h 、 2
h 、 3 h作为正交试验的 3个水平 。
提取剂用量的选择 。在 80℃用 50%乙醇溶液
提取相同时间 , 对提取剂用量 (料液比)1∶15 、
1∶25 、1∶35 、1∶45进行了平行实验 , 测其总黄酮分别
为0.458 3%、0.434 1%、0.415 2%、0.401 7%。为了
确定在多因子条件下与单因子条件下的最佳料液比
是否吻合 , 因此选定料液比1∶15 、 1∶25 、1∶35作为
正交试验的 3个水平。
2.2.2　正交试验结果及直观分析
各试验号根据具体给定的提取条件所得的提取
液 , 用相应提取剂分别定容于 50 ml容量瓶中 , 根
据样品测定方法进行测定并计算黄酮含量 。由表 3
可看出 , 在正交试验的 4个因子中 , 以提取温度对
提取率的影响最大 , 计算结果各因子对提取率的影
响依次为:提取温度 、提取料液比 、 提取剂浓度 、
提取时间。直观分析正交试验结果 , 确定最佳工艺
条件为 A2B1C2D3 , 即提取剂用 60%乙醇溶液 , 料
液比1∶15(g ml),提取时间 2 h , 提取温度80℃。
2.2.3　方差分析
方差分析结果 (表 4)可见 , 因子 B 、 D为显
著性因子 , 其它因子为不显著因子 , 可以综合考虑
确定 , 由后面Duncan法检验后确定 。
蒋益花 , 等: 草总黄酮的提取工艺和含量测定研究 151　
表 3　正交试验结果
试验号 水平组合 A (%) B (g ml) C (h) D (℃) 黄酮含量 (%)
1 A 1B1C1D1 50 1∶15 1 60 0.527 5
2 A 1B2C2D2 50 1∶25 2 70 0.535 9
3 A 1B3C3D3 50 1∶35 3 80 0.552 9
4 A 2B1C2D3 60 1∶15 2 80 0.688 7
5 A 2B2C3D1 60 1∶25 3 60 0.519 0
6 A 2B3C1D2 60 1∶35 1 70 0.502 0
7 A 3B1C3D2 70 1∶15 3 70 0.535 9
8 A 3B2C1D3 70 1∶25 1 80 0.612 3
9 A 3B3C2D1 70 1∶35 2 60 0.425 6
表 4　方差分析结果
变异原因 偏差平方和 自由度 均方 F值 显著性
A 0.003 20 2 0.001 60 9.571 4
B 0.012 90 2 0.006 44 38.285 7 ＊
D 0.026 09 2 0.013 04 77.571 4 ＊
误差 0.000 34 2 0.000 17 1
SST 0.042 50 8 - -
　　注:因素 C影响小 , 故作为方差分析的误差处理;F 0.05 (2 , 2)=19.00 , F0.01 (2 , 2)=99.00;“ ＊” 表示因素影响显著。
2.2.4　Duncan法分析
先分别求出各因素水平间的 r0.01 , r 0.05和 Rk 值
(表 5);然后根据计算结果进行各因素水平显著性
比较 。表 6结果表明 , 除提取时间和提取剂外其它
提取因子各水平都有显著性差异。提取料液比1∶15
与1∶25无显著差异 , 与1∶35差异显著;提取温度
80℃与其它水平差异显著。
表 5　各因素水平间Duncan计算
P 2 3
SSR0.01, 2 14 14
SSR0.05, 2 6.09 6.09
LSR0.01, 2 0.105 0.105
LSR0.05, 2 0.045 68 0.045 68
　　注:计算得标准误差为0.007 5。
表 6　各因素四水平的差异显著性
1 (A) 2 (B) 3(C) 4 (D)
水平 Y P 0.05 P 0.01 水平 Y P0.05 P0.01 水平 Y P0.05 P0.01 水平 Y P 0.05 P0.01
2 0.569 9 a A 1 0.584 0 a A 2 0.550 1 a A 3 0.618 0 a A
1 0.538 8 a A 2 0.555 8 a A 1 0.547 3 a A 2 0.524 6 b A
3 0.524 6 a A 3 0.493 5 b A 3 0.535 9 a A 1 0.490 7 b B
　　其次计算 9 个试验所得黄酮含量相互间 r0.01 ,
r 0.05和 Rk 值 (表 7);再根据计算结果进行 9 个处
理间显著差异比较 。表 8 结果表明 , 在 95%信度
范围时 , 序号 4 、 8处理间无显著差异 , 而序号 4
处理与其它处理差异皆显著。由方差分析表明 , 提
取剂和提取时间为非显著性因子 , 提取温度和提取
料液比则为显著性因子。由表 6结果表明提取料液
比1∶15与1∶25无显著差异 , 与1∶35差异显著;故
就选择处理 4。表 6结果还显示提取剂和提取时间
各水平无显著差异 。为节约资源和能源 , 确定最佳
工艺条件为 A1B1C1D3:在提取温度 80℃条件下 ,
用 50%乙醇溶液作提取剂 , 料液比 1∶15(g∶ml),提
取时间 1 h 。与直观分析 、方差分析基本一致 。
2.3　验证试验
152　 　　2007年第 2期
表 7　各处理多重比较的 Duncan计算
P 2 3 4 5 6 7 8 9
SSR0.05 , 2 6.09 6.09 6.09 6.09 6.09 6.09 6.09 6.09
SSR0.01 , 2 14 14 14 14 14 14 14 14
LSR0.05 , 2 0.079 2 0.079 2 0.079 2 0.079 2 0.079 2 0.079 2 0.079 2 0.079 2
LSR0.01 , 2 0.182 0.182 0.182 0.182 0.182 0.182 0.182 0.182
　　注:计算得标准误差为 0.013。
表8　9个处理间的差异显著性
试验号 总黄酮含量 (%)
多重比较结果
差异显著性
0.05 0.01
4 0.688 7 a A
8 0.612 3 ab ACBH
3 0.552 9 bc ACD
2 0.535 9 bc ACD
7 0.535 9 bc ACD
1 0.527 5 c ACD
5 0.519 0 c ACD
6 0.502 0 ce BCD
9 0.425 6 e BD
　　为慎重考虑 草黄酮的提取率 , 按选定的
A1B1C1D3 提取条件进行验证试验 , 重复测定 3次 ,
其结果黄酮含量平均值为0.656 3%,与原试验结果
基本一致 。
3　总结与讨论
通过正交实验结果的直观分析和方差分析及
Duncan法检验得出 , 对提取效果影响最大的是提
取温度; 草地上部分总黄酮提取的最佳提取条件
为:在提取温度 80℃条件下 , 用 50%乙醇溶液作
提取剂 , 料液比 1∶15 (g∶ml),提取时间 1 h 。最佳
工艺条件下黄酮产率为0.656 3%, 比沙芥全草
(0.480 5%)[ 10] 、皱叶酸模全草 (0.32%)[ 11] 等多种
药用全草的总黄酮含量要高 。
草分布广 、 量多 , 资源极为丰富 , 但目前人
们对 草的开发利用却很少 , 往往把它作为有害杂
草除掉 。加强对 草综合利用的研究 , 不仅有利于
自然资源的充分利用 , 而且可以化害为宝 , 具有良
好的现实意义。
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