全 文 ：　 ［收稿日期］　２０１５－０３－０９；２０１５－０８－０４修回
　 ［基金项目］　国家科技支撑计划项目 “华中区域中药材规范化种植及大宗中药材综合开发利用技术研究”（２０１１ＢＡＩ０６Ｂ０６）；山东省科
技发展计划项目 “山东瓜蒌规范化种植及综合开发研究”（２０１１ＧＳＦ１１９０４）
　 ［作者简介］　于洪超 （１９９１－），男，在读硕士，研究方向：中药资源与质量控制。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｈｃ０１１１＠１６３．ｃｏｍ
　＊通讯作者： 郭庆梅 （１９６８－），女，教授，博士生导师，从事中药质量控制与资源研究方面的工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｍｇｕｏ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
［文章编号］１００１－３６０１ （２０１５）０８－０４５７－０２１３－０４
ＰＩＴＣ柱前衍生高效液相色谱法测定接骨木果实中氨基酸含量
于洪超１，马荣申２，郭庆梅１＊，周凤琴１，郭俊国３
（１．山东中医药大学 药学院，山东 济南 ２５０３５５；２．济南天红苗木种植技术研发中心，山东 济南
２５０４００；３．山东中医药大学眼科研究所，山东 济南２５０００２）
　　 ［摘　要］为了测定接骨木果实中游离氨基酸和水解氨基酸含量，采用ＰＩＴＣ柱前衍生高效液相色谱
法 （ＲＰ－ＨＰＬＣ）以异硫氰酸苯酯 （ＰＩＴＣ）作柱前衍生试剂，采用ＲＰ－ＨＰＬＣ梯度洗脱的方法测定接骨木
果实中的游离和水解氨基酸的峰面积并计算其含量。结果表明：接骨木果实中氨基酸和水解氨基酸的含量
分别为２．１０７％和７．２９７％；１８种氨基酸分离良好，线性关系良好，空白无干扰，精密度ＲＳＤ 在０．
６３４％～２．５３２％，稳定性ＲＳＤ在０．７２９％～２．７７４％，重复性ＲＳＤ在０．６６４％～２．８８４％，平均回收
率在９５．４９％～１０３．６７％，且ＲＳＤ均小于３％。ＲＰ－ＨＰＬＣ法灵敏、简便、快捷，能准确测定接骨木果
实中游离氨基酸和水解氨基酸的含量。
［关键词］接骨木；游离氨基酸；水解氨基酸；异硫氰酸苯酯；高效液相色谱法
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｆｒｕｉｔｓ　ｏｆ　Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｗｉｌｉａｍｓｉ　ｂｙ
ＰＩＴＣ　Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＲＰ－ＨＰＬＣ　Ｍｅｔｈｏｄ
ＹＵ　Ｈｏｎｇｃｈａｏ１，ＭＡ　Ｒｏｎｇｓｈｅｎ２，ＧＵＯ　Ｑｉｎｇｍｅｉ　１＊，ＺＨＯＵ　Ｆｅｎｇｑｉｎ１，ＧＵＯ　Ｊｕｎｇｕｏ３
（１．Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉ＇ｎａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ２５０３５５；２．Ｊｉ＇ｎａｎ　Ｔｉａｎｈｏｎｇ　Ｓｅｅｄｌｉｎｇ
Ｐｌａｎｔｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｊｉ＇ｎａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ２５０４００；３．Ｅｙｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｕ－
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ＴＣＭ，Ｊｉ＇ｎａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ２５０００２，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｒｅｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｒｕｉｔｓ　ｏｆ　Ｓ．ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ，
ｔａｋｉｎｇ　ｐｈｅｎｙｌ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＰＩＴＣ） ａｓ　ｔｈｅ　ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ，ＲＰ－ＨＰＬＣ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｔｈｅ　ｐｅａｋ　ａｒｅａ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｆｒｅｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：
Ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｒｕｉｔｓ　ｏｆ　Ｓ．ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ　ｗｅｒｅ　２．１０７％ａｎｄ
７．２９７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　１８ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｗａｓ　ｇｏｏｄ，ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗａｓ　ｇｏｏｄ，
ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｌａｎｋ　ｈａｄ　ｎｏ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｔｈｅ　ＲＳＤ ｏｆ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　０．６３４％ ａｎｄ　２．５３２％，ｔｈｅ
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　０．７２９％ａｎｄ　２．７７４％，ｔｈｅ　ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　０．６６４％ａｎｄ　２．８８４％，ｔｈｅ
ｓａｍｐｌｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　９５．４９％ａｎｄ　１０３．６７％，ａｎｄ　ｔｈｅ　ＲＳＤｗａｓ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　３％．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ
ｉｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔ　ａｎｄ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ　ａｎｄ　ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ；ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ；ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ；ＰＩＴＣ；ＨＰＬＣ
　　接骨木 （Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｗｉｌｌｉａｍｓｉ　Ｈａｎｃｅ）又名公
道老、马尿骚等，为忍冬科 （Ｃａｐｒｏｆｏｌｉａｃｅａｅ）接骨
木属 （Ｓａｍｂｕｃｕｓ　Ｌ．）植物［１］。接骨木的果实是一种
具有极高开发利用价值的功能性产品，除含有大量
对人体有益的不饱和脂肪酸外，还含有种类丰富的
氨基酸［２］。氨基酸含量是衡量接骨木果实营养价值
高低和资源开发利用价值的重要指标。氨基酸的分
析测定多是通过离子交换树脂分离，然后通过柱后
衍生化反应，再经紫外检测器检测分析，此方法分
析时间长、灵敏度低，且仪器复杂、价格昂贵，严
重限制其推广应用。随着色谱技术的进步，氨基酸
的色谱分析法得到发展。大多数的氨基酸不具有紫
外吸收，也不能发射荧光，氨基酸的测定通常需要
衍生化后进行。衍生试剂目前最为常用的是异硫氰
酸苯酯 （ＰＩＴＣ），其可同时检测一级和二级氨基酸，
衍生产物稳定，最小检出量达１ｐｍｏｌ，有去干扰方
法简单，检测方法简单等优点［３－８］。目前尚未有采用
高效液相色谱法测定接骨木果实中游离和水解氨基
酸的文献报道。因此，通过建立ＰＩＴＣ柱前衍生
ＨＰＬＣ法，结合紫外检测器测定接骨木果实中游离
和水解氨基酸含量并进行定量分析，为接骨木果实
的进一步开发利用提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 果实 接骨木果实２０１４年８月采于山
东省济南市平阴县，经山东中医药大学郭庆梅教授
鉴定为忍冬科 （Ｃａｐｒｏｆｏｌｉａｃｅａｅ）接骨木属 （Ｓａｍ－
　贵州农业科学　２０１５，４３ （８）：２１３～２１６
　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ｂｕｃｕｓ　Ｌ．）接骨木 （Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ　Ｈａｎｃｅ）
果实，晒干，备用。
１．１．２ 仪器和试剂 戴安 Ｕ－３０００液相色谱仪
（ＵＬＴＩＭＡＴＥ　３０００ＰＵＭＰ，ＵＬＴＩ－ＭＡＴＥ　３０００
ＡＵＴＯＳＡＭＰＬＥＲ，ＵＬＴＩＭＡＴＥ　３０００ ＲＳ　ＣＯＬ－
ＵＭＮ　ＣＯＭＰＡＲＴ－ＭＥＮＴ　ＵＬＴＩＭＡＴＥ　３０００ＤＩ－
ＡＯＤＥ　ＡＲＲＡＹ　ＤＥＴＥＣＴＯＲ），ＫＱ－２５０Ｂ型超声
波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司），ＭＳ２０５ＤＵ
十万分之一天平 （德国梅特勒公司），ＦＷ１３５高速
粉碎机 （北京市永光明医疗器械有限公司），恒温
干燥箱 （上海精宏实验设备有限公司），ＴＧ１６－Ｗ
高速离心机 （长沙湘仪离心机仪器有限公司）。１８
种氨基酸对照品 （中国药品生物制品检定所，批
号：１４０６２７－２００８０５），ＰＩＴＣ （优级纯，阿拉丁公
司），乙腈 （色谱级，美国天地试剂公司），醋酸
钠、三乙胺等试剂均为分析纯。
１．２ 试剂、对照品及样品溶液的配制
１．２．１ 试剂配制 流动相Ｂ （醋酸钠缓冲液－乙
腈溶液）：精密称取乙酸钠１２．６ｇ，以９２５ｍＬ水
溶解后，加７０ｍＬ乙腈，充分摇匀，以冰醋酸调
试液ｐＨ 至６．５。衍生试剂 Ａ （０．１ｍｏＬ／Ｌ的
ＰＩＴＣ乙腈溶液）：精密量取０．３ｍＬ　ＰＩＴＣ，加乙
腈定容至２５ｍＬ棕色容量瓶中，摇匀。衍生试剂Ｂ
（１ｍｏＬ／Ｌ三乙胺乙腈溶液）：精密量取１．３ｍＬ
三乙胺，加乙腈定容至１０ｍＬ棕色容量瓶中，摇
匀。
１．２．２ 对照品溶液的制备 精密称取干燥后的
１８种氨基酸对照品适量，以０．１ｍｏＬ／Ｌ的盐酸
定容至１０ｍＬ棕色容量瓶中，得各对照品溶液。
分别取各对照品溶液１ｍＬ置于２５ｍＬ棕色容量瓶
中，以０．１ｍｏＬ／Ｌ的盐酸定容，得１８种氨基酸的
混合对照品溶液。
１．２．３ 样品游离氨基酸的制备 精密称定干燥
后的接骨木果实粉末１ｇ （４０目筛），置于三角烧
瓶中，加水３０ｍＬ，浸泡３ｈ，６０℃条件下超声处
理３０ｍｉｎ，过滤，滤渣重复提取２次，合并过滤
液，定容至１００ｍＬ，即得。
１．２．４ 样品水解氨基酸的制备 精密称定干燥
后的接骨木果实粉末０．１ｇ （４０目筛），置于安剖
瓶中，加入６ｍｏＬ／Ｌ的盐酸溶液５ｍＬ，瓶中充氮
气后封口，于１２０℃烘箱中加热２２ｈ，取出放冷，
过滤后滤液蒸干，以０．１ｍｏＬ／Ｌ的盐酸溶解，定
容至２ｍＬ容量瓶中，即得。
１．３ ＰＩＴＣ衍生化反应
精密量取空白、对照品、样品溶液各２００μＬ，
分别加入衍生试剂 Ａ、衍生试剂Ｂ各１００μＬ，充
分混匀，室温静置１ｈ，加入正己烷６００μＬ，充分
混匀后静置２０ｍｉｎ，１０　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，分
层后，取下层溶液，用０．４５μｍ 滤膜过滤，即
得。
１．４ 色谱条件及系统适用性
色谱柱Ｖｅｎｕｓｉｌ　ＭＰ－Ｃ１８ （２．１ｍ×１００ｍｍ×
３μｍ）柱温３０℃，检测波长２５４ｎｍ，进样量２
μＬ。流动相 Ａ 为７５％的乙腈－水溶液，流动相Ｂ
为醋酸钠缓冲液－乙腈溶液。梯度洗脱程序：０
ｍｉｎ，０％Ａ；６ｍｉｎ，６％Ａ；１５ｍｉｎ，９％Ａ；２０
ｍｉｎ，２１％Ａ；３２ｍｉｎ，４５％Ａ；３４ｍｉｎ，５５％Ａ；
４０ｍｉｎ，１００％Ａ；４８ｍｉｎ，０％Ａ。流速为０．８
ｍＬ／ｍｉｎ。
１．５ 方法学考察
１．５．１ 线性关系考察 分别精密量取氨基酸混
合对照品０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、
５ｍＬ置于１０ｍＬ棕色容量瓶中，以０．１ｍｏＬ／Ｌ
盐酸定容至刻度，按照１．３项下方法进行衍生化
后测定，绘制色谱图。以氨基酸峰面积ｙ对氨基
酸质量浓度ｘ进行回归处理。
１．５．２ 精密度及稳定性试验 精密量取混合对
照品２００μＬ，按照１．３项下方法进行衍生化后连
续进样５次以及分别在０ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ、
２４ｈ进样，记录色谱图，以峰面积为指标计算
ＲＳＤ，考察其精密度和稳定性。
１．５．３ 重复性试验 精密称取同批接骨木果实
粉末５份，按１．２项下方法制备、１．３项下方法
衍生化后测定，记录色谱图，以峰面积为指标计算
ＲＳＤ，考察其重复性。
１．５．４ 回收率试验 精密量取１．２项下制备
的接骨木样品水解氨基酸５份各１００μＬ，分别加
入１００μＬ氨基酸混合对照品溶液，按照１．３项下
方法衍生化后测定，计算回收率。
１．６ 样品测定
精密量取１．２项下制备的游离氨基酸和水解
氨基酸溶液各３份，每份２００μＬ按照１．３项下方
法衍生化后测定。
２ 结果与分析
２．１ 果实氨基酸的ＨＰＬＣ图谱
果实氨基酸衍生化后的色谱图见图示。
２．２ 方法的线性关系、精密度、稳定性及重复
性
从表 １ 看出，１８ 种氨基酸的线性范围在
０．０１８　６４～０．３４４　８ｍｇ／ｍＬ，相关系数均在０．
９９９以上，说明线性关系良好；精密度试验ＲＳＤ
在０．６３４％～２．５３２％ （ｎ＝５），稳定性试验ＲＳＤ
在０．７２９％～２．７７４％ （ｎ＝６），均在要求范围
内。游离、水解氨基酸的重复性试验ＲＳＤ 在０．
６６４％～２．８８４％ （ｎ＝５），方法具有很好的可重
复性。
２．３ 回收率
从表２看出，１８种氨基酸的平均回收率在
９５．４９％～１０３．６７％ （ｎ＝５），且ＲＳＤ小于３％。
·４１２·
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　贵 州 农 业 科 学
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
　注：Ａ为空白对照，Ｂ为１８种氨基酸的对照，Ｃ为接骨木果实游离氨基酸，Ｄ为接骨木果实水解氨基酸。１为门冬氨酸 （ａｓｐ），２为谷氨
酸 （ｇｌｕ），３为丝氨酸 （ｓｅｒ），４为甘氨酸 （ｇａｌ），５为组氨酸 （ｈｉｓ），６为精氨酸 （ａｒｇ），７为苏氨酸 （ｔｈｒ），８为丙氨酸 （ａｌａ），９为脯氨酸
（ｐｒｏ），１０为酪氨酸 （ｔｙｒ），１１为缬氨酸 （ｖａｌ），１２为甲硫氨酸 （ｍｅｔ），１３为胱氨酸 （ｃｙｓ），１４为异亮氨酸 （ｉｓｏ），１５为亮氨酸 （ｌｅｕ），１６
为苯丙氨酸 （ｐｈｅ），１７为色氨酸 （ｔｒｐ），１８为赖氨酸 （ｌｙｓ）。
　Ｎｏｔｅ：Ａ，Ｂ，Ｃ　ａｎｄ　Ｄ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ，ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　１８ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｒｕｉｔ　ｏｆ　Ｓ．ｗｉｌｉａｍｓｉ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ
ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｒｕｉｔ　ｏｆ　Ｓ．ｗｉｌｉａｍｓｉ．１～１８ｗｅｒｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｓｐ，ｇｌｕ，ｓｅｒ，ｇａｌ，ｈｉｓ，ａｒｇ，ｔｈｒ，ａｌａ，ｐｒｏ，ｔｙｒ，ｖａｌ，ｍｅｔ，ｃｙｓ，ｉｓｏ，ｌｅｕ，ｐｈｅ，
ｔｒｐ　ａｎｄ　ｌｙｓ．
图示 空白溶液、氨基酸对照品及接骨木果实氨基酸ＨＰＬＣ图谱
Ｆｉｇ．　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ，ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｒｕｉｔ　ｏｆ　Ｓ．ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ
表１ 氨基酸的线性关系、精密度、稳定性及重复性
Ｔａｂｌｅ　１　Ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎ，ａｃｃｕｒａｃｙ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
氨基酸
Ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ
标准曲线
Ｓｔａｎｄａｒｄ
ｃａｒｖｅ
线性范围ｍｇ／ｍＬ
Ｌｉｎｅａｒ
ｒａｎｇｅ
相关系数
Ｒ２
精密度／％
Ａｃｃｕｒａｃｙ
稳定性／％
Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
水解氨基酸
重复性／％
Ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ
ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
游离氨基酸
重复性／％
Ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ
ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
ａｓｐ　 ｙ＝３１．０８２ｘ＋０．１０９　１　０．０２３　２０～０．２３２　０　０．９９９　６　 １．３４１　 ０．９５６　 １．８５３　 １．７５１
ｇｌｕ　 ｙ＝２１．９３５ｘ＋０．０６２　７　０．０２２　１６～０．２２１　６　０．９９９　３　 ２．１８８　 ２．４７６　 ２．３２１　 ２．６１１
ｓｅｒ　 ｙ＝４０．０１８ｘ－０．００６　３　０．０２０　３２～０．２０３　２　１．０００　０　 ０．９８７　 １．０１１　 ０．６６４　 １．５７４
ｇａｌ　 ｙ＝９６．５０５ｘ－０．０１５　１　０．０１８　８０～０．１８８　０　０．９９９　９　 １．７９１　 １．２３４　 １．２４７　 １．４８７
ｈｉｓ　 ｙ＝４１．２７２ｘ－０．０１８　６　０．０２７　７２～０．２７７　２　０．９９９　８　 ２．２９５　 １．５５４　 ２．１２５　 ２．５１９
ａｒｇ　 ｙ＝１８．２１８ｘ＋０．０１２　８　０．０２３　０８～０．２３０　８　０．９９９　５　 ０．６３４　 ２．７５３　 １．９６４　 ２．２３１
ｔｈｒ　 ｙ＝４２．００３ｘ－０．０１５　５　０．０２８　１６～０．２８１　６　０．９９９　２　 ２．５３２　 ２．６３８　 ２．８８４　 １．５４９
ａｌａ　 ｙ＝４５．１５３ｘ－０．０２４　１　０．０３２　５６～０．３２５　６　０．９９９　３　 １．２０２　 ２．２１５　 １．６８５　 ２．７９２
ｐｒｏ　 ｙ＝１０８．９３ｘ－０．０６７　１　０．０２０　５２～０．２０５　２　０．９９９　７　 ２．０５７　 １．２９０　 １．９４２　 ０．８８９
ｔｙｒ　 ｙ＝１４．６３２ｘ－０．００５　２　０．０２４　５６～０．２４５　６　０．９９９　９　 ２．２３８　 ２．１６９　 ２．５５６　 １．１１６
ｖａｌ　 ｙ＝６０．２７２ｘ－０．０１１　９　０．０２５　３２～０．２５３　２　１．０００　０　 １．２３８　 ２．４９７　 １．０２５　 １．５９７
ｍｅｔ　 ｙ＝３９．１６８ｘ－０．０１２　 ０．０２０　８８～０．２０８　８　０．９９９　９　 ２．４０７　 ２．６１２　 ０．９４１　 １．７１６
ｃｙｓ　 ｙ＝４８．７２３ｘ＋０．０３２　３　０．０２０　２８～０．２０２　８　０．９９９　３　 １．３２５　 ０．７２９　 １．５８５　 １．４３８
ｉｓｏ　 ｙ＝４２．８２ｘ－０．０３１　５　 ０．０３４　４８～０．３４４　８　１．０００　０　 １．３１１　 ０．９９８　 ２．７８４　 １．４１７
ｌｕｅ　 ｙ＝４５．９７６ｘ－０．０１６　４　０．０２３　４～０．２３４　 １．０００　０　 ２．２０４　 ２．３９７　 ２．６８９　 ２．５３８
ｐｈｅ　 ｙ＝４１．１９ｘ－０．００９　５　 ０．０２１　７６～０．２１７　６　０．９９９　６　 ２．１７０　 １．８７１　 １．１１２　 ０．９７２
ｔｒｐ　 ｙ＝４３．４９３ｘ－０．００５　１　０．０１８　６４～０．１８６　４　１．０００　０　 １．７００　 ２．７７４　 ０．８７１　 １．６６５
ｌｙｓ　 ｙ＝９４．９７３ｘ－０．０６６　５　０．０２１　３６～０．２１３　６　０．９９９　８　 １．１０５　 １．２１４　 １．８９１　 ０．９３３
表２ 氨基酸的加样回收率 （ｎ＝５）
Ｔａｂｌｅ　２　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ ％
氨基酸
Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
平均回收率
Ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ
ＲＳＤ
ａｓｐ　 ９５．４９　 ２．５１
ｇｌｕ　 １０２．１１　 ０．７８
ｓｅｒ　 ９６．９８　 １．１５
ｇａｌ　 ９７．２４　 １．４６
ｈｉｓ　 １００．３８　 ２．２９
ａｒｇ　 ９６．４４　 １．２７
ｔｈｒ　 １００．１３　 ２．３３
ａｌａ　 ９９．７２　 １．５９
ｐｒｏ　 ９７．１８　 １．８２
ｔｙｒ　 ９９．３６　 ２．３１
ｖａｌ　 １０２．５４　 １．８５
ｍｅｔ　 １００．３６　 ２．４７
ｃｙｓ　 ９７．４２　 １．２２
ｉｓｏ　 ９８．７３　 １．６１
ｌｕｅ　 ９５．８２　 ２．７９
ｐｈｅ　 １０３．６７　 ２．０３
ｔｒｐ　 １００．６９　 ２．４１
ｌｙｓ　 ９９．４９　 １．６２
表３ 接骨木果实中的游离氨基酸和水解氨基酸含量 （ｎ＝３）
　　Ｔａｂｌｅ　３　Ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ　ａｎｄ　ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｒｕｉｔ　ｏｆ　Ｓ．ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ ％
氨基酸
Ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ
游离氨基酸
Ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ
水解氨基酸
Ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ　ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄａｓｐ
ａｓｐ　 ０．１８５　０　 ０．５６７　０
ｇｌｕ　 ０．０１８　３　 １．２８２　０
ｓｅｒ　 ０．０３５　６　 ０．１８１　０
ｇａｌ　 ０．００２　７　 ０．４５５　０
ｈｉｓ　 ０．４３４　０　 ０．２６６　０
ａｒｇ　 ０．２６１　０　 ０．９４４　０
ｔｈｒ　 ０．０１０　０　 ０．１１９　０
ａｌａ　 ０．０１１　６　 ０．１１４　０
ｐｒｏ　 ０．０６８　７　 ０．５２３　０
ｔｙｒ　 ０．５９３　０　 ０．７５１　０
ｖａｌ　 ０．０５６　７　 ０．３１０　０
ｍｅｔ　 ０．００１　５　 ０．０２５　３
ｃｙｓ　 ０．００９　９　 ０．０１８　９
ｉｓｏ　 ０．０４３　０　 ０．３６５　０
ｌｕｅ　 ０．２７９　０　 ０．７３０　０
ｐｈｅ　 ０．０６０　４　 ０．３１８　０
ｔｒｐ　 ０．０２１　８　 ０．０２５　２
ｌｙｓ　 ０．０１９　６　 ０．３０２　０
·５１２·
　于洪超 等　ＰＩＴＣ柱前衍生高效液相色谱法测定接骨木果实中氨基酸含量
　ＹＵ　Ｈｏｎｇｃｈａｏ　ｅｔ　ａｌ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｆｒｕｉｔｓ　ｏｆ　Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ　ｂｙ　ＰＩＴＣ　Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＲＰ－ＨＰＬＣ　Ｍｅｔｈｏｄ
２．４ 接骨木果实中游离、水解氨基酸含量
从表 ３ 看 出，１８ 种 游 离 氨 基 酸 含 量 在
０．００１　５％～０．５９３　０％，其中，酪氨酸含量最
高，甲硫氨酸含量最低，游离氨基酸总量为２．
１０７％。１８种水解氨基酸含量０．０１８　９％～１．２８２
０％，以谷氨酸含量最高，胱氨酸含量最低，游离
氨基酸总量为７．２９７％。
３ 结论与讨论
１） 氨基酸是人体必不可少的营养成分，是衡
量接骨木果实营养价值高低和资源开发利用价值的
重要指标。采用 ＨＰＬＣ法测定氨基酸常用的衍生
化试剂有ＰＩＴＣ、邻苯二甲醛、丹酰氯、２，４－二硝
基氟苯、氯甲酸芴甲酯等［９－１１］。其中ＰＩＴＣ衍生后
在氨基酸结构中引入苯环，可被紫外检测器 （２５４
ｎｍ）检测而使其应用更为普遍。试验采用ＰＩＴＣ
柱前衍生高效液相色谱法测定接骨木果实中游离和
水解氨基酸含量，与传统的采用氨基酸测定仪测定
氨基酸含量相比，不需昂贵的专用仪器、设备和配
套试剂等条件，具有选择性高，分离度好，方法简
便快速等优点。
２）试验考察了衍生试剂的用量、衍生时间以
及萃取试剂正己烷的用量等实验条件的影响，发现
衍生试剂Ａ和衍生试剂Ｂ为１００μＬ，时间为１ｈ，
萃取试剂为６００μＬ时，衍生完全，产物单一稳定，
色谱柱残留量低。试验还考察了不同色谱柱对１８
种氨基酸分离度的影响，发现采用 Ａｃｃｌａｉｍ　１２０Ａ
Ｃ１８色谱柱、ｔｈｅｒｍｏ　Ｃ１８色谱柱、Ａｃｃｌａｉｍ　１２０Ａ
Ｃ１８等色谱柱时，丙氨酸与脯氨酸，亮氨酸与异亮
氨酸的色谱峰分离度差，而采用 Ｖｅｎｕｓｉｌ　ＭＰ－Ｃ１８
色谱柱，各个氨基酸可达到良好的分离。
３）对接骨木果实中游离和水解氨基酸含量的
测定结果发现，所测的１８种氨基酸都可在接骨木
果实中发现，１８种水解氨基酸的总含量为 ７．
２９７％，游离氨基酸含量为２．１０７％。游离氨基酸
和水解氨基酸中含量最高的分别是酪氨酸和谷氨
酸。必需氨基酸是人体不能合成或合成速度达不到
机体要求的一类氨基酸，接骨木果实中必需氨基酸
含量较高，游离氨基酸和水解氨基酸中含有的人体
必需氨基酸含量分别为０．４９２％、２．１９４％。试
验结果表明，ＰＩＴＣ柱前衍生 ＨＰＬＣ法测定接骨木
果实中氨基酸，方法简便、快速、精密度高、重复
性好、结果准确可靠，能用于接骨木果实及其相关
产品氨基酸含量测定，可为接骨木果实的进一步开
发利用提供试验基础。
［参 考 文 献］
［１］ 江苏新医学院．中药大辞典 （下册） ［Ｍ］．上海：
上海科学技术出版社，１９８５：２０９３．
［２］ 杜凤国，孙广仁．接骨木果实营养成分的分析
［Ｊ］．自然资源，１９９６ （４）：４５－４７．
［３］ Ｒａｍｏｎ　Ｃｈｅｃａ－Ｍｏｒｅｎｏ，Ｅｌｏｉｓａ　Ｍａｎｚａｎｏ．Ｒｅｖｉｓｉｔａｔｉ－
ｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｔｈｉｏ　ｃｙａｎａｔｅ－ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
ｆｏｒ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｂｙ　ＨＰＬＣ－ＵＶ ［Ｊ］．
Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏ－ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２００８，３１：３８１７－３８２８．
［４］ ＭＣａｌｕｌ，Ｊ　Ｆａｂｒｅｇａｓ，Ｆ　Ｂｏｒｒｕｌ．Ｄｅｔｅｍｕｎａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ｂｙ　ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉ－ｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐｈｅｎｙ－
ｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ．ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｗｉｎｅ　ｓａｍｐｌｅｓ ［Ｊ］．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ，１９９１，３１：２７２－２７６．
［５］ 孔 浩，郭庆梅，郭新苗，等．柱前衍生高效液相
色谱法测定瓜蒌皮中游离氨基酸含量 ［Ｊ］．山东中
医药大学学报．２０１４，３８ （３）：２５４－２５６．
［６］ 屠春燕，葛佳璐，吴燕娇，等．新型衍生试剂柱前
衍生氨基酸的高效液相色谱分析 ［Ｊ］．分析测试学
报，２００８，２７ （７）：６８１－６８５．
［７］ 章　丽，刘松雁．氨基酸测定方法的研究进展
［Ｊ］．河北化工，２００９，３２ （５）：２７．
［８］ 马晓丽，赵东升，孙自增，等．柱前衍生高效液相
色谱法测定新疆金鸡菊中游离氨基酸 ［Ｊ］．中成
药，２０１２，３４ （１２）：２４４７－２４４９．
［９］ 郭俊国，解孝锋，毕宏生．ＰＩＴＣ柱前衍生 ＨＰＬＣ
法测定莞蔚子中游离和水解氨基酸的含量 ［Ｊ］．中
华中医药杂志，２０１５，３０ （１）：９１－９４．
［１０］ 于 鸿，牟世芬．氨基酸分析方法的研究进展
［Ｊ］．分析化学，２００５，３３ （３）：３９８－４０４．
［１１］ 刘丽敏，王海敏，虞海霞，等．柱前衍生反相高效
液相色潽法测定西洋参中游离氨基酸 ［Ｊ］．中成
药，２００９，３ （２）：２７５－２７８．
（责任编辑：聂克艳）
·６１２·
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　贵 州 农 业 科 学
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ