全 文 ：带 ,而且还能分离 2 ～ 3kD 的肽段[ 2] 。更小的分子则难以分离。先前报道利用 16.5%的尿素胶能分离小至 1kD 的肽
段[ 1] 。后来国内也有多篇报道模仿该方法。作者发现 , 利用这种凝胶在 Tricine-SDS-PAGE 系统中虽能分离小至 1kD的肽段 ,但效果并不理想 , 主要表现为 1kD小分子成分形成的带型弥散 ,如图 2 的泳道 L所示。调整聚丙烯酰胺凝胶的分子组成后 ,可以改善分离小分子肽的效果。采用“5C+U”丙烯酰胺溶液配成的聚丙烯酰胺尿素胶,使丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联度为5.05%,分离特小分子量的蛋白质标准品 L(C6210 , Sigma),可见清晰的6 条带,而且 1kD的小肽的带型也非常清晰(如图 3的泳道 L 所示),明显优于以往尿素胶等凝胶的分离效果。可见 ,调整凝胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的分子比例可直接影响凝胶的分离效果 ,这是由于二者的比
例影响凝胶的分子间隙[3] 。调整分子比例后, 使凝胶分子结构更致密 ,更有利于小分子肽的分离。
附图　不同凝胶的Tricine-SDS-PAGE分离蛋白质样品效果的比较　1为普通胶的 PAGE图;2为甘油胶的PAGE图;3为尿素胶的
PAGE图;4为快速聚合尿素胶的 PAGE图。M泳道为低分子量蛋白标准品电泳结果;L为特低分子量蛋白标准品的电泳结果;
S泳道为昆虫细胞培养液样品的电泳图谱。
但是 , 即使利用凝胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺分子的这种交联度 ,单凭这两种分子本身组成的凝胶还不能分离 1kD 的肽段。该凝胶分离特小分子量的蛋白质标准品 L , 仅分辨出 5 条带 ,没有显示出 1kD的肽段(如图 1 的泳道 L所示)。加入 13.
3%的甘油制作甘油胶 , 能分离出标准品(L)中分子更小的蛋白质 , 但1kD带弥散(如图 2泳道 L所示)。加入尿素后的凝胶能清晰地显示 1kD的带型(如图 3 泳道 L)。可见 , 尿素能明显改善小分子的分离效果。但尿素胶的分离效果还与凝胶的聚合速度有关。试验结果显示 ,不同浓度的催化剂聚合的凝胶不一样。 常规 Tris-
SDS-PAGE一般加入 1%体积比的 10%AP[ 3] , 用 Tricine-SDS-PAGE 时 ,一般加入 0.5%体积比的 10% AP[ 1] , 为了比较聚丙烯酰胺聚合速度对电泳的影响 , 采用快速聚合和慢速聚合两种方式。临灌胶前 , 快速聚合致密胶加入 20μL 10%的 AP和 2μL TEMED 加速丙烯酰胺的聚合。慢速聚合致密胶加入
10μL AP和 1μL 的 TEMED, 使胶中 AP 的含量分别调整为 0.
67%与 0.33%。结果显示 , 快速聚合的尿素胶与夹层胶之间容易形成断层 , 影响蛋白质的带型 ,如图 4 所示。而慢速聚合的尿素胶分离效果明显改善 , 如图 3所示。
4　结论
Tricine-SDS-PAGE 系统是分离小分子肽的简便有效的方法 , 分离胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的比例和浓度是影响分离效果的重要因素。而尿素能明显改善对小分子肽的分离效果 , 加入 36%的尿素可以有效分离分子量 1kD的小肽。 不过尿素胶的聚合速度也是一个重要因素 , 制备尿素胶时 , 宜采用低浓度的 AP和 TEMED ,使凝胶慢速聚合 , 才能获得好的分离效果。参考文献:[ 1] Schagger H , von Jagow G.Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid
gel electroporesis for the separation of proteins in the range from 1 to 100kDa[ J] .Analytical Biochemistry, 1987 ,166:368-379.[ 2] 曹佐武.小分子肽的 Tricine-SDS-PAGE分离方法[ J] .生物学通报 , 2003, 38(3):55-56.[ 3] Sambrook J , Fritsch EF , Maniatis T.Molecular Cloning[ M] .2nd edition.
New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989.1847-1848.
从喜树叶中提取喜树碱工艺研究张志信1 ,张仕秀2 ,宋关斌1(1.重庆大学生物工程学院 , 重庆 400044;2.文山师范高等专科学校 , 云南 文山 663000)摘要:为优化从喜树叶中提取喜树碱工艺条件 , 以 10kg 喜树叶为原料得到的提取物中所含喜树碱的质量为指标 , 采用四因素三水平正交设计法 ,筛选影响喜树碱提取工艺的因素 ,探索最优的提取工艺条件。实验证明 ,合理的提取方法为:pH 值为 1.9的酸水法浸提 3次 , 上离子交换柱 ,用 pH 为 3.5 的 81%的乙醇溶液洗脱 ,从 10kg 喜树叶中得到 2.740 提取物 ,其中喜树碱的含量为 98.52%。关键词:喜树碱;喜树叶;正交实验;提取工艺中图分类号:Q946.88　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2003)05-0024-02
收稿日期:2003-03-13;修回日期:2003-05-20作者简介:张志信(1970-),男 ,硕士 ,研究方向:植物活性成分, 发表论文 10余篇 , E-mail:zhangzx2002@tom.com。
　　珙桐科喜树(Camptotheca acuminata Decne)是中国南方的一种特产植物 ,主产于江西 、浙江 、湖南 、湖北 、四川 、云南 、贵州 、广西 、广东等地 , 其木部 、根皮和种子中含有生物碱 , 在根部中的含量约为 0.05%, 种子中约有 0.07%, 其中以喜树碱(Camptothecine)为主要成分 , 还含有少量 10-羟基喜树碱以及类似结构的衍生物。喜树碱具有抗癌活性 , 对肝癌 、胃癌 、白
血病 、膀胱癌等有一定的疗效[ 1 , 2] 。文献报道的喜树碱的一般提取方法是用喜树的树皮或种子为原料 , 采用醇提法提取喜
树碱[ 3] 。而用喜树叶为原料 , 利用酸水法提取喜树碱的方法未见报道。本文以喜树叶为原料 , 以喜树碱的收率为指标 , 对用酸水法提取喜树碱的方法进行考察 , 采用四因素三水平正交设计法筛选影响喜树碱提取工艺的因素 , 探索经济的喜树碱提取工艺。
1　实验材料
1.1　仪器与试剂仪器:OS101-1电动鼓风电热干燥箱(重庆银河试验仪器公司), PHS-2型酸度计(国产), EL-131Buchi旋转蒸发器(瑞士), 离子交换柱(自制)。试剂:盐酸(AR)、乙醇(医用)、甲醇(AR)、氯仿(AR)。
1.2　供试品喜树叶采自云南元阳 ,经鉴定为珙桐科植物喜树(Campto-
theca acuminata Decne)的叶 , 阴干备用。
2　方法与结果
2.1　正交表设计:将酸水的 pH 值 、洗脱液乙醇的浓度 、洗脱
液乙醇溶液的 pH值和浸提次数四个因素的三个水平[4](见表
1), 用 L9(34)正交表[ 5 , 6](见表 2),分别按下列工艺进行提取。
表 1　L9(34)因素和水平
Table 1 The factor-level table of orthogonal design
水平
Level
酸水 pH
Acid water pH
A
乙醇浓度
Alcohol
Concentration
B(%)
乙醇溶液 pH
Alcohol pH
C
浸提次数
Soaking
extrction times
D(times)
1 1.5 81 3.0 1
2 1.9 77 3.5 2
3 2.3 73 4.0 3
表 2　L9(34)正交试验结果
Table 2 Orthogonal design and results因素 Factors 指标 Index
得率 含量 提取物量Yi
ExDraction CamptothcineCamptothcine
A B C D rate(/万) content(%) amount(g)试验号
Number
1 1 1 1 1 1.785 97.56 1.741
2 1 2 2 2 2.376 97.32 2.312
3 1 3 3 3 2.274 96.43 2.192
4 2 1 2 3 2.740 98.52 2.699
5 2 2 3 1 1.879 97.78 1.837
6 2 3 1 2 2.453 97.50 2.392
7 3 1 3 2 2.347 96.67 2.269
8 3 2 1 3 2.578 97.85 2.523
9 3 3 2 1 1.752 96.75 1.695
喜树碱量
Camptohcine
amount
K1 6.246 6.709 6.656 5.273
K2 6.928 6.672 6.706 6.973
K3 6.487 6.280 6.299 7.415
K1 2.082 2.236 2.219 1.758
K2 2.309 2.224 2.235 2.324
K3 2.162 2.039 2.100 2.472
R1 0.227 0.143 0.135 0.714
2.2　工艺流程:喜树叶粗粉※酸水浸提 3 次※收集 3 次浸提液※上离子交换柱※乙醇溶液洗脱※收集洗脱液※60℃以下减压蒸馏回收乙醇※氯仿萃取※回收氯仿※粗喜树碱※氯仿
第 13卷第 5 期:24
2003 年 10 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.13 , No.5:24
Oct.2003
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2003.05.015
-甲醇(1:1)重结晶※喜树碱。
2.3　含量测定方法:利用高效液相色谱法(HPLC), 取 10mg 样品溶于适量甲醇 ,水浴加热至完全溶解 , 冷至室温用甲醇定容至100ml。色谱条件:岛津 10 光二极管振列检测器 , 色谱柱检测波长 254nm。流动相:甲醇:水(60:40)流速:1.0ml min , 柱温:26℃。所用试剂均为分析纯;水为重蒸水 , 保留时间不得低于 25min(云南省药检所提供)。表 3　喜树碱方差分析
Table 3 Variance analysis of Camptothecine误差来源
Error source 偏差平方和 ss 自由度f 方差s 方差比F 显著性P＊
A 0.0803 2 0.04015 2.509
B 0.0393 2 0.01965 1.228
C 0.032 2 0.016 1
D 0.855 2 0.4275 26.719 ＊
误差 Error 0.032 2 0.016
　　F1-0.1(2 , 2)=9;F1-0.05(2 , 2)=19;F1-0.01(2 , 2)=99
3　分析与讨论
3.1　以提取物中所含喜树碱的质量为考察指标 , 由表 2 的 R值可以看出 ,因素对指标影响大小的次序为 D※A※B※C。即浸提次数对实验结果影响最大 , 提取用酸水的 pH 值次之 , 洗脱用乙醇溶液的 pH 值影响最小。从极差分析与方差分析的结果可以看出 ,提取工艺条件为 A2B1C2D3。即提取酸水的 pH
值为 1.9 ,洗脱用乙醇溶液的浓度为 81%, pH 值为 3.5 , 浸提 3次。由表 2可知最终的提取工艺与正交试验中试验号 4 的条件相符 , 提取物得率为 2.740 万 ,喜树碱含量为 98.52%。
3.2　从喜树叶中提取喜树碱是喜树资源开发的一种有效途径 ,以往用树皮和种子为原料 , 虽然喜树碱的含量较高 , 但不利于喜树资源的保护 , 而用喜树叶为原料提取喜树碱不失为一种开发喜树资源的可持续方法。
3.3　在实验中氯仿易挥发 , 为减少挥发可在其中加入 5%的
95%的乙醇 , 同时萃取时不宜激烈摇动 , 减少乳化现象 , 回收溶剂时防止泄漏。
3.4　酸水法提取喜树碱与醇提法相比较 , 具有节约溶剂 , 降低成本之优点 , 同时对提取设备的要求不高 ,可减少投资 , 是一种科学 、经济的喜树碱提取工艺。参考文献:[ 1] 四川医学院.中草药学[M] .北京:人民卫生出版社, 1978.273.[ 2]王洋 ,于涛 ,张玉红 ,等.从喜树叶中碱法提取喜树碱新工艺[ J] .中草药 , 2001 , 32(10):882-884.[ 3] 杨云 ,冯卫生.中药化学成分提取分离手册[ M] .北京:中国中医药出版社 , 1998.337-338.[ 4] 黄平权 ,张友珠.用正交实验法探讨降压灵总碱最佳提取工艺[ J] .中草药 , 1994 , 25(11):582-583.[ 5] 刘辉琳 ,唐明林.杜仲药用有效成分提取方法研究[ J] .天然产物研究与开发 , 2002 , 14(6):47-49.[ 6] 王锦军 ,张延召 ,田平林.反相离子对高液相色谱法优选去氢骆驼蓬碱提取工艺的初步研究[ J] .天然产物研究与开发 , 2002 , 14(3):63-
65.
固定化海洋微藻对污水中 Ni2+的吸附张欣华 ,杨海波 ,李英敏 ,吕福荣 ,于媛 ,刘艳(大连大学化学与化学工程系 ,辽宁 大连 116622)
摘要:采用海藻酸钠包埋小球藻和叉鞭金藻 ,制得含藻细胞的固定化胶球 , 用其对 Ni2+进行生物吸附 ,研究了固定化小球藻
和固定化叉鞭金藻对污水中 Ni2+的吸附率。结果表明:对于同一种固定化微藻 ,处于对数生长中期时对 Ni2+吸附效果较好 , 且吸
附过程主要在前 4h完成;Ni2+浓度越大 ,吸附率越高;固定化微藻比悬浮态微藻吸附率高;在相同的实验条件下 , 固定化小球藻比固定化叉鞭金藻吸附率高。
关键词:固定化;微藻;Ni2+;吸附率中图分类号:Q949.208　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2003)05-0025-03
Studies on the Absorbance of Ni
2+
by Immobilized Marine Microalgae
ZHANG Xin-hua ,YANG Hai-bo , LI Ying-min ,LV Fu-rong ,YU Yuan ,LIU Yan(Department of Chemist ry and Chemical Engineering ,Dalian University , Dalian 116622 , PRC)
Abstract:By means of the pellets of Chlorella spp.and Dicrateria spp.immobilized by alginate as matrix to bio-absorb Ni2+ , the absorbance rate
of Ni2+ in man-madewater by immobilized Chlorella spp.and Dicrateria spp.were studied.The results showed that for the same immobilized mi-
croalga , the absorbance effect of Ni2+was better in it s log growth middle phase , and the absorbance process was finished within 4 hours;the higher
concentration of Ni2+ , the higher absorbance ratewas;and the absorbance ratewas higher in immobilized state than in suspended state.In the same
experimental conditions , the absorbance rate of Ni2+ by immobilized Chlorella spp.was higher than that by immobilized Dicrateria spp.
Key words:immobilization;microalgae;Ni2+;absorbance rate
收稿日期:2003-04-07;修回日期:2003-06-15基金项目:辽宁省博士科研启动基金资助项目(项目编号:001059)作者简介:张欣华(1954-),女 ,教授 ,从事基础化学教学及海洋微藻应用的研究 ,发表论文 20余篇。
　　利用藻类生物富集金属处理废水 、净化水体是近几年发
展起来的污水处理途径。许多学者[ 1 ,2] 探研了用悬浮态海洋微藻直接吸附和收集污水中重金属离子。随着研究深入 , 发现用悬浮态微藻直接收集金属离子 , 存在着细胞浓度低 , 收集困难 、微藻的培养需用场地大 、细胞生长易衰老等问题。而近几年刚刚起步的固定化藻类细胞净化污水 , 显现了潜在的应用价值和前景。有关固定化微藻对污水中重金属的吸收 , 仅
见武汉大学的严国安等研究了 Hg2+对固定化小球藻污水净化及生理特征的影响。其表明:利用固定化微藻处理废水中金属离子主要靠微藻的吸收和固定化载体的吸附作用来提高去除率。将微藻细胞固定化既可使微藻重复使用 ,批次性运行 ,解决藻水分离的难题 ,又可增强其抗污染能力 ,延长微藻的生长期 ,使合成代谢活性大大提高。本文以海藻酸钠为固定化载体 , 以小球藻 、叉鞭金藻为固定化对象 ,在探讨固定化的最优条件的前提下 ,重点考察了不
同生长期的固定化小球藻 、固定化叉鞭金藻对污水中 Ni2+的吸附能力 ,旨在为设计和开发用于污水处理的固定化生物反应器作基础研究 , 为进一步研究固定化微藻处理废水中金属离子过程中有关 pH值 、共存离子 、光照 、CO2 气体等影响因素提供前期数据。
1　材料与方法
1.1　藻种与试剂小球藻(Chlorella spp.)属于绿藻门 、绿藻纲 、绿球藻目 、卵胞藻科 、小球藻属;叉鞭金藻(Dicrateria spp.)为金藻门 、金鞭藻
目 、等鞭藻科 、叉鞭金藻属。两种处于不同分类地位的藻种均
由辽宁省海洋水产研究所提供。 海藻酸钠系北京市旭东化工厂生产 , 化学纯。CaCl2 等其它药品均为分析纯。
1.2　培养条件培养液均为经过滤 、煮沸后冷却的海水 , 并加有 0.1%的
康维营养液[3] ,藻种在 1L三角烧瓶中进行光自养培养。自然光照 , 室温 ,定时摇瓶。
1.3　固定化胶球的制备将培养至对数期的两种藻液分别与 3%的海藻酸钠溶液按一定的体积比混合均匀 , 选用不同型号针头的注射器将混合液逐滴加入到 10ml一定浓度的 CaCl2 溶液中 , 边滴边摇 , 小液滴立即形成海藻酸钠固定化胶球(具体固定化条件见表 1)。静止 30 min ,然后将形成的胶球用去离子水洗 3次 , 置于 150ml三角烧瓶内 , 并加入 50ml培养液培养。表 1　固定化胶球的制备条件
藻液:海藻酸钠溶液(体积比) 针头型号(#) CaCl2 溶液浓度(mol l)
小球藻 2:3 4 0.15
叉鞭金藻 1:2 6 0.15
1.4　对 Ni2+的生物吸附及分析测定将一定培养时期的固定化小球藻 、固定化叉鞭金藻胶球
及其培养液分别与待吸附的人工配制的含 Ni2+的污水储备液混合 ,室温吸附 , 自然光照 ,一定时间后取上清液用纤维素酯微孔滤膜(0.22 μm)过滤。 用日本岛津公司的 AA-6800 型原
子吸收分光光度计分别测定滤液中 Ni2+的浓度 。取三次平均值。测定条件:吸收线波长 232.0nm;灯电流 8mA;燃气比 1:4;
乙炔压力 0.9MPa。用下式计算固定化微藻对 Ni2+的吸附率:
R=(C0-C) C0 , 式中 C0 、C 分别为 Ni2+的初始浓度和滤液浓
度。 Ni2+的标准曲线回归方程为 y=0.005x , R2=1。由测得的吸光度值 x 依据标准曲线求算去除率 y。
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BIOTECHNOLOGY
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