全 文 ：.列草欢 总第 1 04期 S C !HO C U N A A丫 U N A试验研究
秦天莺 , 伍 红 , 张 蕾
(西南民族大学生命科学与技术学院 , 成都 61 004 1)
摘 要 : 采用硫酸按盐析 。 透析 , 抽真空 , D E A E 一纤维素A 一52 柱层析 , 从绿豆芽中提纯 了超氧化物歧化畴 , 酶的纯
化程度达到每毫克蛋白 2 85 5 U , 总酶活回收率为38 4% , 纯化倍数为27 .5 。
关键词 : 超氧化物歧化酶 ; 绿豆芽 ; 分离纯化
中图分类号 : 5 5 2 2刀 3 2 文献标识码 : A 文章编号 : 10 0 6一 19 3 2 (2 0 04 )0 7一 0 0 0 7一 02
责任编辑王梦琳7
S O D属于金属酶 , 其理化性质不仅取决于蛋白质部
分 , 而且还取决于结合到活性部位的金属离子 。 按照结
合的不同金属离子 , 生物体中S O D有 C u 、 z n 一 S O D 、 M n -
S O D和 F e 一 SO D三种 , 但近几年发现低等生物中尚存在含
N i 的 S O D 。 在己发现的酶中 , 超氧化物歧化酶 (S O D )
是需氧生物和耐氧生物的体内清除超氧化物 自由基的酶 。
超氧 自由基在体内的过多积累将可能引发脂质过氧化 ,
损伤 D N A , 使脱水酶失活 , 使线粒体中的N A D H脱氢酶 、
N A D H氧化酶 与只磷酸腺有酶 ( A T P as e) 失活 , 从而易
引起生物体发生疾病或衰老 。 自从 19 68 年M cC or d与 rF i -
d o vi c h 发现 S O D 及其催化超氧化物 自由基歧化为 0 2与
H ZO 以来 , S o D 一直被认为是生物体内最重要的抗氧化
酶 。 根据近 10 年的研究报告表明 , s O D具有清除超氧化
物自由基 , 防止其对机体直接或间接的损伤 ; 使0 2成为
细胞内自由基的排污消 ; 调节机体内0 2的水平 ; 调节机
体内N o 水平和催化反应产物 H 2 0 2等作用 「,了。 现在在日
常生产应用中 , 多以动物血液中提取 s O D 。 但是动物血
液中的疾病很多 , 价格也比较昂贵 。 从植物中提取 SO D
就可以相应的解决上述问题 , 类似绿豆芽这种植物 , 其
成本低廉 , 且 S O D 的含量丰富 , 又无污染 , 将其大量应
用于生产有着很好的发展前景 。
试验研究了用硫酸按盐析 , 透析 , 抽真空 , D E A E
一纤维素A一52 柱层析分离纯化绿豆芽 S O D的方法。
, 材料和方法
1
.
1 材 料
新鲜绿豆芽 , 购 自西南民族大学东门菜市场 。
1
.
2 试 剂
D E A E
一纤维素 ( D E A -E 52 , w h a t山an 产品 ) , 牛血清
白蛋白 , 核黄素 , 考马斯亮兰 G 一 2 50 , S O D 试剂盒 (南
收稿日期 : 2 00 4 一 5 一 1 5
京建成生物研究所 ) , 考马斯亮兰 R一 2 50 。
1
.
3 仪 器
高速大容量冷冻离心机 旧本日立公司 ), 7 21 型分
光光度计 (上海第三分析仪器厂 ) , 离心浓缩冻干机 (美
国 S A V A N T ) , 微量进样器 , 恒温水浴锅 (北京市东霞电
子仪器厂 ) 。
1
.
4 方 法
1
.
4
.
1 蛋白质含量的测定 : 用考马斯亮兰结合法测蛋白
质含量和浓度 〔2〕 。
1
.
.4 2 SO D的含量的测定 : 试剂盒法 , 采用南京建成生
物研究所生产的测定s o D 的试剂盒 川 。
1
.
.4 3 提取纯化的方法
粗酶液的提取 : 取绿豆芽 50 9在研钵内研磨 , 直至
把绿豆芽研磨均匀 , 然后加 75 ml 的p H值为 7 . 8 、 .0 05 M
磷酸缓冲液 ( 内含 0 . 1 1l l M E D I人 ) 混匀 , 用四层纱布过
滤 。 取 滤液 10 ,nl , 经高速冷 冻离心机 离心 巧 m in
(4 0 0 pr m
,
4 ℃ ) , 上清液即为酶的粗提液 。 取上清液
6 ml
, 加入硫酸钱 0 . 9 84 9 至 30 %饱和度 , 用玻棒搅匀 ,
静置过夜 (4 ℃ ) 。
4 0 0 0 rp m
,
4 ℃离心 15 m i n , 取 3 m l上清液 , 加入
.0 9 69 9硫酸按固体粉末至 80 % 的饱和度 , 静置 6 h后离心
( 4 0 0 0 印m , 15 m in , 4 oC ) , 去清夜 , 沉淀备用 。
透析 , 浓缩 , 过柱 : 沉淀用 .2 5 m M p H值7 . 8的磷酸
缓冲液溶解 , 装入半透膜 , 用2 . 5 m M p H值7 . 8的磷酸缓
冲液透析脱盐 , 过夜除尽硫酸钱 。 透析液用离心浓缩冻
千机浓缩至一定体积 。 浓缩液用 D E A E一纤维素A 一52 上柱
( l
·
5 c m
` 2 0 c m )
, 用 2 . 5 mM p H值 7 . 8的磷酸缓冲液洗脱 ,
收集管3/ m in 。 注意以上各步均需测蛋白质的含量和酶的
活力 。
凝胶电泳 : 浓缩胶为p H值6 . 7的 rT is 一HCI 缓冲液 , 质
量浓度3%的凝胶 ; 分离胶为 p H值 .8 9的 rT is 一 H CI 缓冲液 ,
试骚研究 5 IC H UA N C AO Y UA N 20 04 年第7期 总第: 。4期 . 列竿欢
质量浓度 7 . 5%的凝胶 。 电极缓冲液为 p H 值 8 . 3 的 rT is 一甘
氨酸缓冲液闭 。 样品: 粗提酶 , 纯化酶 , 浓度为 1 m gm/ lo
上样量为 10 泌。 酶活性染色用氮蓝四哇法 。
2 结果与讨论
2
.
1 绿豆芽S O D纯化结果
分离了绿豆芽5 0 玖 结果见表 l 。
表 1 绿豆芽纯化结果
2
.
4 凝胶电泳分析 (见图2)
1
. 粗提酶蛋白质考马斯亮兰染色带
2
. 纯化酶蛋白质考马斯亮兰染色带
步骤 总体积 总活力 总蛋白 比活 回收率 纯化
( m一) ( u ) (m g ) ( u m/ g ) (% ) 倍数
粗提液 10 2 6 0 0 2 5 10 4 1
3 0% 一 80%硫酸氨 6 1 7 5 0 10 1 75 6 7 . 3 1 . 7
透析 , 抽真空 3 1 5 0 0 4 . 4 3 4 1 5 7刀 3 3
过柱 , 抽真空 2 99 9 0 3 5 2 85 5 3 8 4 2 7巧
结果表明 , 酶纯度达 2 6 83 川gm 蛋白 , 纯化倍数达
2 7
.
5
, 活力回收达 38 .4 % 。 这一结果比资料中理想的结果要
稍微偏低一点 , 可能是由于实验过程中的操作失误有关 。
.2 2 不 同硫酸按浓度去除杂蛋白的影响 (见表 2)
表2 不同硫酸铁浓度去除绿豆芽so D粗提液中蛋白的回收率
硫酸氨饱和浓度 总体积 总蛋白 总活力 蛋白沉淀率 活力回收率
(% ) (m l ) ( m g ) ( u ) (% ) (% )
1 0 11
.
5 2 5 0 0
3 0 6 2 2 54 1 2 7 7 5 8 0
.
4 5 1
.
1
3 5 6 1
,
7 4 8 4 4 7石 84 名 17 . 9
4 0 6 0 7 5 9 15 0 9 3
.
4 6
用不同浓度的硫酸按处理绿豆芽上清液 , 随着加入
硫酸钱浓度的增大 , 沉淀去除的蛋白质越多 , 但酶的活
力回收也越低 。 从去杂和活力回收这两方面考虑 , 以假
如3 0% 饱和度硫酸铰最佳 , 这样既可以去除更多的杂蛋
白又保留了较多的酶 。
.2 3 过 D E A E 一纤维素A 一52 柱层析 (见图 l)
3 。 呼 故洲
实线为蛋白含量
虚线为酶活力
冲 8 0 抑制率 ( % )
7 O
6〔)
5 0
4 O
2 O
1 O
x o 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 ( 管号 )
图 1 D E A E 一纤维素 A 一 52 柱层析
图 2 聚丙烯酸胺凝胶电泳
取粗提酶和纯化酶液分别进行聚丙烯酸胺凝胶电泳
鉴定 , 对其进行考马斯亮兰蛋白染色 。 粗酶液为 3条谱
带 , 纯化酶液为 2条谱带 , 与粗酶液比较缺少靠阳极端
的 l 条谱带 。 另用酶活性染色 , 纯化酶液的色谱与考马
斯亮兰染色谱带一致 , 证明纯化酶己达电泳纯 。
3 结 语
3
.
1 可以看出 , 在 50 9绿豆芽中最后酶的纯化程度达到
每毫克蛋白含 2 8 5 U , 总酶活回收率为38 . 4 , 纯化倍数
为 2 7 . 5 , 收到了预期效果 。
3
.
2 本次实验并未采取超滤的方法进行浓缩 , 而是采用
抽真空的方法 。 从实验结果可以看出 , 采用这两种方法
所达到的效果是相差无几的 。 但是从经济角度来考虑的
话 , 抽真空法比超率法要便宜很多 , 且操作简洁方便 。
3
.
3 本次实验采用南京建成生物研究所研究生产的专门
用于测S O D酶活力的试剂盒来测酶的活力 。 其使用方便
操作简单 , 可以一次测多管待测液的酶活 , 且所需时间
很少 , 即快速简便地测出酶的活力 。
3
.
4 SO D是一种主要的抗氧化酶 , 广泛存在于生物体内 ,
它是一种氧 自由基清除剂 , 能清除超氧化物阴离子自由
基 , 在防御氧的毒性 、 抗辐射损伤以及预防衰老等方面起
着重要作用 , 对人 、 畜均无毒副作用 。 超氧化物歧化酶
( S O D ) 作为超氧阴离子的整合剂 , 它既是目前临床 _ L常
用的治疗药物 , 又是目前临床上最常用的药物化妆品 (如
s o D 面膜 、 S O D 蜜等 ) 。 如利用超氧化物歧化酶制造的
s O D 面膜 、 S O D 蜜 、 S O D 蛇粉等等化妆品 , 不下数百种
产品 。 由于 S O D的化学本质是大分子蛋白质 , 因此它外用
是不易透过细胞膜而很难被皮肤吸收 , 它作为化妆品外用
是很难显效的 , 而其护肤疗效是令人怀疑的 。 同时 , S O D
作为大分子蛋白质 , `言内服又易被消化道中的蛋白酶破坏
而无法发挥功效的 , 所以 S O D 口服给药无效 , 主要应注射
给药 。 因此 , 在运用 S O D 诸多的抗衰老及美容护肤产品
中 , 无论是内服还是外用其产品都是无效的。
从过柱的图形可以看出前面的一个实线和虚线的峰
分别为 S O D蛋白含量曲线和酶活力曲线 。 后面的一个峰
则是其他杂蛋白 。
参考文献
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王梦琳8
试验研究 。 ,e o u AN 。 A。丫 u AN Z。。 4年第 7期 总第。、 期 ` ,”羊欢 -
况 = 0 . 3 4 8 s l t一 ` 2, 3 33 · e 一 0 · “ 2 9引 `
表 T 狭翅雏蝗的种群数量消长统计
时间t 平均密度 理论值
( 以 6月3 日为。 ) (头 /平方米 ) (头 /平方米 )
参考文献
调查日期
( 日 /月 ) 卡平方值
7 /6
17 /6
2 7 /6
9 /7
1 8 /7
29/ 7
9 /8
19 /8
2 9 /8
8 /9
18 /9
2 8 /9
6 /10
17 /10
名
1
.
2
8
.
6
1 1
.
4
15
.
0
8
.
0
6
.
0
5 O
4
一
8
7
.
0
4 8
4
.
8
3 6
3
,
6
3
.
0
1
.
6 6 6 0
5
.
6 7 5 8
8
.
1 34 4
9 3 4 7 8
9
.
4 04 6
8 8 7 3 2
7
.
9 8 1 5
7
.
04 1 4
6 0 8 5 2
5
.
154 7
4
.
34 3 7
3
.
6 0 7 6
3
.
0 89 5
2
.
4 76 4
0
.
1 3 0 3
0 5 0 6 3
1 3 1 1 4
3
.
4 17 3
0
.
2 0 2 9
0 9 3 0 3
l
_
1 14 0
0 7 13 3
0
.
13 7 6
0 0 2 4 4
0
.
0 4 7 9
0 0 0 0 0
0
.
0 8 4 2
0
.
11 0 9
9
.
7 3 7 8
将调查数据与用上式计算的理论值进行 比较 , 经
卡平 方 适合性检验 , 误 差 不 显 著 x( 2= .9 737 8 <
0P
。厂 n . 3 4) , 表明模拟结果能够用于描述狭翅雏蝗在
草地的消长情况 。
将 B 、 C 值代入 =t B度了中 , 求得高峰时间为
=t 41
.
25 7 6
, 即7月 14 日 。 实际调查为 : 高峰期卜36 d ,
即7月9 日 , 一与预测值接近 。
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主贝任编辑王梦琳10