全 文 ：收稿日期:2005 02 28
基金项目:香港特别行政区大学教育资助委员会 The area of Excellence Scheme资助项目(AOE/ r 10/01)
作者简介:杨序娟(1977 ),女(土家族),贵州铜仁人 , 博士研究生;姚新生(1934 ),男(汉族), 上海人 , 教授 , 博士 , 中
国工程院院士 ,博士生导师 , 主要从事中药及天然药物活性成分的研究 , Tel.0755 26036137 , E mail yaoxinsheng@
163.net。
文章编号:1006 2858(2005)06 0449 04
接骨木中的三萜类化合物及其对类成骨细胞
UMR106的作用
杨序娟1 , 王乃利1 , 2 , 黄文秀3 , 陈新滋3 , 姚新生1 , 2
(1.沈阳药科大学 中药学院 ,辽宁 沈阳 110016;　2.清华大学 深圳研究生院生命学部 , 广东 深圳 518055;
3.香港理工大学 应用生物及化学科技学系 , 香港 九龙)
摘要:目的 用大鼠类成骨细胞 UM R106 的增殖作为活性追踪指标 ,对接骨木茎枝的体积分数为
60%的乙醇提取物进行抗骨质疏松活性成分的追踪分离;初步考察化合物对 UM R106 细胞增殖 、
分化的影响。方法 运用各种现代分离手段对活性部位进行追踪分离 , 用光谱学方法对得到的化合
物进行结构鉴定;用比色法测定 UM R106 细胞的增殖和碱性磷酸酶活性。结果 分离得到了 5 个
三萜苷元类化合物 ,包括白桦醇(betulin , 1)、白桦酸(betulinic acid , 2)、齐墩果酸(oleanolic acid , 3)、
熊果酸(ursolic acid , 4)、α香树脂醇(α amy rin , 5), 同时还分离到了 2 个甾醇类化合物 , 豆甾醇
(stigmasterol , 6)、胡罗卜苷(sitosterol 3 glucoside , 7)。 结论 化合物 1 ～ 3 均为首次从接骨木中分
离得到 , 其中化合物 1 、2 可以促进大鼠类成骨细胞 UM R106 的增殖 ,化合物 1 对 UM R106 细胞碱
性磷酸酶的活性也有促进作用。
关键词:UMR106 细胞;接骨木;抗骨质疏松
中图分类号:R 96;R 284.1　　　文献标识码:A
　　接骨木为忍冬科植物接骨木(Sambucus
wi lliamsii Hance)的茎枝 , 又名戳树 、公道老树
等 ,分布很广 ,主产于江苏 。其根及根皮 、叶 、花朵
均供药用 ,主要功用为祛风 、活血 ,传统用于治疗
风湿筋骨疼痛等[ 1] 。骨质疏松(osteoporosis)是各
种原因引起的代谢性骨病 ,其特征是骨量低 、骨组
织微环境退化 ,骨脆性增加 ,易发生骨折[ 2] 。骨
质疏松在老年人中发病率较高 ,严重影响了老年
人 ,尤其是绝经后妇女的生活质量[ 3 ,4] 。在去卵
巢致骨质疏松大鼠模型和体外细胞实验中 ,接骨
木茎枝的体积分数为 60%的乙醇提取物均显示
出很好的活性 。作者应用以大鼠类成骨细胞
UMR106的增殖为指标的活性追踪分离方法 ,从
中分离得到 5个三萜类化合物和 2个甾醇类化合
物 ,并根据光谱数据分析确定了它们的结构(图
1),其中化合物 1 ～ 3均为首次从接骨木中分离得
到。并初步 检测 了三 萜类 化合 物对 大鼠
UMR106细胞增殖及碱性磷酸酶活性的作用 。
1　仪器与材料
AV 400 核磁共振光谱仪(瑞士 Bruker 公
司), ESI 质谱仪(Espquire 2000 , 瑞士 Bruker 公
司),分析型高效液相仪(LC 10AT vp ,日本岛津
公司),制备型高效液相仪(LC 8A ,日本岛津公
司), 硅胶 G60(青岛海洋化工有限公司),
Sephadex LH 20葡聚糖凝胶(美国 Advanced
Technology工业有限公司),ODS(40 ～ 75 μm ,日
本 Fuji Silysia化学有限公司)。
大鼠骨肉瘤 UMR106 细胞(American type
culture collation , 序号 CRL 1661), Dulbecco s
modif ied eagle s medium(DMEM , 美国 Gibcobrl
公司),Fetal bovine serum(FBS ,美国 Gibcobrl公
司),质量分数为 0.5%胰酶 5.3 mmol·L-1 ED-
TA(美国 Gibcobrl公司),青霉素及链霉素(美国
Invit rogen公司),24 孔板 、96孔板和细胞培养皿
(100 mm ×20 mm ,美国 Falcon 公司), MTT(美
国 Sigma公司),4 硝基苯磷酸二钠盐合六水(美
国 Fluka公司),MgCl2·6H2O(Bioasia有限(中国)
第 22 卷 第 6 期
2 0 0 5 年 1 1 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol.22 　No.6
Nov.2005 p.449
DOI :10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2005.06.014
公司), Triton X 100和 Tris(美国 Amresco公司),
考马斯试剂(美国Bio Rad公司)。
接骨木由沈阳药科大学江泽荣教授采自沈阳
并鉴定为 Sambucus wil liamsi i Hance 的茎枝 ,留
样(YYXJSW 2003)保存于深圳中药及天然药物
研究中心 。
Fig.1　Structures of triterpenoids isolated from the stems of Sambucus williamsii Hance
2　提取分离
接骨木(30 kg)经适当粉碎后 ,用体积分数为
60%的乙醇加热回流提取 2次 ,每次 3 h 。减压浓
缩回收溶剂后 ,取部分浸膏混悬于水中 ,依次经氯
仿 、乙酸乙酯和正丁醇萃取 。氯仿萃取部位经
2次硅胶柱层析 , 分别用环己烷 乙酸乙酯 、氯
仿 甲醇洗脱 ,再经 Sephadex LH 20柱层析后得
到化合物 6 、7 ,其余部分经 ODS 柱层析 ,制备型
HPLC分离后得到化合物 1 ～ 3。乙酸乙酯萃取
部位经硅胶柱层析 , 用氯仿 甲醇洗脱后 , 再经
Sephadex LH 20柱层析后得到化合物 4 、5。
3　结构鉴定
化合物 1:白色针晶(氯仿 甲醇), mp 262 、
263 ℃。IR σ/cm-1:3 383 、2 943 、1 458 、1 373 、
1 030。ESI MS m / z:465.5 [ M +Na] +、443.5
[ M+H] +。1H 和13C 核磁图谱显示这是 1个三
萜苷元类化合物 , 其中化学位移位于 δ150.5 、
109.7 、19.1的一组碳信号(C 20 、C 30 、C 29)提
示这是羽扇豆烷型的三萜苷元 。 13C NMR
(CDCl3 , 100 MHz)数据见表 1。与文献[ 5 , 6]数
据比较 ,确定化合物 1为白桦醇(betulin)。
化合物 2:白色针晶(氯仿 甲醇), mp >
300 ℃。ESI M S m/ z :479.5[ M +Na] + 、455.5
[ M-H] -。 13C NMR(CD3OD 100 MHz)数据见
表1 。根据 2D NMR数据 ,确定化合物 2为白桦
酸(betulinic acid),并对碳信号进行了全归属 。与
化合物 1比较 ,化合物 2也具有特征的化学位移
为 δ151.4 、110.0 、19.6 的碳信号。同时可以看
出 ,由于选择溶剂的不同 ,相同类型化合物的碳信
号化学位移也会具有较大的偏差。
化合物 3:白色粉末(氯仿 甲醇), ESI MS
m/ z :479.5[ M +Na] +、455.6[ M -H] -。13C
NMR(CDCl3 ,100 MHz)数据见表 1 ,其中 sp2 杂
化碳区除了显示 1个羰基信号之外 ,还显示 1对
双键信号 ,化学位移在 δ122.7与 δ143.6。结合
1
H 、DEPT90与 DEPT135 实验可知 ,化合物 3具
有7个连接在季碳上的甲基 ,因此推测为齐墩果
酸。与文献[ 7]数据相比较 ,确定化合物 3为齐墩
果酸(oleanolic acid)。
化合物 4:白色絮状沉淀(氯仿 甲醇), ESI
MS m /z :479.5[ M +Na] + 、455.6[ M -H] -。
13C NMR(py ridine d5 , 100 MHz)数据见表 1。
与文献[ 8]数据比较 ,确定化合物 4为熊果酸(ur-
solic acid)。
化合物 5:白色片晶(氯仿), mp 180 ～
182 ℃。ESIM S 的分子离子峰不明显。 13C
NMR(CDCl3 ,100 MHz)数据见表 1。与文献[ 9]
数据比较 , 确定化合物 5 为 α 香树脂醇(α
amy rin)。
化合物 6:白色针晶(氯仿 甲醇),与豆甾醇
标准物混合点样 ,经薄层色谱展开 ,为同一斑点。
ESIMS 裂解情况一致 , 确定为豆甾醇(stigmas-
450 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 22卷
terol)。
化合物 7:白色粉末(氯仿 甲醇),与胡罗卜
苷标准物混合点样 ,经薄层色谱展开 ,为同一斑
点。ESIM S 裂解情况一致 , 确定为胡罗卜苷
(sitosterol 3 g lucoside)。
Table 1　13C NMR data of compounds 1-5
Position (1)a (2)b (3)a (4)c (5)a
1 38.7 39.7 38.4 39.0 38.8
2 27.4 27.4 27.2 28.1 27.3
3 79.0 79.3 79.1 78.1 79.1
4 38.9 39.6 38.8 39.3 38.8
5 55.3 56.4 55.2 55.8 55.2
6 18.3 19.1 18.3 18.7 18.4
7 34.3 35.2 32.6 33.5 32.9
8 40.9 41.5 39.3 39.9 40.0
9 50.4 51.5 47.7 48.0 47.7
10 37.7 38.0 37.1 37.2 36.9
11 20.9 21.7 22.9 23.6 23.4
12 25.2 26.4 122.7 125.6 124.4
13 37.2 39.2 143.6 139.2 139.6
14 42.7 43.2 41.6 42.0 42.1
15 27.1 30.5 27.7 28.6 26.6
16 29.2 33.0 23.4 24.9 29.7
17 47.8 57.1 46.5 48.0 33.8
18 47.8 50.1 41.0 53.5 59.1
19 48.8 47.9 45.9 39.3 39.6
20 150.5 151.4 30.7 39.3 39.7
21 29.8 31.4 33.8 31.0 31.3
22 34.0 37.9 32.5 37.4 41.5
23 28.0 28.4 28.1 28.7 28.1
24 15.4 15.9 15.5 16.5 15.6
25 16.0 16.6 15.3 15.5 15.7
26 16.1 16.5 17.1 17.4 16.9
27 14.8 15.1 25.9 23.8 23.3
28 60.6 179.8 183.0 179.8 28.8
29 19.1 19.6 33.1 17.4 17.5
30 109.7 110.0 23.6 21.3 21.4
　　a—CDCl3;b—CD3OD;c—Py ridine-d5
4　细胞活性实验
UMR106细胞是一种大鼠骨肉瘤细胞 ,由于
具有成骨细胞的性质 ,常被用来研究各种影响骨
质疏松的激素及药物的作用机制。胰岛素样生长
因子(IGF I)是一种多肽类的生长因子 , Leung
等[ 10]曾经报道IGF I 可以促进 UMR106细胞的
增殖 ,因此选择 IGF I 作为细胞增殖实验的阳性
对照品。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)是成
骨细胞分化时产生的一种酶 ,其活性可以用来衡
量成骨细胞的分化。精密称取供试化合物1 ～ 5
各约 1 mg , 加入适量乙醇溶解使质量浓度为
1 g·L-1 ,作为储备液备用 。临用时量取少量稀释
100倍作为最高质量浓度 ,再依次 10倍稀释。
UMR106 细 胞增 殖实 验:细胞 以 每孔
7 500个的密度接种于 96 孔板 , 用体积分数为
5%的 FBS 的 DMEM 培养液培养 24 h后 ,换成
无血清培养液再培养 24 h ,然后加入不同浓度的
451第 6 期 杨序娟等:接骨木中的三萜类化合物及其对类成骨细胞 UMR106 的作用　　　
化合物共培养 。24 h 后每孔加入 5 g·L-1 MTT
溶液10μL培养4 h ,将 DMSO溶解形成的 MT T ,
于波长 575 nm 测定光密度。以未加入化合物 ,
只用培养液培养的细胞的光密度作为空白对照
(control)。
UMR106细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性实
验:细胞以每孔 37 500个的密度接种于 24孔板 ,
用体积分数为 5%的 FBS 的 DMEM 培养液培养
3 d 。化合物用体积分数为 1%的FBS DMEM 稀
释至不同的浓度 , 加入板中培养 24 h。细胞用
PBS 清洗后加入 200 μL 裂解液 , 冻融 3 次。
40μL细胞裂解液与 ALP 反应液 37 ℃反应
30 min ,于波长 405 nm 测定光密度值;另外40 μL
细胞裂解液用于测定细胞蛋白含量 。ALP 活性
以 ΔOD·min-1·μg-1表示 。以未加入化合物 ,只
用培养液培养的细胞的光密度值作为空白对照
(control)。
活性实验结果表明 , 化合物 1 可以促进
UMR106 细 胞 的 增 殖 , 其 最 佳 浓 度 为
21.5 nmol·L-1 。如果浓度太高 ,则显示抑制细胞
生长的作用。在此浓度时 ,化合物 1还可显著促
进 UMR106细胞的碱性磷酸酶活性 ,与空白对照
组相比高达171.7%。化合物 2对 UMR106细胞
的增殖有一定的促进作用 ,但相对比较微弱 。化
合物 3 ～ 5对 UMR106细胞的增殖和碱性磷酸酶
均没有明显的作用。化合物 1 、2的实验数据见表
2 ,化合物 3 ～ 5的数据未列出 。
Table 2　Percentage of OD value of compound 1 , 2 on proliferation and ALP activities of UMR106 cells
Compounds c/(μmol·L-1) P ro liferation of UMR106 cells/ % ALP activity of UMR106 cell/ %
1 21.50 75.8±4.1b nd
2.15 98.9±14.1 126.5±3.4
0.22 108.3±10.7 101.7±8.5
21.50 123.8±13.3b 171.7±7.6b
2.15 109.3±8.0a 118.3±3.7
IGF I 112.5±10.0b nd
2 21.50 76.2±1.7b nd
2.15 108.5±3.2a 62.2±7.0b
0.22 101.2±7.9 95.7±3.2
21.50 109.7±11.1a 116.5±11.1
2.15 103.3±15.1 102.6±2.1
IGF I 112.5±10.0b nd
　　Results w ere expressed as mean±s from triplica te determinations.Cell proliferation rate was present as the percentag e of
control value.The deg ree of significance was determined by Student s t test.IGF I(10 μg·L-1)w as used as positive con-
trol.a— P<0.05;b—P <0.01;nd—No t detected
致谢:本实验项目由香港特别行政区大学教育资助
委员会 theArea of Excellence Scheme资助(AOE/ r-
10/01)。原植物由沈阳药科大学江泽荣教授采集
并鉴定 ,ESIMS实验由本实验组高昊同学完成 ,细
胞实验由本实验组解芳同学提供帮助 。
参考文献:
[ 1 ] 江苏新医学院.中药大辞典 [ Z] .上海:上海科学技
术出版社 , 2001.2093.
[ 2 ] Dö ren M.An assessment of hormone replacement ther-
apy to prevent postmenopausal osteopo rosis [ J] .Osteo-
porosis Int , 1999 , Suppl 2:S53-61.
[ 3 ] Rodan G A , Martin T J.Therapeutic approaches to
bone diseases [ J] .Science, 2000 , 289(9):1508 -
1514.
[ 4 ] 黄洪 ,田成功.睾酮与雄性大鼠骨质疏松关系的实
验研究 [ J] .中华内分泌代谢杂志 , 1999 , 15(5):
304-307.
[ 5 ] 王晓林 ,李良琼 ,李美蓉.扁枝槲寄生化学成分研究
Ⅲ [ J] .华西药学杂志 , 1995 , 10(1):1-3.
[ 6 ] 尚明英 ,蔡少青 , 李军 , 等.中药葫芦巴三萜类成分
研究 [ J] .中草药 , 1998 , 29(10):655-657.
[ 7 ] 王建华 ,黄文哲 , 张增辉 , 等.桦树皮镇咳祛痰有效
成分的研究 [ J] .中国药学杂志 , 1994 , 29(5):268-
271.
[ 8 ] 谭宁华 ,王双明 , 杨亚滨 , 等.白花蛇舌草的抗肿瘤
活性和初步化学研究 [ J] .天然产物研究与开发 ,
2002 , 14(5):33-37.
[ 9 ] 任风芝 ,屈会化 , 栾新慧 , 等.紫珠叶的化学成分研
究Ⅰ [ J] .天然产物研究与开发 , 2000 , 13(1):33-
34.
[ 10] Leung K , Rajkovic I A , Peters E , et al.I nsulin-like
grow th facto r I and insulin down-regulate grow th hor-
mone(GH)recepto rs in rat osteoblasts:evidence for a
peripheral feedback loop regulating GH action [ J] .En-
docrinology , 1996 , 137(7):2694-2702.
(下转至第 457页)
452 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 22卷
ter last administ ration for counting nucleated marrow cell population statistically .Acute toxicity test was
carried out through routine methods.Results EBCD showed obvious inhibi tory activity on solid sarcoma 180
in mice administered orally at 200 mg·kg-1 , and i ts effects on erythrocyte count , leukocyte count ,differen-
tial leukocy te count in peripheral blood and nucleated thigh marrow cell population had no significant effect
in mice administered orally at 200 , 244 , 280 mg·kg -1 for 7 day s.Its acute LD50 value for mice was
1 047 mg·kg-1 by o ral administrat ion.Conclusions EBCD possesses certain anticancer activities and per-
haps less inhibitory action on marrow .
Key words:cholest-4-en-3β ,6β-diol bishemisuccinate bisethanolamine salt;anticancer activity ;acute toxic-
ity ;erythrocyte count;leukocy te count;differential leukocy te count;nucleated marrow cell population
(上接第 452页)
Studies of triterpenoids isolated from Sambucus
williamsii Hance and their effects on UMR106 cell
proliferation and alkaline phosphatase activity
YANG Xu-juan1 , WANG Nai-li1 , 2 , WONG Man-sau3 , CHAN Sun-chi3 , YAO Xin-sheng1 , 2
(1.School of Traditional Chinese Materia Medica , Shenyang Pharmaceutical University , Shenyang　110016 ,
China;　2.Graduate School at Shenzhen , Tsinghua University , Shenzhen　518055 , China;　3.Department
of Applied Biology and Chemical Technology , Hong Kong Polytechnic University , Hong Kong S AR.)
Abstract:Objective To study the bioactive constituents f rom the 60 % ethanol ex tract of the stems of
Sambucus wi lliamsii Hance while st imulating UMR106 cell proliferation w as used as in v it ro marker to
guide the isolat ion procedure;to determine the ef fects of isolated compounds on UMR106 cell proliferat ion
and alkaline phosphatase activities.Methods Isolat ion procedure was carried out by column chromatography ,
medium pressure column chromatography and HPLC;structures of isolated compounds w ere identified by
phy siochemical propert ies and spect roscopic methods;effects of isolated compounds on UMR106 cell prolif-
erat ion and ALP activities were measured by colorimetry.Results Isolation of the 60 % ethanol ext ract of
the stems of Sambucus wil liamsi i Hance af fored five t riterpenes and 2 steroids , including betulin(1), be-
tulinic acid(2), oleanolic acid(3), ursolic acid(4), α-amy rin(5), stigmasterol(6)and sitosterol-3-g lucoside
(7).Conclusions Betulin(1),betulinic acid(2)and oleanolic acid(3)are isolated f rom Sambucus wil liamsi i
Hance fo r the fi rst time.Betulin(1)and betulinic acid(2)could stimulate UMR106 cell proliferation , and
betulin(1)could also induce ALP act ivit ies in UMR106 cell.
Key words:UMR106 cell;Sambucus wil liamsi i Hance;antiosteoporosis
457第 6 期 刘跃金等:胆甾 4 烯 3β , 6β 二醇双琥珀酸单酯双乙醇胺盐的体内抗癌活性及对血象的影响