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鳢肠不同部位抗骨质疏松活性及化学成分比较研究



全 文 :收稿日期:2013-07-25 接受日期:2013-10-18
基金项目:福建省自然科学基金项目(2011J01214);福建省卫生厅
青年科研项目(2011-1-39)
* 通讯作者 Tel:86-591-22861360;E-mail:wxsq1@ 163. com
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2014,26:1229-1232,1298
文章编号:1001-6880(2014)8-1229-05
鳢肠不同部位抗骨质疏松活性及化学成分比较研究
黄运喜1,易 骏2,吴建国1,郑淑霞1,吴锦忠1,吴岩斌1
*
1福建中医药大学中西医结合研究院,福州 350122;2 福建教育学院理科部,福州 350001
摘 要:为了比较鳢肠不同部位提取物的抗骨质疏松活性及总皂苷、总黄酮含量,采用 MTT 法和对硝基苯酚磷
酸二钠法测定鳢肠不同部位乙醇提取物对 UMR106 细胞的增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性;采用紫外分光光度法
测定鳢肠不同部位总皂苷和总黄酮含量。结果表明,鳢肠根和叶提取物对 UMR106 细胞的增殖具有促进作用,
浓度为 50 μg /mL时促增殖作用最强,增值率分别为 7. 7% 和 16. 9%,茎提取物没有明显的作用;鳢肠根、茎、叶
提取物对 ALP活性均有促进作用,浓度为 100 μg /mL时促增殖作用最强,分别促进 18. 9%、20. 1%和 17. 0%;鳢
肠根、茎、叶中总皂苷含量分别为 3. 6%、4. 0%和 2. 2%,总黄酮含量分别为 1. 4%、1. 4%和 3. 4%。这些结果表
明;鳢肠不同部位提取物均有抗骨质疏松活性,其不同部位总皂苷和总黄酮的含量差异较大。
关键词:墨旱莲;UMR106 细胞;骨质疏松;总皂苷;总黄酮
中图分类号:R932 文献标识码:A
Comparative Study on Antiosteoporosis Activity and Chemical
Composition from Different parts of Eclipta prostrata L.
HUANG Yun-xi1,YI Jun2,WU Jian-guo1,ZHENG Shu-xia1,WU Jin-zhong1,WU Yan-bin1 *
1Academy of Integrative Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,FuZhou 350122,china;
2Department of Chemistry and Life Science,Fujian institute of education,Fuzhou,Fujian 350001,China
Abstract:To Compare the anti-osteoporosis activity and the contents of total saponins and total flavonoids from different
parts of Eclipta prostrata L. . The effects of ethanol extracts from different parts of E. prostrata on the proliferation and
differentiation of UMR106 cells were evaluated by the MTT method and measuring the activity of alkaline phosphatase
(ALP)by p-nitrophenyl phosphate disodium method. The contents of total saponins and total flavonoid from different
parts of E. prostrata were used to determine by Ultraviolet spectrophotometry method. The results show that the extracts of
the root and leaf from E. prostrata stimulated UMR106 cells proliferations,the proliferation rate was 7. 7% and 16. 9%
respectively at a concentration of 50 μg /mL,while the stem did not stimulate UMR106 cells proliferation. all of the ex-
tracts from root,stem and leaf of E. prostrata could increased the ALP activity respectively by 18. 9%,20. 1%,and
17. 0% at a concentration of 100 μg /mL. The contents of total saponin and total flavonoids from the root,stem and leaf
of E. prostrata were 3. 6%,4. 0%,2. 2% and 1. 4%,1. 4%,3. 4%,respectively. In Conclusion,all of the extracts from
different parts of E. Prostrata have antiosteoporotic activity. The contents of total saponins and total flavonoids from dif-
ferent parts of E. prostrata have large difference.
Key words:Eclipta prostrata L.;UMR106 cells;osteoporosis;total saponins;total flavonoids
墨早莲原名鳢肠,《本草图经》称为旱莲草,又
称为金陵草、旱莲子等[1]。2010 年版《中国药典》记
载中药墨旱莲为鳢肠 Eclipta prostrata L.的干燥地上
部分,具有滋补肝肾,凉血止血的功效,用于肝肾阴
虚,牙齿松动,须发早白,眩晕耳鸣,腰膝酸软,阴虚
血热吐血、衄血、尿血、血痢、外伤出血[2];1999 年出
版的《中华本草》记载墨旱莲来源为鳢肠属植物鳢
肠 Eclipta prostrata(L.)L.[verbesina prostrata L.;E.
Alba(L.)Hassk.]的全草[3]。现代化学和药理研究
表明,墨旱莲主要黄酮类、噻吩类和香豆草醚类等化
学成分,具有保肝、止血、抗炎、免疫调节、抗蛇毒、抗
菌、抗氧化和抗骨质疏松等生物活性[4-8]。
前人研究墨旱莲所选用材料为鳢肠全草而非干
燥地上部分(墨旱莲)[9,10],且在市场流通中的墨旱
DOI:10.16333/j.1001-6880.2014.08.017
莲药材,常混入鳢肠的根,而 2010 年版《中国药典》
记载为墨旱莲为鳢肠干燥地上部位。因为对鳢肠全
草或地上部分(墨旱莲)入药存在争议,因此比较鳢
肠不同部位的生物活性及化学成分是否有差异来评
价鳢肠根可否与地上部分(墨旱莲)同时入药,对指
导中医临床用药具有重要的意义。本实验以成骨细
胞增殖和分化以及墨旱莲中主要化学成分皂苷和黄
酮的含量为评价指标,研究鳢肠不同部位抗骨质疏
松作用和化学成分的差异,为墨旱莲在中医临床用
药及其资源利用提供依据。
1 材料和仪器
1. 1 材料
鳢肠 E. prostrata采于福建省莆田市,由福建中
医药大学药学院黄泽豪副教授鉴定。
大鼠骨肉瘤(UMR106)细胞由上海第二军医大
学生药教研室赠送。DMEM 高糖培养液,胎牛血
清,胰蛋白酶(美国 Hyclone 公司),青霉素-链霉素
双抗试剂(北京鼎国昌盛生物技术有限公司);MTT
干粉(美国 Sigma公司);其余所用药品和试剂均为
分析纯。
1. 2 主要仪器和试剂
RE-2000 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);
KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器
有限公司);UV-1800 紫外可见分光光度计(日本岛
津公司);DLSB-5 /20 低温冷却循环泵(郑州长城科
工贸有限公司);YXQ-LS-70A 立式压力蒸汽灭菌器
(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);移液器(德
国 Eppendorf);Anke TDL-50B 离心机(上海安亭科
学仪器厂);SW-CJ-1FDA 超净工作台(苏州安泰空
气技术有限公司);BCD-518WS A 冰箱(海尔);
5417R高速冷冻离心机(德国 Eppendorf);HF212UV
CO2 培养箱(Heal Force);TS100 倒置生物显微镜
(Nikon) ;ELX800 酶标仪(biotek);DK-420 型电热
恒温水槽 (上海精宏实验设备有限公司);
AR233CN电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公
司)。
2 方法
2. 1 不同部位提取物的制备
分别称取鳢肠根,茎,叶按料液比为 1 ∶ 15 用
80%乙醇回流提取 2 次,每次 2 h,合并滤液得提取
液。
2. 2 细胞培养
UMR106 细胞培养于含有 10%新生胎牛血清、
1%青霉素-链霉素双抗的 DMEM 高糖培养液中,置
37 ℃含有 5% CO2 的细胞培养箱中培养。当细胞
生长达到对数生长期时,用 0. 05%含 EDTA 胰酶消
化传代或接种。
2. 3 UMR106 细胞的增殖实验
将 UMR106 细胞用含 10% 新生胎牛血清的
DMEM高糖培养液配制成密度为 5 × 104 /mL 的细
胞悬液,以 100 μL 每孔的体积接种于 96 孔培养板
中,培养 24 h 后,根、茎、叶三个部位提取物分别以
50、25、12. 5 μg /mL三个浓度给药,每个浓度 5 个复
孔,继续放入培养箱培养 48 h,取出培养板,各孔加
入 100 μL四氮唑蓝(MTT,用 PBS 液配制 1 mg /mL
的 MTT液),放入培养箱中孵育 4 h,取出培养板,在
倒置相差显微镜下可见细胞内有条状黑色沉淀,弃
去上清液,每孔加入 DMSO(二甲基亚砜)100 μL,
DMSO的颜色变成紫色,把 96 孔培养板放于酶标仪
上震荡 10 min 后使沉淀完全溶解于 DMSO,于 490
nm处检测各孔 A值。
2. 4 UMR106 细胞的 ALP活性实验
将 UMR106 细胞用含 10% 新生胎牛血清的
DMEM高糖培养液配成密度为 5 × 104 /mL 的细胞
悬液。以 100 μL 每孔的体积接种于 96%培养板
中,培养 24 h 后,根、茎、叶三个部位提取物分别以
100、50、25 μg /mL 三个浓度给药,每个浓度 5 个复
孔,继续放入培养箱培养,以后每 3 天更换一次药。
培养至第 8 d 测定。弃去培养液,PBS 冲洗 2 ~ 3
次,加 50 mmol /L 的二乙醇胺 100 μL,2. 5 mmol /L
的对硝基苯酚磷酸二钠 50 μL,37 ℃反应 30 min,最
后用 0. 3 mol /L 的氢氧化钠 100 μL 终止反应,于
405 nm处测 A值[8]。
2. 5 皂苷及黄酮含量测定
2. 5. 1 标准品溶液的制备
精密称取 5. 1 mg旱莲苷 A标准品,加甲醇定容
至 50 mL,配成 0. 102 mg /mL溶液,作为皂苷对照品
溶液。
精密称木犀草素对照品 20. 1 mg,置于 100 mL
容量瓶中,加入 60%乙醇适量溶解并稀释至刻度,
摇匀,作为黄酮对照品溶液(即 0. 201 mg /mL)。
2. 5. 2 皂苷标准曲线绘制
精密吸取旱莲苷 A 对照品溶液 0. 1,0. 2,0. 4,
0. 8,1. 0,1. 2,1. 4,1. 6,1. 8,2. 0 mL 分别置具塞试
0321 天然产物研究与开发 Vol. 26
管中,置水浴上挥去溶剂,加入新配制的 1%香草
醛-高氯酸溶液 0. 5 mL,60 ℃水浴中加热 15 min,立
即冰水冷却 2 min,加 77%硫酸溶液 5. 0 mL,摇匀,
于 550 nm 处测定吸光度。以含量(C)与吸光度
(A)进行直线回归,得回归方程 A = 0. 0336C +
0. 0007,R2 = 0. 9994(图 1),线性关系良好。
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
00 10% 20% 30% 40
C(mg/L)
Y=0.0336X+0.0007
R2=0.9994
A
图 1 旱莲苷 A标准曲线
Fig. 1 The standard curve of ecliptasaponin A
2. 5. 3 黄酮标准曲线绘制
分别吸取标准应用液 1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,
6. 0,7. 0,8. 0 mL于 25 mL容量瓶中,用 60%乙醇定
容至 10 mL,先加 5%的亚硝酸钠溶液 1 mL,摇匀,
放置 6 min;再加 10%的硝酸铝溶液 1 mL,摇匀,放
置 6 min;再加 4%的氢氧化钠溶液 10 mL,用 60%
甲醇稀释至刻度,放置 10 min,在波长 512 nm 处测
定吸光度[11],以含量(C)与吸光度(A)进行直线回
归,得回归方程 A = 0. 0221C-0. 007,R2 = 0. 9992(图
2),线性关系良好。
C(mg/L)
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
A
0 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80
Y=0.0221X-0.007
R2=0.9992
图 2 木犀草素标准标曲线
Fig. 2 The standard curve of luteolin
2. 5. 4 样品的皂苷及黄酮含量测定
精密吸取供试品溶液 0. 1 mL置具塞试管中,水
浴上挥去溶剂,按 2. 5. 2 项下操作,相应试剂随行空
白对照,于 550 nm处测定吸光度,计算皂苷的含量。
精密吸取供试品溶液 1. 0 mL 于 25 mL 容量瓶
中,按 2. 5. 3 项下操作,在波长 512 nm 处测定吸光
度,计算黄酮含量。
2. 6 统计学处理
采用 SPSS 18. 0 软件进行统计分析,组间采用
单因素方差分析(ANOVA),以 P < 0. 05 为差异有统
计学意义。
3 结果与分析
3. 1 鳢肠不同部位对 UMR106 细胞增殖的影响
鳢肠根、叶的 80%乙醇提取物对 UMR106 细胞
均具有增殖作用,浓度为 50 μg /mL 时作用最强,增
殖率分别为 7. 7%(P < 0. 01),16. 9%(P < 0. 001)
(图 3) ,其中叶的提取物增殖对 UMR106 细胞的增
殖能力最强,且 P < 0. 001 具有显著性差异。
120
100
80
60
40
20
0
Control Root Stem Leaf
Control
100%ug/mL
50%ug/mL
20%ug/mL
图 3 鳢肠不同部位提取物对 UMR106 细胞增殖的影响
Fig. 3 Effect of the extracts from different parts of E. pros-
trata on UMR-106 cell proliferation.
与空白组比较(n = 5):* P < 0. 05,**P < 0. 01,***P < 0. 001
* P < 0. 05,**P < 0. 01,***P < 0. 001 vs control(n = 5)
3. 2 鳢肠不同部位对 UMR106 细胞 ALP 活性的影

鳢肠根、茎、叶的 80%乙醇提取物对 UMR106
细胞的 ALP活性均具有促进作用,浓度为 100 μg /
mL时作用最强,分别促进 18. 9%(P < 0. 001),20.
1%(P < 0. 01) ,17. 0%(P < 0. 001) (图 4)。
120
100
80
60
40
20
0
Control Root Stem Leaf
Control
100%ug/mL
50%ug/mL
20%ug/mL
图 4 鳢肠不同部位提取物对 UMR106 细胞 ALP活性的影响
Fig. 4 Effect of the extracts from different parts of E. pros-
trata on UMR-106 cell ALP activity
与空白组比较(n = 5):* P < 0. 05,**P < 0. 01,***P < 0. 001
* P < 0. 05,**P < 0. 01,***P < 0. 001 vs control(n = 5)
3. 3 鳢肠不同部位总皂苷和总黄酮含量
鳢肠根,茎,叶中皂苷含量分别为 3. 6%,
4. 0%,2. 2%;黄酮含量分别为 1. 4%,1. 4%,3. 4%
(图 5)。其中鳢肠茎中的皂苷含量最高,而黄酮含
量最低;叶中的皂苷含量最低,而黄酮含量最高,根
的皂苷、黄酮含量居中。
1321Vol. 26 黄运喜等:鳢肠不同部位抗骨质疏松活性及化学成分比较研究
Root Stem Leaf
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
Saponin
Flavone
%
图 5 鳢肠不同部位总皂苷和总黄酮含量
Fig. 5 The contents of total saponins and total flavonoids
from different parts of E. Prostrata
4 讨论
成骨细胞在骨形成过程中主要经历成骨细胞增
殖、细胞外基质成熟、矿化和成骨细胞凋亡四个阶
段[12]。其中,成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加,
形成多层细胞,并合成、分泌 I型胶原以便最终可以
矿化形成骨结节;在增殖晚期,成骨细胞增殖速度减
慢,由增殖期进入分化期;在分化早期主要是 ALP
表达,ALP是成骨细胞所分泌的一种同源二聚体糖
蛋白,其表达的强度是识别和评价成骨细胞分化程
度的早期特异性标志,而且表达随着细胞分化的发
展而增强。因此,ALP 被认为是细胞外基质早期和
中期分化的标志[13]。骨代谢中,骨生成与成骨细胞
的增殖与 ALP活性相关[14]。
墨旱莲是滋补肝肾的常用中药,含有多种黄酮
和皂苷类成分,其所含的黄酮类成分木犀草素、芹菜
素、槲皮素、Dismetin、3-hydroxybiochanin A 和 3-O-
methylorobol 等[7,15,16]均具有一定的抗骨质疏松作
用。研究结果显示鳢肠不同部位乙醇提取物对
UMR106 成骨细胞增殖和 ALP活性有不同程度的促
进作用,其中鳢肠根对成骨细胞增殖和 ALP 活性均
有显著的促进作用,对 ALP活性的促进作用与茎和
叶的差异并不大。化学成分分析结果显示,鳢肠不
同部位总皂苷和总黄酮的含量差异较大,其中根与
茎的总皂苷和总黄酮含量差异并不大。
墨旱莲为鳢肠地上干燥部分,实验表明,鳢肠的
根与鳢肠地上部分有相似的生物活性,这可能也是
文献记载墨旱莲为醴肠全草入药的原因[3]。因此,
我们认为,市场流通中的墨旱莲药材中混有少量的
醴肠根并不会影响到墨旱莲药材的整体质量。另
外,虽然已有许多墨旱莲皂苷和黄酮化学成分的研
究[6,10,17],但至今其质量标准中仍未有该项目的检
测,因此建立墨旱莲总皂苷和总黄酮的测定方法为
其药材质量标准的研究提供依据。
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