全 文 ：第31卷第5期
2 0 1 0年 9月
西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 )
Journal of Xian Jiaotong University(Medical Sciences)
Vol.31 No.5
Sep.2010
葎草花粉致敏的小鼠肺部变应性炎症模型的建立
李雅莉1 ,张 明2 ,卢家美1 ,刘 昀1 ,杨 侠1 ,孙秀珍1
(西安交通大学医学院第二附属医院:1.呼吸内科;2.心内科 , 陕西西安 710004)
摘要:目的 建立葎草花粉粗浸液致敏激发的小鼠肺部变应性炎症模型。方法 24 只 BALB/c小鼠随机平均分为正
常对照组和哮喘模型组。观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比;HE 染色观察葎草花
粉粗浸液激发小鼠肺部变态反应性炎症;酶联免疫吸附试验检测 BALF 、脾组织匀浆中的细胞因子及血清总 IgE 抗
体。结果 与正常对照组比较 , 模型组可诱导肺组织出现明显的变应性炎症 , 且病理炎症评分有统计学差异
(P<0.01);BALF 中的细胞总数 、嗜酸性粒细胞(EOS)计数 、IL-4 , 脾脏重量 ,脾组织匀浆 IL-4和血清总 IgE抗体均显
著高于正常对照组(P<0.01)。结论 葎草花粉粗浸液能够成功建立小鼠肺部变态反应性炎症模型。
关键词:葎草花粉粗浸液;哮喘;动物模型
中图分类号:R593.1 文献标志码:A 文章编号:1671-8259(2010)05-0562-04
Establishment of a mouse model of Humulus pollen
allergen-induced allergic asthma
LI Ya-li1 , ZHANG M ing 2 , LU Jia-mei1 , LIU Yun1 , YANG Xia1 , SUN Xiu-zhen1
(1.Depar tment of Re spiratory M edicine;2.Depar tment of Cardio logy , the Second
Affiliated Hospi tal , Medical Schoo l of Xian Jiaotong Univer sity , Xian 710004 , China)
ABSTRACT:Object ive To develop a mouse model of allergic airway inflammation by using crude Humulus
pollen extr act.Methods A total of 24 Balb/c mice were divided r andom ly into two groups:control group and
asthma model group with 12 in each.After sensitization by intr aperitoneal injection , the mice were challenged by
intr anasal instilla tion of crude Humulus pollen extr act.The tot al cell numbe r and eosinophile per centage of
bronchoalveolar lavage fluid (BALF)samples were determined.The lungs of mice we re sta ined with hematoxylin
and eosin to evalua te the degree of allergic inflammation.The cytokines in BALF and spleen homogenate were
assayed by enzyme-linked immunoassay (ELISA).The total I gE in the serum was also measured by ELISA.
Results Compared with the mice in normal control group , those in asthma group developed obvious allergic
inflammation in the airways.Histologic al scoring for pulmonary inf lammation signif ic antly diffe red be tween normal
group and asthma group (P <0.01).The total cell number , eosinophile per centage and IL-4 in BALF , spleen
weight , IL-4 in spleen homogenate , and IgE antibody in serum were all significantly incr eased in asthma group
compared with those in normal group (P <0.01).Conclusion Crude Humulus pollen extrac t can successfully
induce a mouse model of allergic pulmonary inflamma tion.
KEYWORDS:crude H umulus pollen extr act;asthma;animal model
收稿日期:2009-12-27 修回日期:2010-04-10
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30371336)
Supported by the National Natu ral S cien ce Foundation of
China(No.30371336)
通讯作者:孙秀珍 ,教授.E-m ail:doc-ly@sohu.com
作者简介:李雅莉(1960-),女(汉族),学士 , 教授.研究方向:哮喘的
防治.E-m ail:li-ya-li@sohu.com
支气管哮喘是全球关注的公共健康问题 ,也是儿
童与成人的常见病 、多发病 ,其本质是气道变态反应
性炎症 。近年来其发病率和病死率不断升高[ 1] ,不但
严重威胁到人类的身心健康 ,而且还给家庭乃至社会
带来严重的经济负担 。引起人类支气管哮喘发病的
变应原种类颇多 ,在不同国家 、地区和季节的主要变
应原差异较大。国内学者通过大量的临床调研表明 ,
葎草花粉是我国夏秋季主要的致敏花粉之一[ 2-3] ,常
常引起哮喘急性发作 ,需要给予抗炎 、平喘 、解痉等治
疗 。但是 ,只有葎草花粉变应原疫苗的特异性免疫治
疗才是唯一针对病因的治疗 。鉴于人体试验的局限
性和安全性 ,需开展葎草花粉变应原的研究 ,故制备
葎草花粉过敏的哮喘小鼠模型显得尤为重要。在本
研究中 , 我们采用葎草花粉粗浸液致敏和激发
BALB/c小鼠 ,从而成功制备了葎草花粉过敏的小鼠
5 期 李雅莉 ,张 明 , 卢家美 ,等.葎草花粉致敏的小鼠肺部变应性炎症模型的建立
肺部变应性炎症模型 ,旨在阐明葎草花粉诱导的肺部
变应性炎症的病理与病理生理学特点 ,为研究支气管
哮喘的发病机制与治疗方法提供新的手段。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂 SPF 级 BA LB/c 小鼠 24
只 ,雌性 , 7周龄 ,体重(18±2)g ,购于西安交通大学
医学院实验动物中心 。氢氧化铝凝胶由本实验室自
制 ,RIPA裂解液购于西安沃尔森生物有限公司 ,小鼠
白细胞介素(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)及 IgE酶联免疫
吸附反应检测(ELISA)试剂盒购于美国 RD公司。
1.2 葎草花粉粗浸液的制备及其浓度测定 自然脱
落法收集葎草花粉 ,9 号分样筛过筛 ,室温下乙醚脱
脂。取脱脂花粉 5 g 加 Cocas液 100 mL ,超声粉碎后
4 ℃下搅拌提取 72 h ,4 ℃下 2 800 r/min离心 15 min ,
取上清。上清液以 Cocas液透析 24 h ,自然蒸发浓缩 ,
之后除菌滤过并经考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含
量。以牛血清白蛋白制作标准曲线 ,取 595 nm处的吸
光度值为纵坐标 ,蛋白质含量为横坐标 ,得到标准曲线
方程为Y =0.003+0.004X ,根据标准曲线计算葎草花
粉提取液蛋白质浓度为 0.95 mg/mL ,最终调整葎草花
粉提取液蛋白浓度为 1 mg/mL 与 10 mg/mL ,分别用
于小鼠腹腔注射致敏和滴鼻激发。
1.3 动物分组 24 只 BALB/c 小鼠随机分为正常
对照组和模型组 ,每组 12只;饲养于西安交通大学医
学院 SPF 级动物房。
1.4 葎草花粉粗浸液诱导小鼠支气管哮喘模型的建
立 模型组用 1 mL 注射器腹腔注射 300 μg 葎草花
粉粗浸液加氢氧化铝凝胶 2 mg 致敏 ,对照组采用等
体积的无菌 PBS 代替变应原进行实验。之后第7 、14
天后加强致敏 ,方法与剂量同上。第 24天模型组所
有小鼠给予 30μL(10mg/mL)葎草花粉粗浸液滴鼻
激发 ,每天 1次 ,连续 5次;对照组采用等量无菌 PBS
代替变应原进行滴鼻 ,每天 1次 ,连续 5 d。最后 1次
滴鼻后 24 h ,进行以下检查 。
1.5 血液的采集 从每只小鼠眼窝取血约 0.8 mL ,
室温放置 2 h ,离心 3 000 r/min 6 min ,血清移至另一
干净 Eppendorf管 , -20 ℃保存。
1.6 脾组织匀浆的制备 处死小鼠 ,无菌条件下分
离小鼠脾脏 ,称重后将脾组织切碎置入组织匀浆器进
行手工研磨 ,之后再按 1∶5 的比例加入 RIPA 裂解
液 ,在 4 ℃的条件下裂解 1 h 后 ,离心取上清液于
-70 ℃的低温冰箱保存 ,用于测定细胞因子 IL-4和
IFN-γ。
1.7 支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集及嗜酸性粒
细胞计数 每组各取 8只小鼠行通过气管插管术的
支气管肺泡灌洗 ,分 2次缓慢注入 4 ℃冷 PBS 液 ,每
次 0.5 mL ,缓慢收集 ,回收液为 80%左右。BALF
离心(1 500 r/min)6min ,收集上清液-20 ℃保存 ,用
于细胞因子的测定 。细胞沉淀用 0.5 mL 生理盐水
重悬 ,并用血细胞计数板进行细胞计数 ,计算每毫升
细胞数 。取少许重悬液体涂片 ,室温晾干后 Wright
染色 ,光学显微镜下进行细胞分类 ,数 200个细胞 ,求
出嗜酸性细胞的百分比。
1.8 肺组织病理学检查 取各组未经支气管肺泡灌
洗的 4只小鼠的左肺组织 ,均用 100 mL/L 甲醛溶液
固定过夜。常规取材后制备 HE染色切片 ,光镜下观
察肺组织嗜酸性粒细胞浸润 、水肿和气道上皮损伤情
况 ,根据 Underw ood的标准[ 4] 进行病理评分 。
1.9 BALF和脾组织匀浆中的 IFN-γ和 IL-4含量的
测定 IL-4和 IFN-γ测定按 ELISA 试剂盒说明书
进行。即每孔加入标准品稀释液或待测样品 100
μL ,室温孵育 2 h ,用洗涤液洗板 5次;加入酶标抗体
工作液 100μL ,室温孵育 2 h ,洗涤液洗板 5次;加入
底物工作液 100 μL ,置室温暗处反应 30 min;加入
100μL 终止液终止反应 。分别在 450 nm 读取吸光
(A)值 ,然后绘制出 A450 nm对细胞因子浓度标准曲线 ,
根据待测样品 A450 nm值 ,计算出标本中 IL-4与 IFN-γ
的含量 。
1.10 血清中总 IgE的测定 小鼠血清用标本稀释
液作 1∶20稀释 ,之后按照 ELISA 试剂盒说明书逐
步进行 ,测定血清中总 IgE含量。
1.11 统计学处理 实验数据用均数±标准差( x ±s)
表示 ,应用 SPSS15.0软件对各组间的均数进行两独
立样本 t检验。P <0.05为差异有统计学意义 。
2 结 果
2.1 动物的症状 模型组小鼠一般于激发 3 min 后
开始出现头 、鼻 、面部及躯干瘙痒 ,并有不同程度的烦
躁不安或安静少动 、呼吸加快加深 、点头呼吸 、弓背直
立 、前肢缩抬 、二便失禁等哮喘速发相反应表现;而正
常对照组小鼠活动自如 ,无上述表现 。
2.2 BALF中细胞总数及其分类计数 我们通过对
BALF 进行细胞计数 ,结果表明 ,模型组小鼠 BALF
中白细胞总数为(44.91±2.03)×104/mL ,显著高于对
照组 BALF 中的白细胞总数(17.19±0.5)×104/mL;
且模型组 BALF 中嗜酸性粒细胞分类计数(24±6.2)
较对照组(0.53±0.26)亦显著升高(P<0.01)。
2.3 小鼠肺组织的病理学改变 模型组小鼠小支气
管 、血管黏膜下和周围肺组织均有明显的炎性细胞
563
西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 ) 第 31 卷
(嗜酸性粒细胞 、中性粒细胞 、淋巴细胞和巨噬细胞)
浸润 ,大量炎性细胞向小支气管和血管迁移 ,血管壁
明显水肿 ,部分切片还可见上皮细胞脱落或管腔内有
黏液栓形成。而对照组无明显变化 ,小鼠支气管黏膜
上皮 、黏膜肌层均完好 ,支气管管腔规则 ,周围无炎性
细胞浸润(图 1)。采用 Underwood的标准进行病理
炎症评分 ,发现模型组小鼠肺部的炎症浸润程度明显
重于正常对照组(P<0.001)。
图 1 小鼠肺组织的病理学改变
Fig.1 Pathological changes o f mouse lung tissues(HE , ×400)
A:对照组;B:模型组。
2.4 小鼠 BALF中 IL-4和 IFN-γ的测定 小鼠经
葎草花粉粗浸液致敏激发后 ,与正常对照组比较 ,模
型组肺泡灌洗液中 IL-4 含量显著升高 ,而 IFN-γ含
量显著下降(P<0.01 ,表 1)。
表 1 葎草花粉致敏小鼠 BALF中 IL-4 和 IFN-γ含量的变化
Tab.1 IL-4 and IFN-γ leve ls in BALF o f Humulus po llen
ext ract sensitized mice ( x ±s)
分组 例数 IL-4(pg/m L) IFN-γ(pg/m L)
对照组 8 36.70±2.06 50.90±2.89
模型组 8 79.61±2.19 ＊ 31.29±1.58 ＊
与对照组比较 , ＊P<0.01。
2.5 小鼠脾脏重量及脾组织匀浆中细胞因子的比较
取出脾脏后 ,统一称重 ,发现模型组脾脏的重量显著高
于正常对照组(P<0.01)。通过 ELISA 法测定外周免
疫器官脾脏组织匀浆上清液中的 IL-4和 IFN-γ含量。
与正常对照组比较 ,模型组小鼠脾脏中 IL-4含量组明显
升高 , IFN-γ的含量显著降低(P<0.01 ,表2)。
表 2 葎草花粉致敏的小鼠脾脏重量及其匀浆中 IL-4 和 IFN-γ
含量的比较
Tab.2 Spleen w eight and IL-4 and IFN-γleve ls in spleen ho-
mogenate of H umulus pollen ext ract sensitized mice ( x ±s)
分组 例数 脾脏重量(mg) I L-4(pg/mL) IFN-γ(pg/mL)
对照组 12 100.75±8.89 171.99±24.94 1093.71±250.19
模型组 12 142.27±27.52＊ 347.14±39.98＊ 839.39±122.78＊
与对照组比较 , ＊P<0.01。
2.6 小鼠血清中总 IgE含量的测定 ELISA 法测
定葎草花粉致敏的小鼠血清中总 IgE含量为(3.15±
0.99)μg/mL ,而对照组小鼠血清中总 IgE 含量为
(0.42±0.07)μg/mL ,两组之间有显著的统计学差异
(P<0.01)。
3 讨 论
支气管哮喘是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞 、肥
大细胞 、T 细胞 、中性粒细胞 、气道上皮细胞等)和细
胞组分参与的气道慢性炎症性疾病 ,并伴有气道高反
应性 、可逆性气流受限 、黏液高分泌和血清 IgE 的升
高 ,晚期可出现气道重塑[ 5] 。鉴于人体试验研究的安
全性 ,动物模型是研究人类哮喘不可缺少的手段之
一 。目前 ,已成功构建了多种变应原炎症的动物模
型 ,如卵蛋白[ 6] 、尘螨[ 7] 、蟑螂[ 8] 、豚草花粉[ 9] 等 ,而没
有一个动物模型能够完全模拟人类支气管哮喘的发
作过程[ 10] 。利用这些已存在的动物哮喘模型 ,不但
很好地研究支气管哮喘的发病机制 ,而且也为开展变
应原研究提供了一个重要手段 。但是 ,目前尚未见葎
草花粉变应原致敏的哮喘动物模型报道 。
葎草花粉是我国最主要的吸入性变应原之
一[ 2-3] ,并且患者逐年增多。目前 ,国内外文献对小鼠
致敏和激发的方式也有着诸多报道 。例如 ,采用腹腔
注射 、皮下注射 、肌肉注射 、鼻内滴入等方法致敏;而
激发的方式则主要集中在鼻内滴入和雾化吸入两种
激发方式上 。在本研究中 ,我们通过第 0 天腹腔注
射 ,第 7 、14 天加强致敏 ,之后连续 5 d 滴鼻激发 ,结
果发现葎草花粉粗浸液变应原能够成功诱导小鼠肺
部变应性炎症 ,表现为小气道和血管周围出现大量炎
症细胞 ,并可见许多嗜酸性粒细胞浸润;而对照组小
鼠小气道和血管周围并无炎性细胞渗出 。BA LF 中
亦存在大量炎性细胞 ,也以嗜酸性粒细胞为主 。研究
结果证实了我们成功构建了葎草花粉致敏的小鼠肺
部变应性炎症模型 ,其病理变化和人类变应性哮喘的
病理特征基本相似。
变应性哮喘的主要免疫学改变是 Th1/ Th2细胞
比例和功能失衡[ 11] ,其分泌的细胞因子在支气管哮
喘中起着重要的作用。 Th2分泌的特征性细胞因子
I L-4 ,刺激活化 B 细胞和 T 细胞增殖 、CD4+T 细胞
分化成 Th2细胞 ,使 IgE 及 IgG1 合成增多 ,募集嗜
酸性粒细胞向小气道浸润 ,因而在支气管哮喘的起病
和进展中起着重要的作用;而 IFN-γ为 Th1 型细胞
因子 ,能够抑制 Th2型细胞因子的作用 ,对支气管哮
喘起保护作用[ 12] 。在本实验中 ,我们发现模型组小
鼠脾脏重量显著高于正常对照组 ,间接说明模型组小
鼠的外周免疫器官发生了强烈的免疫反应;且模型组
小鼠 BA LF 和脾组织匀浆中 IL-4 显著升高 、血清
564
5 期 李雅莉 ,张 明 , 卢家美 ,等.葎草花粉致敏的小鼠肺部变应性炎症模型的建立
IgE增加 、IFN-γ降低 ,表明葎草花粉粗浸液致敏激
发诱导了小鼠 Th2型免疫反应 。
国内外许多学者[ 13] 通过腹腔注射致敏和雾化吸
入激发的方法成功建立了哮喘动物模型 ,更加真实地
模拟了人类哮喘的发病过程。但是 ,由于葎草花粉粗
浸液的制备较为复杂 ,采用滴鼻激发的方法不但成功
制备了葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型 ,而且还减少了
葎草花粉粗浸液用量 。另外 ,由于实验室条件的局限
性 ,本实验仅观察了气道和肺部炎症的病理学改变及
与支气管哮喘相关的特异性细胞因子的改变 ,尚未观
察此模型的气道反应性变化 ,有待后续实验的进一步
完善 。进一步完善此模型也将为开展葎草花粉变应
原 DNA 疫苗 、重组葎草花粉变应原及变应性哮喘的
研究奠定坚实的基础 。
参考文献:
[ 1] YEATTS K , SLY P , SHORE S , et al.A brief targeted review
of suscep tib ility factors , en vironmen tal exposur es , as thma inci-
dence , and recommend ations for futur e as thma in cid en ce [ J] .
Environ H ealth Persp , 2006 , 114:634-640.
[ 2] YIN J , YE ST, GU RJ , et al.An important al lergen ic pollen in
china-humulus [ J] .J Aller gy Cl in I mmun , 1995 , 95:164.
[ 3] PARK JW , KO SH , KIM CW , et al.Ident ificat ion and ch arac-
t erization of the major al lergen of the H umulus japonicus pollen
[ J] .Clin Exp Allergy , 1999 , 29(8):1080.
[ 4] MYOU S , LEFF AR , MYO S , et al.Blockade of inflammat ion
and airway hyperresponsiven ess in immune-sensi tized mice by
dominant-negat ive p hosphoinosit id e 3-kin ase-TAT [ J] .J Exp
Med , 2003 , 198(10):1573-1582.
[ 5] 钟南山.支气管哮喘:基础与临床 [ M] .北京:人民卫生出版社 ,
2006:438-443.
[ 6] YUK JE , WOO JS , YUN CY , et al.E ffects of lactos e-beta-s i-
tos terol and beta-s itos terol on ovalbumin-induced lung in flam-
mat ion in actively s ensi ti zed mice [ J] .Int Immunopharmacol ,
2007 , 7(12):1517-1527.
[ 7] 郝敏麒 ,徐军 ,钟南山.尘螨致敏小鼠肺部变应性炎症模型的建
立 [ J] .中国病理生理杂志 , 2003 , 19(1):139-141.
[ 8] 许卓谦 ,刘志刚 ,于琨瑛 ,等.蟑螂变应原诱导小鼠肺部变应性炎
症动物模型的研究 [ J] .免疫学杂志 , 2006 , 22(5):491-495.
[ 9] FAN M , MUSTAFA SJ.Role of adenosine in ai rway inflamma-
t ion in an aller gic mouse model of as thma [ J] .Int I mmunop-
harmacol , 2006 , 6(1):36-45.
[ 10] KURUCZ I , SZELENYI I.Current animal mod els of br onch ial
as thma [ J] .Curr Ph arm Design , 2006 , 12:3175-3194.
[ 11] MEILER F , ZIMMERMANN M , BLASER K , et al.T-cel l
subsets in the path ogen esis of h uman asthma [ J] .Cur r Allergy
Asthma R , 2006 , 6:91-96.
[ 12] SHAHID SK , KHARITONOV SA , WILSON NM , et al.I n-
cr eased in terleukin-4 an d decr eased in terferon-gamma in exhaled
br eath condensate o f children wi th asthma [ J] .Am J Resp Cri t
Care Med , 2002 , 165(9):1290-1293.
[ 13] LI U X J , LI MC , WU Y , et al.An ti-IL-33 an tibody t reatmen t
in hibi ts airway in flammation in a murine mod el of al lergic asth-
ma [ J] .Bioch em Bioph Res Co , 2009 , 386(1):181-185.
(编辑 卓选鹏)
(上接第 530 页)
[ 11] LAWN RM , WADE DP , COUSE TL , et al.Local izat ion of
human ATP-binding cass et te t ranspor ter 1(ABCA1)in n ormal
an d atherosclerot ic t issues [ J] .Arter os cler Thromb Vasc Biol ,
2001 , 21(3):378-385.
[ 12] LANGMANN T, KLUCKEN J , REIL M , et al.Molecular cloning
of the human ATP-binding cassette t ranspor ter 1(hABCA1):evi-
dence for sterol-dependen t regulation in macrophages [ J] .Biochem
Biophys Res Commun , 1999 , 257(1):29-33.
[ 13] ORAM JF , HEINECKE JW.ATP-bind ing casset te t ranspor ter
A1:a cell ch oles terol exp orter th at protects agains t cardiovascu-
l ar dis eas e [ J] .Phys iol Rev , 2005 , 85(4):1343-1352.
[ 14] VULETIC S , RIEKSE RG , MARCOVINA SM.Statins of d if-
ferent brain penetr ab ili ty different ially affect CSF PLTP activi-
ty [ J] .Demen t Ger iatr Cogn Disord , 2006 , 22(5-6):392-398.
(编辑 卓选鹏)
565