全 文 :葎草颗粒对慢性支气管炎模型小鼠的作用
李东
(徐州生物工程职业技术学院,徐州 221006)
摘 要 目的 探讨葎草颗粒对实验性慢性支气管炎小鼠的作用及其作用机制。方法 将小鼠随机分为正常对照
组,右美沙芬组或氯化铵组,葎草颗粒大剂量、中剂量、小剂量组( 分别灌胃葎草颗粒溶液 3.00,1.50,0.75 g·kg-1 ) ,观察
葎草颗粒对浓氨水致咳小鼠影响和对小鼠气管酚红排泌量的影响。采用香烟加甲醛熏法复制慢性支气管炎小鼠模型,
将 60只小鼠按随机数字法分为 6组:正常对照组,模型对照组,桂龙咳喘宁胶囊组,葎草颗粒大剂量、中剂量、小剂量组,
每组 10只。从造模第 18天起,正常对照组和模型对照组小鼠灌胃 0.9%氯化钠溶液,葎草颗粒大剂量、中剂量、小剂量
组小鼠灌胃葎草颗粒,剂量分别为 3.00,1.50,0.75 g·kg-1 ;桂龙咳喘宁胶囊组小鼠灌胃桂龙咳喘宁胶囊内容物,剂量为
600 mg·kg-1,每天 1次,共 15 d。观察各组小鼠肺组织白细胞介素-8( IL-8) 、肿瘤坏死因子-α( TNF-α) 的含量。结果
通过苏木精-伊红( HE) 染色观察发现,葎草颗粒能明显减轻小鼠慢性支气管炎的损伤程度;正常对照组、葎草颗粒大剂
量、中剂量、小剂量组 2 min内分别咳嗽( 17.50±5.38) ,( 11.90±4.46) ,( 12.60±3.47) ,( 9.50±3.24) 次;酚红分泌量分别为
( 0.52±0.11) ,( 0.65±0.15) ,( 0.64±0.14) ,( 0.67±0.19) μg·mL-1 ;葎草颗粒能明显减少氨水导致的小鼠咳嗽次数,增加小
鼠气管酚红排泄量。正常对照组,模型对照组及葎草颗粒大剂量组肺组织 TNF-α 的含量分别为( 25.8±6.9) ,( 66.3±
11.7) ,( 43.5±7.7) ng·mg-1,肺组织 IL-8的含量分别为( 27.1±9.1) ,( 48.2±11.4) ,( 36.5±8.2) ng·mg-1。模型对照组
TNF-α、IL-8含量均较正常对照组明显升高( P<0.01) ;与模型对照组比较,大剂量葎草颗粒可明显降低肺组织中 TNF-α
和 IL-8的含量( P<0.01或 P<0.05) 。结论 葎草颗粒对慢性支气管炎模型小鼠病理损伤有明显改善作用,并具有镇咳
和祛痰作用,其作用机制可能与降低 TNF-α、IL-8含量有关。
关键词 葎草颗粒;支气管炎,慢性;肿瘤坏死因子;白细胞介素
中图分类号 R286; R285.5 文献标识码 A 文章编号 1004-0781( 2015) 10-1284-04
Effect of Humulus Scandens Particles on Chronic Bronchitis Models of Mice
LI Dong ( Xuzhou Vocational College of Bioengineering,Xuzhou 221006,China)
ABSTRACT Objective To study the effects and the therapeutic mechanism of Humulus scandens particles ( HSP) on the
mice with chronic bronchitis ( CB ) . Methods Mice were divided into normal control group,dextromethorphan group or
ammonium chloride group,the high-,middle-and low-dose of HSP groups ( These three groups received gavage administration of
HSP at 3.00 g·kg-1,1.50 g·kg-1 and 0.75 g·kg-1,respectively) randomly.The effects of HSP on ammonia-induced cough and
trachea phenol red excretion in mice were observed.CB mouse model was established by inhaling smoke and formaldehyde.In total,
60 mice were divided into 6 groups by the method of random digits table: normal control group,model control group,Guilong
kechuanning capsule group,the high-,middle-and low-dose HSP groups ( n=10 each group) .After modeling for 18 days,mice in
normal control group and model control group were administered intragastrically with 0.9% sodium chloride solution.Mice in the
high-,middle-and low-dose HSP groups were daily treated with HSP at 3.00,1.50 and 0.75 g·kg-1,respectively,by intragastric
administration.Mice in Guilong kechuanning Capsule group were administered with Guilong kechuanning Capsule ( 600 mg·kg-1 ),
once a day,for 15 days.The tumor necrosis factor alpha ( TNF-α) & interleukin-8 ( IL-8) contents in lung tissues of each group
were determined. Results By hematoxylin-eosin ( HE) staining,it was found that HSP alleviated the damage of CB in mice.The
frequency of cough in 2 min in the normal control group,the high-,middle- and low-dose HSP groups were ( 17. 50± 5. 38),
( 11.90±4.46),( 12.60±3.47),( 9.50±3.24),respectively,and the ecretion of phenol red were ( 0.52±0.11),( 0.65±0.15),
( 0.64±0.14),( 0.67±0.19) μg·mL-1,respectively. The content of TNF-α in lung tissues of the normal control group,model
control group,the high dose HSP group was ( 25.8±6.9),( 66.3±11.7),( 43.5±7.7) ng·mg-1,respectively.The content of IL-8 in
lung tissues of the normal control group,model control group,the high-dose HSP group were ( 27.1±9.1),( 48.2±11.4) and
( 36.5±8.2) ng·mg-1,respectively.The contents of TNF-α and IL-8 in lung tissues of the model control group were significantly
higher than those in normal control group ( both P<0.01) .Compared with the model control group,high-dose HSP could obviously
decrease the contents of TNF-α and IL-8 in lung tissues ( P<0.01 or P<0.05) . Conclusion HSP can obviously alleviate the
pathomorphological changes in mice with CB and has antitussive and expectorant effecs.The therapeutic mechanism of HSP for CB
may be related to decreasing the contents of TNF-α and IL-8 in lung tissue.
KEY WORDS Humulus scandens particles; Bronchitis,chronic; Tumor necrosis factor; Interleukin
慢性支气管炎是危害健康的常见病和多发病,咳、
痰是呼吸系统疾病主要症状,炎症和变态反应是疾病
的起因[1]。葎草颗粒由葎草、夏枯草、百部、白芨等中
药组成,具有清肺止咳的功效。笔者对葎草颗粒的镇
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咳、祛痰药理作用进行研究,并采用香烟加甲醛熏法制
作慢性支气管炎小鼠模型,通过观察葎草颗粒对慢性支
气管炎小鼠肺组织中肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis
factor α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-8含量的
影响,以阐明其治疗慢性支气管炎的可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 清洁级昆明种小鼠,体质量(20 ±
2)g,雌雄各半,由徐州医学院实验动物中心提供,实
验动物生产许可证:SCXK(苏)2010-0003,动物合格证
号:SYXK(苏)20032003。实验动物使用许可证:
SYXK(苏)2014-0011。饲养环境 20~25 ℃,相对适度
60%~70%,保持安静清洁,通风通气。
1.2 药品与试剂 葎草颗粒(由徐州生物工程学院制
剂室制备);IL-8、TNF-α 免疫试剂盒购自北京北免东
雅生物技术研究所,批号:120910,120925。氢溴酸右
美沙芬胶囊(唐山容大药业有限公司,批号:120902);
氯化铵,西陇化工股份有限公司,批号:100223;桂龙咳
喘宁胶囊[桂龙药业(安徽)有限公司,批号:121016];
氨水(沈阳天罡化学试剂厂,批号:110811);酚红(上
海抚生生物科技有限公司,批号:130506)。
1.3 主要仪器 高速离心机(上海分析仪器);可控式
恒温水浴锅(上海锦屏仪器仪表有限公司);DIAX900
内切式组织匀浆机(Heidolph 公司);SN-682 型放射免
疫 γ计数器(上海核辐射光电仪器厂);Leica 切片机
(上海五相仪器仪表有限公司)。
1.4 对浓氨水致咳小鼠的影响 参照文献[2]。取小
鼠 50只,雌雄各半,称定质量、编号后,数字随机法分
为 5组,即正常对照组、右美沙芬组及葎草颗粒大剂
量、中剂量、小剂量组,每组 10 只。葎草颗粒大剂量、
中剂量、小剂量组分别灌胃葎草颗粒溶液 3.00,1.50,
0.75 g·kg-1,右美沙芬组给予右美沙芬0.015 g·kg-1,
正常对照组给予等容积0.9%氯化钠溶液,每只小鼠给
药间隔约 4 min,连续灌胃给药 7 d,末次给药后 1 h,将
小鼠扣入500 mL烧杯中,再将注入浓氨水 0.2 mL的棉
球迅速放入烧杯中,上面加盖筛网,以小鼠腹肌强烈收
缩,并且张大嘴为咳嗽动作指标,记录小鼠的咳嗽潜伏
期和 2 min内及3 min内咳嗽次数。
1.5 对小鼠气管酚红排泌量的影响 参照文献[2]。
将小鼠随机数字表法分为 5组,即正常对照组、氯化铵
组及葎草颗粒大剂量、中剂量、小剂量组,每组 10 只。
收稿日期 2014-08-05 修回日期 2014-10-06
作者简介 李东(1979-),男,河北徐水人,讲师,硕士,研
究方 向:中 药 新 药 研 发。电 话:0516 - 3628047,E-mail:
lidong3379@ aliyun.com。
每天灌胃给药一次,连续 7 d,葎草颗粒大剂量、中剂
量、小剂量组分别灌胃葎草颗粒溶液 3. 00,1. 50,
0.75 g·kg-1,氯化铵组前 6 d灌胃给予 0.9%氯化钠溶
液,于实验当天给予氯化铵,末次给药后 30 min,腹腔
注射 5%酚红溶液 500 mg·kg-1,30 min后处死小鼠,
取自甲状软骨下至气管分支处的一段气管,放入盛有
5%碳酸氢钠溶液 3 mL中,充分振荡,使气管段中的酚
红完全释放,用分光光度计在波长 546 nm处测吸光度
(A)值,用酚红作标准曲线,根据曲线计算酚红含量。
1.6 对小鼠慢性支气管炎的影响 将 60 只小鼠按随
机数字法分为 6组:正常对照组,模型对照组,桂龙咳
喘宁胶囊组,葎草颗粒大剂量、中剂量、小剂量组,每组
10只。小鼠慢性支气管炎模型的复制,参照文献[3]
造模方法并加以改进,建立烟熏联合甲醛刺激致小鼠
慢性支气管炎模型。将除正常对照组外 5组小鼠放置
于自制的玻璃烟室内,在烟室上方用 3 条细线悬挂直
径为 10 cm的圆形滤纸,在滤纸上喷入甲醛,刺激
10 min后取出,间隔 10 min 后,烟熏 10 min,每次 5 支
香烟。烟熏联合甲醛刺激共 25 d,其中前 7 d,每次甲
醛量为 220 μL,从第 8 天开始每次甲醛量增至
1 000 μL,后 7 d停用甲醛。从造模第 18天起,正常对
照组和模型对照组小鼠灌胃 0.9%氯化钠溶液,葎草颗
粒大剂量、中剂量、小剂量组小鼠灌胃葎草颗粒,剂量
分别为 3.00,1.50,0.75 g·kg-1(分别相当于人剂量的
14.20,7.10,3.55 倍);桂龙咳喘宁胶囊组小鼠灌胃桂
龙咳喘宁胶囊,剂量为 600 mg·kg-1,每天 1 次,共
15 d。给药结束后 24 h,取小鼠左侧肺脏中部组织
0.4 cm×0.4 cm,用 10%甲醛溶液固定,组织切片用苏
木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色,光镜观察
肺与支气管的组织形态变化;同时称取湿质量约 0.2 g
右肺中部组织,用组织匀浆机制备 10%肺组织匀浆,
采用放射免疫法检测肺组织匀浆中 IL-8、TNF-α 的含
量,各项检测均严格按试剂盒说明书操作。
1.7 统计学方法 用 SPSS13.0 版统计软件进行分
析,实验结果用均数±标准差(x±s)表示,进行 t 检验。
以 P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠肺组织病理学变化 正常对照组小鼠支气管、
细支气管形态基本正常,细胞排列整齐,未见增厚、变性、
坏死及炎症细胞浸润等病理变化。模型对照组小鼠肺组
织病理切片显示,大片状肺泡间隔增宽,肺泡腔内出血较
多,炎症细胞浸润,部分肺组织结构明显破坏,肺泡萎陷,
小鼠支气管管壁形态发生改变,黏膜结构不完整,出现纤
毛粘连、倒伏、脱失等病理变化,支气管管腔出现浆液渗
·5821·医药导报 2015年 10月第 34卷第 10期
出、黏膜层出现炎症细胞浸润,表明模型对照组小鼠出现
慢性支气管炎的病理改变,模型复制成功。葎草颗粒大
剂量、中剂量、小剂量组及桂龙咳喘宁胶囊组小鼠支气管
纤毛上皮细胞变性、坏死、脱落等病理变化均比模型对照
组轻;支气管管腔未见浆液渗出。见图 1。
2.2 葎草颗粒对浓氨水致咳小鼠的影响 结果见表
1,与正常对照组比较,右美沙芬组小鼠 2 和 3 min 内
咳嗽次数明显减少(P<0.05);葎草颗粒能明显减少小
鼠 2 min内咳嗽次数,葎草颗粒大剂量组、小剂量组小
鼠3 min内咳嗽次数明显减少(P<0.05或 P<0.01)。
2.3 葎草颗粒对小鼠气管酚红排泌量的影响 结果
见表 2。与正常对照组比较,葎草颗粒各剂量组小鼠
气管内酚红分泌量明显增加(P<0.05)。
2.4 葎草颗粒对慢支小鼠肺组织中 TNF-α 和 IL-8含
量的影响 结果见表 3。与正常对照组比较,模型对
照组 TNF-α、IL-8含量明显增加(P<0.01);与模型对
照组比较,葎草颗粒大剂量组肺组织中 TNF-α(P <
0.01)和 IL-8(P<0.05)含量明显降低。
3 讨论
慢性支气管炎是常见病、多发病,随着年龄增长,
患病率递增,现今公认吸烟为慢性支气管炎最主要的
发病因素。本实验采用烟熏联合甲醛刺激法复制小鼠
慢性支气管炎模型,光镜下可见模型对照组小鼠病理
切片支气管黏膜上皮坏死脱落,间质充血水肿,慢性炎
症细胞浸润。其组织病理学改变与文献[4]报道相
近,表明慢性支气管炎模型复制成功。葎草颗粒各剂
量组小鼠支气管炎症较轻,细支气管部分上皮脱落缺
失,肺泡腔充气良好,仅有少量炎症细胞浸润,表明葎
草颗粒可改善慢性支气管炎模型小鼠支气管炎的病理
变化,具有缓解支气管炎症的作用。
慢性支气管炎在中医学属于“咳嗽”“痰证”等范
畴,咳证病位主要在肺系,故前人有“咳证虽多,无非肺
病”的说法[5]。慢性支气管炎临床可出现每年持续 3个
月以上的咳嗽、咯痰等症状。急性发作期在抗感染治疗
的同时,应用祛痰、镇咳药,以改善症状[6]。氨水致咳实
验结果表明,葎草颗粒能明显减少小鼠咳嗽次数,酚红
排泄实验结果表明葎草颗粒能增加小鼠气管酚红排泄
量,由此可见葎草颗粒具有镇咳和祛痰作用。
TNF-α主要由单核-巨噬细胞所产生,活化的中性
粒细胞也可合成。TNF-α可参与全身炎症反应和多器
A.正常对照组; B.模型对照组; C.桂龙咳喘宁胶囊组; D.葎草颗粒小剂量组; E.葎草颗粒中剂量组; F.葎草颗粒大剂量组
图 1 6组小鼠肺组织病理图片(HE,×100)
A.normal control group;B.model control group;C.Guilong kechuanning capsule group;D. low-dose HSP group;E.medium-dose HSP
group;F.high-dose HSP group
Fig.1 Pneumal histopathology of six groups of mice(HE,×100)
表 1 5组小鼠咳嗽指标比较
Tab.1 Comparison of cough indicatrix among five groups of mice n= 10,x±s
组别
剂量 /
(g·kg-1)
潜伏期 /
s
咳嗽次数 /次
2 min内 3 min内
正常对照组 — 21.20±5.81 17.50±5.38 31.10±7.16
右美沙芬组 0.015 26.40±5.15* 1 11.70±4.11* 1 24.00±6.60* 1
葎草颗粒
大剂量组 3.00 20.10±4.93 11.90±4.46* 1 23.00±6.89* 1
中剂量组 1.50 23.40±5.04 12.60±3.47* 1 26.10±4.01
小剂量组 0.75 24.00±6.04 9.50±3.24* 2 23.10±3.84* 2
与正常对照组比较,t= -2.119,2.709,2.306,2.534,2.563,2.420,* 1P<0.05,t= 4.028,3.155,* 2P<0.01
Compared with normal control group,t= -2.119,2.709,2.306,2.534,2.563,2.420,* 1P<0.05,t= 4.028,3.155,* 2P<0.01
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表 2 5组小鼠气管酚红排泌量的比较
Tab.2 Comparison of phenol red excretion quantity by
trachea among five groups of mice n= 10,x±s
组别
剂量 /
(g·kg-1)
酚红分泌量 /
(μg·mL-1)
正常对照组 — 0.52±0.11
氯化铵组 1.00 0.73±0.28* 1
葎草颗粒
大剂量组 3.00 0.65±0.15* 1
中剂量组 1.50 0.64±0.14* 1
小剂量组 0.75 0.67±0.19* 1
与正常对照组比较,t = -2.197,-2.226,- 2. 176,- 2. 226,
* 1P<0.05
Compared with normal control group,t = - 2. 197,- 2. 226,
-2.176,-2.226,* 1P<0.05
表 3 6组小鼠肺组织中 TNF-α、IL-8含量测定值
Tab.3 Content determination on TNF-α and IL-8 in lung
of six groups of mice n= 10,x±s
组别
剂量 /
(g·kg-1)
TNF-α IL-8
(ng·mg-1)
正常对照组 — 25.8± 6.9* 1 27.1± 9.1* 1
模型对照组 — 66.3±11.7 48.2±11.4
阳性对照组 0.6 49.5± 6.2* 1 44.5±10.3
桂龙咳喘宁胶囊
大剂量组 3.00 43.5± 7.7* 1 36.5± 8.2* 2
中剂量组 1.50 59.0± 8.5 47.1±11.8
小剂量组 0.75 60.3±10.2 49.1±12.7
与模型对照组比较,t = 9. 393,4. 577,4. 013,5. 108,* 1 P <
0.01,t= 2.643,* 2P<0.05
Compared with model control group,t = 9. 393,4. 577,4. 013,
5.108,* 1P<0.01,t= 2.643,* 2P<0.05
官功能障碍的发生[7]。在高浓度时,会引起局部免疫反
应器官甚至系统的损害[8]。研究表明,TNF-α可促进肺
损伤早期肺泡巨噬细胞凋亡,而细胞凋亡反过来促进急
性肺损伤时的炎症反应,可反映机体炎性损伤的程
度[9-12]。IL-8 对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞具有趋化作
用,并可激活中性粒细胞,造成多种炎性递质的释放,在
炎症反应中起着重要作用[8]。本实验结果显示,模型对
照组小鼠肺组织中 TNF-α和 IL-8含量均较正常对照组
明显升高;葎草颗粒各剂量组小鼠肺组织中 TNF-α和
IL-8含量均明显降低,提示葎草颗粒通过降低 TNF-α和
IL-8含量,进而抑制慢性支气管炎的发展。
综上所述,葎草颗粒对慢性支气管炎模型小鼠病
理损伤有明显的修复作用,并且具有镇咳、祛痰作用。
葎草颗粒防治慢性支气管炎的作用机制可能与减轻气
道炎症反应有关。
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·7821·医药导报 2015年 10月第 34卷第 10期