全 文 ：·变应原实验研究·
草花粉变应原研究
孙秀珍　李雅莉　张蕾　李东繁
【摘要】　目的　分析 草花粉变应原成分及变应原性 、免疫原性。方法　制备 草花粉变应原
浸液 ,经十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)分离 ,部分考马斯亮蓝染色 ,其余电转印至硝
酸纤维素薄膜上 ,封闭后将血清 1∶10 稀释与膜条孵育 ,洗涤后分别与辣根过氧化物酶标兔抗人 IgE
单克隆抗体(IgE-HRP)、辣根过氧化物酶标兔抗人 IgG单克隆抗体(IgG-HRP)反应 , 加底物 4-氯-1-萘酚
显色。结果　 草花粉蛋白电泳清晰地显示出 8条区带 , 蛋白分子量依次为 100.5 、76.2、65.0、55.0、
42.0、35.1、28.8 和 23.2 ～ 11.8kD , 免疫印迹可见 5 条 sIgE 反应带 , 蛋白分子量依次为 100.5、76.2、
35.1、28.8 和 8.0kD , 结合病人血清百分比分别是 30.8%、7.7%、3.8%、11.5%和 84.6%;与血清 sIgG
结合的反应带有 5 条 , 蛋白分子量为 100.5 、76.2、49.8、28.8 、8.0kD , 结合病人血清百分比分别是
96.2%、7.7%、7.7%、3.8%和 7.7%。结论　 草花粉变应原含 8 种主要蛋白成分;此外至少还有 2
种含量较低的蛋白成分; 草花粉变应原中分子量 100.5 、 76.2、35.1 、28.8、8.0kD的蛋白具有免疫原
活性 ,可能是哮喘特异性免疫治疗 SIT中诱导封闭抗体产生的成分。
【关键词】　哮喘; 草花粉;变应原;变应原性;免疫原性
Research on humulus pollen allergen for asthma　SUN Xiuzhen , LI Yali , ZHANG Lei , et al.The Second Hos-
pital of Xi an J iao Tong University , Xi an 710004
【Abstract】　Humulus pollen is considered to be a very important allergen in China.In order to analyse
protein components in humulus pollen and evaluate their allergenicity and immunogenicity , crude pollen extracts
was prepared and was separated by SDS-PAGE.The gel was divided into 2 shares , one for visualizing protein
bands stained with Coomassie brilliant blue R250 , the other part was transferred onto nitrocellulose membrane.Af-
ter blocked with milk powder solution , membranes were incubated with the serum sample diluted 1∶10.The strips
were then washed , followed by additional 1 hour incubation with HRP conjugated rabbit anti human IgE、IgG , re-
spectively.4 chloride 1 naphtol was added as substrate.The SDS-PAGE gel stained with Coomassie brilliant blue
R250 illustrated 8 bands clearly , their mol.wts were 100.5 , 76.2 , 65.0 , 55.0 , 42.0 , 35.1 , 28.8 and 23.2～
11.8kD.Immunobloting identified 5 protein bands recognized by sIgE with mol.wts 100.5 , 76.2 , 35.1 , 28.8
and 8.0kD , which combined with 30.8%, 7.7%, 3.8%, 11.5% and 84.6% of asthmatic patients serum , re-
spectively.5 protein bands with mol.wts 100.5 , 76.2 , 49.8 , 28.8 and 8.0kD showed sIgG binding capacity ,
which reacted with 96.2%, 7.7%, 7.7%, 3.8% and 7.7% of asthmatic patients serum.Our results indicate
that humulus pollen includes 8 major protein components and at least 2 minor protein components.Components with
allergenic activity are protein with mol.wts 100.5 , 76.2 , 35.1 , 28.8 and 8.0kD, which can cause immediate
asthma reaction.In addition protein with mol.wts 100.5 , 76.2 , 49.8 , 28.8 , and 8.0kD have immunogenic ac-
tivity , and they can induce production of protective antibodies during specific immunotherapy of asthma.However ,
they may also play a direct role in asthma.
【Key words】　Asthma;Humulus pollen;Allergen;Allergenicity;Immunogenicity
作者单位:710004西安交通大学第二医院呼吸科
　　近几年发现 草花粉是我国一极为重要的吸入
性致敏原 。本文采用 SDS-PAGE分析 草花粉变应
原的蛋白成分 ,并用免疫印迹的方法通过观察 草
花粉过敏性哮喘患者的血清结合模式 ,分析 草花
粉各蛋白成分的变应原性及免疫原性 ,为今后 草
花粉变应原的纯化 、重组打下基础 。
对象和方法
1.研究对象:1998年 6月～ 1999 年 3月我院变
态反应专科门诊 草花粉过敏性哮喘患者 26例 ,其
中男 12 例 ,女 14 例 , 年龄 17 ～ 64 岁(平均 37±13
岁)。哮喘诊断根据全国第二届哮喘会议制定的标
准〔1〕 。 草花粉过敏筛选标准:① 草花粉变应原
皮内试验(ID)≥++;②CAP 系统检测血清 草花
粉特异性 IgE(sIgE)阳性 。
2.主要仪器及试剂
(1)仪器:LXJ-Ⅱ型离心沉淀机(上海医用分析
仪器厂), TGL16台式高速冷冻离心机(湖南仪器总
厂),77.4型磁力恒温搅拌器(江苏省泰县医疗器械
·23·中华微生物学和免疫学杂志 2001年 4月第 21卷增刊　Chin J Microbiol Immunol , April 2001, Vol 21, Suppl
厂),CAP 变应原体外检测系统(瑞典 Pharmacia 公
司),微型垂直电泳仪 、转印仪(美国 Bio-Rad公司)。
(2)试剂:丙烯酰胺(西安化学试剂厂)丙叉双丙
烯酰胺(上海化学试剂厂),标准蛋白(上海丽珠东风
生物技术公司),考马斯亮蓝 R250(Fluka进口),兔抗
人 IgG-HRP 及 IgE-HRP(Dako公司)。
3.方法
(1)血清标本采集及处理:常规静脉取血 3ml ,
室温下凝血 60±100 min , 1 000 ～ 1 350×g 离心 10
min ,将血清移至另一玻璃试管中重复离心 ,最后移
至血清保存管-20℃下保存备用 。
(2) 草花粉变应原浸液的制备:自然脱落法收
集 草花粉 ,9号分样筛过筛 ,室温下乙醚脱脂 。取
脱脂花粉 5g 加 Coca s液 100ml , 4℃下搅拌提取 72
h ,减压过滤 ,上清液以 PBS 液透析 24 h ,自然蒸发浓
缩。
(3)SDS-PAGE:①操作程序: 草花粉变应原
浸液与样品处理液按 1∶1 混合 , 95℃水浴 5 min ,
10 000×g离心5min ,取上清液进行SDS-PAGE ,25mA
恒流电泳 5 h ,完毕后出凝胶 ,切下部分用考马斯亮
蓝染液染色 1 h ,脱色至凝胶背景褪色 ,蛋白区带清
晰为止 。②蛋白分子量计算方法〔1〕:选用分子量已
知的标准蛋白(兔磷酸化酶 B 97.4kD ,牛血清白蛋白
66.2kD ,兔肌动蛋白 43.0kD ,牛磷酸酐酶 31.0kD ,胰
蛋白酶抑制剂 20.0kD ,鸡蛋清溶菌酶 14.0kD)作标
记物 ,与待检样品同一条件下电泳。测量标准蛋白
迁移距离 ,计算迁移率(迁移距离 总距离),以它为
横坐标 ,标准蛋白分子量的对数为纵坐标 ,可得到一
条标准曲线 ,根据待测蛋白的迁移距离 ,从标准线上
可求得其分子量 。
(4)电泳转印:①转印缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤
维素薄膜 ,并将其铺在凝胶上。 ②在凝胶 薄膜外再
包一张 3mm滤纸 ,将凝胶夹在中间 。 ③将滤纸 凝胶
薄膜置于电泳装置中 ,凝胶面向阴极 。 ④将上述装
置放入缓冲液槽中 ,接通电源进行电泳转印。
(5)血清 IB检测:将转印好的硝酸纤维素薄膜
切成 2mm 宽的小条 ,用洗涤液浸泡 3 min ,脱脂奶粉
封闭 15min后加血清样本 ,置摇床上室温过夜 ,洗涤
液洗 5min ,换液 3次 ,然后分别作:①加 1∶500稀释
的兔抗人 IgG-HRP , 室温作用 1 h 后洗涤 ,加底物 5
min后用蒸馏水冲洗终止反应。 ②1∶150稀释的兔抗
人 IgE-HRP ,其余步骤同上 。
结 果
1.SDS-PAGE:草花粉变应原浸液蛋白电泳经
考马斯亮蓝染色清晰地显示出 8 条区带 ,各区带蛋
白分子量依次为 100.5 、76.2 、65.5 、55.0 、42.0 、35.1 、
28.8 、23.2 、11.8kD ,其中23.2 ～ 11.8kD的蛋白带宽
色深 ,含量最丰富(见图 1)。
图 1　 草花粉变应原浸液 SDS-PAGE分析
2.IB检测结果:以兔抗人 IgE-HRP 作为第二抗
体 ,26例病人血清 IB检测均为阳性 ,可见 5条反应
带 ,分子量依次为 100.5 、76.2 、49.8 、28.8 、8.0kD ,分
别与 30.8%、7.7%、3.8%、11.5%和 84.6%的病人
血清 sIgE结合 ,其中分子量 8.0kD的蛋白 SDS-PAGE
未显带(见图 2)。
以兔抗人 IgG-HRP 作为第二抗体 ,26例病人血
清 IB检测均为阳性 ,可见 5条反应带 ,分子量依次
为100.5 、76.2 、49.8 、28.8 、8.0kD ,分别与 96.2%、
7.7%、7.7%、3.8%和 7.7%的病人血清特异性 IgG
(sIgG)结合(见图 3)。
讨 论
近几年我国夏秋花粉调查发现空气中 草花粉
计数仅次于蒿属花粉 , 草花粉变应原 ID≥++者
达76%,血清 sIgE 阳性率达 67%,认为 草花粉是
我国继蒿属花粉又一极为重要的致敏原〔3〕 。该花粉
蛋白成分及其变应原性 、免疫原性等研究工作尚未
开展 。
花粉的主要致敏成分是蛋白 。 草花粉变应原
SDS-PAGE清晰地显示了 8条电泳区带 ,分子量 8.0
及49.8kD蛋白未显带 ,但前者被 sIgE 和 sIgG识别 ,
后者被 sIgG 识别。可见 草花粉变应原至少有 10
种蛋白成份 ,分子量23.2 ～ 11.8kD蛋白占优势。
变应原性是指抗原介导机体产生 IgE型抗体的
·24· 中华微生物学和免疫学杂志 2001年 4月第 21卷增刊　Chin J Microbiol Immunol ,Apri l 2001 ,Vol 21 ,Suppl
图 2　免疫印迹(IgE-HRP)
序号 1～ 26:26例病人血清
图 3　免疫印迹(IgG-HRP)
特性 ,而免疫原性是指抗原介导机体产生 IgG 型抗
体的特性〔4〕 。我们发现 草花粉变应原中分子量
8.0kD的蛋白变应原性强 ,可被 84.6%病人血清 sIgE
识别 ,但其免疫原性很弱 ,仅被 7.7%病人血清 sIgG
识别 ,其可能系 草花粉变应原致速发型哮喘的主
要成分。分子量 76.2 、35.1和 28.8kD的蛋白有较弱
的变应原性 。分子量 100.5kD 的蛋白免疫原性很
强 ,可被96.2%的病人血清 sIgG 所识别 ,变应原性较
弱 ,可被 30.8%病人血清 sIgE识别 ,其可能系哮喘
SIT 中诱导保护性抗体产生的成分 。在哮喘 SIT 中
sIgG具有保护性作用 ,可能与 sIgE竞争结合变应原
而阻滞Ⅰ型变态反应或与 sIgG结合形成免疫复合物
的清除有关。 草花粉中分子量 65.0 、55.0 、42.0和
23.2 ～ 11.8kD的蛋白从哮喘患者血清 sIgE 和 sIgG
结合模式来看 ,既无变应原活性也无免疫原活性 ,与
哮喘的发生及 SIT 关系不大 ,但在其它变态反应性
疾病中的地位如何 ,有待探讨 。
研究 草花粉变应原的变应原性及免疫原性是
纯化粗制 草花粉变应原浸液 、重组抗原 ,从而提高
哮喘特异性诊断 、SIT水平的基础。若进行 草花粉
变应原浸液部分纯化 ,具有变应原活性和 或免疫原
活性分子量为 100.5 、76.2 、49.8 、35.1 、28.8 、8.0kD
的蛋白应予以保留 ,其它无活性成分可弃去。重组
草花粉变应原用于哮喘诊断时 ,分子量 8.0kD的
蛋白应入选;重组变应原用于哮喘 SIT 时 ,分子量
100.5kD的蛋白应入选。变应原性和 或免疫原性较
弱或无的蛋白 ,从理论上讲对哮喘诊治意义不大 ,重
组变应原时可筛除。
参 考 文 献
1　中华结核呼吸病学会.支气管哮喘的定义 、诊断 、治疗 、疗效判断
标准及教育管理方案.中华结核和呼吸杂志 , 1997 , 20(5):26.
2　鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社 , 1995 ,
286.
3　Yin J , et al.An important allergenic pollen in China-humulus.J Allergy
Clin Immunol , 1995 ,95:16.
4　Nakada S.Allergenicity and immunogenic components of house dust mite ,
Dermatophagoides farine.Ann Allergy , 1986 ,56(2):150-155.
(收稿日期:2001-01-02)
·25·中华微生物学和免疫学杂志 2001年 4月第 21卷增刊　Chin J Microbiol Immunol , April 2001, Vol 21, Suppl