全 文 ：响应曲面法优化超声波 - 微波协同
提取葎草总黄酮工艺研究
詹寿发， 黄春燕， 甘金莲， 许明敏， 陈 晔
（九江学院生命科学学院，江西 九江 332000）
摘 要：采用超声波-微波协同萃取法，研究葎草总黄酮的提取工艺。在单因素试验的基础上，选定溶剂浓度、液料比和提取时
间 3 个因素的 3 个水平进行中心组合试验，建立总黄酮提取率的二次回归方程，通过响应面分析得到优化组合条件。 结果表明，
葎草总黄酮提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度 42%、液料比 40∶1、提取时间 22 min，该条件下总黄酮提取率预测值为 3.537%，验证
值为 3.472%。
关键词：葎草； 总黄酮； 响应面法； 超声波-微波协同提取
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2012）18-0126-04
Optimization of ultrasonic-microwave synergy extraction of total flavonoids
from Humulus scandens by response surface methodology
ZHAN Shou-fa, HUANG Chun-yan, GAN Jin-lian, XU Ming-min, CHEN Ye
（College of Life Science, Jiujiang University, Jiujiang 332000, China）
Abstract: The ultrasonic-microwave synergy extraction process of total flavonoids from Humulus scandens was optimized by response
surface methodology (RSM). According to single-factor experiments, three levels of the factors including solvent concentration, liquid/solid
ratio and extraction time were selected for the central composite design to establish a quadric regression equation for predicting the yield
of polysaccharides. By response surface analysis, the optimum extraction conditions were obtained as follows: ethanol concentration of
42%, liquid/solid ratio 40:1 and extraction time 22 min, which led to estimated and observed values of maximal yield of total flavonoids of
3.537% and 3.472%, respectively.
Key words: Humulus scandens； total flavonoids； response surface methodology (RSM)； ultrasonic-microwave synergy extraction
葎草（Humulus scandens）为一年生或多年生蔓性桑科
植物，又名拉拉藤、拉拉蔓、五瓜龙、拉拉秧、过沟龙，长达
数米，生于沟边、路旁、荒地。 葎草在我国大部分地区均有
分布，生长密集，极易采收，具有清热解毒、消肿、利尿功
效，对肺热咳嗽、肺痈、虚热烦渴、热淋、水肿、小便不利、
湿热泻痢、热毒疮疡、皮肤搔痒等有较好疗效 [1-2]。 但目前
对葎草尚未深入开发利用，其具有较大的开发空间。
响应面法是利用合理的试验设计， 采用多元二次回
归方程拟合各因素与响应值之间的函数关系， 通过对回
归方程的分析来寻求最优工艺参数， 是解决多变量问题
的一种统计方法，目前已广泛地应用于农业科学、生物学
及化学等领域 [3-5]。 本研究采用响应曲面法对葎草总黄酮
的提取工艺进行优化， 为今后更好地利用葎草资源提供
参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
野外采集葎草茎叶，洗净后 60℃烘干，粉碎，过 0.25
mm 筛，备用。
试验主要仪器设备有超声-微波协同萃取仪 （CW-
2000， 上海新拓分析仪器有限公司 ）、 电子分析天平
（BSA124S，赛多利斯）、旋转蒸发仪（EV311，北京莱伯泰科
仪器有限公司）、微型高速粉碎机（DYF-300，浙江温岭林
大机械有限公司）、分光光度计（721，天津市普瑞斯仪器有
限公司）等。
1.2 试验方法
1.2.1 葎草黄酮的提取 准确称取干燥葎草茎叶粉末 1.0
g，采用超声-微波协同萃取法（温度为 70℃，微波功率自
动，附加超声波），以乙醇为溶剂，在不同提取条件下（乙醇
浓度、液料比、提取时间）提取黄酮，粗提液经 4 000 r/min
离心 15 min； 上清液用旋转蒸发仪蒸发浓缩至原体积的
10%~20%，用 30 mL 蒸馏水洗涤并转移至锥形瓶，冷藏过
夜，次日趁冷离心除去叶绿素及脂类，得到葎草总黄酮提
取液。
1.2.2 黄酮含量的测定 （1）标准曲线的制备。 精密称取
干燥至恒重的无水芦丁 20 mg， 置 100 mL 容量瓶中，加
60%的乙醇至刻度，摇匀，即得 0.20 mg/mL 的标准液。 精
密吸取标准液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL， 分别置于 25 mL
容量瓶中，加 5%亚硝酸钠溶液 1.0 mL，摇匀，放置 6 min，
加 10.0%的硝酸铝溶液 1.0 mL，摇匀，放置 6 min，加 4%的
氢氧化钠溶液 10.0 mL，用 60%的乙醇稀释至刻度，摇匀，
静置 10 min 后于 510 nm 处测吸光度。 以吸光度值（y）为
纵坐标，芦丁浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，并进行线性
收稿日期：2012-04-11
作者简介：詹寿发（1964-），男，硕士，副教授，E-mail：zhan9630
@126.com
通讯作者：陈晔（1966-），男，硕士，教授，E-mail：chenyejjtc@126.
com
广东农业科学 2012 年第 18 期126
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2012.18.010
4.55
4.50
4.45
4.40
4.35
4.30
4.25
得
率
（ %
）
提取时间（min）
图 3 提取时间对葎草总黄酮得率的影响
0 10 20 30 40 50
X3（提取时
间，min）
10
20
30
X2（液料比，
mL/g）
20∶1
30∶1
40∶1
X1（乙醇浓
度，%）
30
40
50
水平
-1
0
1
表 1 响应面试验方案设计因素和水平
因素
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
0 10 20 30 40 50 60 70
得
率
（ %
）
乙醇浓度（%）
图 1 乙醇浓度对葎草总黄酮得率的影响
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
0 10 20 30 40
得
率
（ %
）
液料比
图 2 液料比对葎草总黄酮得率的影响
回归，得回归方程：y=2.8396x-0.0196，R2=0.9992。
（2）样品总黄酮含量的测定。 将不同提取条件下得到
的样品黄酮提取液定容至 50 mL，取 4 mL 样品液，用制作
标准曲线相同的方法测定样品液的吸光度， 经回归方程
换算后计算黄酮得率：
总黄酮得率（%）=（样品液中黄酮含量/样品粉末量）×100
1.2.3 试验设计 （1）单因素试验。以乙醇为提取液，在固
定提取温度为 70℃的条件下， 分别以乙醇浓度 （30%、
40%、50%、60%、70%）、液料比（20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）
及提取时间（10、20、30、40、50 min）作为单因素，考察各因
素对葎草总黄酮得率的影响。
（2）响应面法试验。在单因素试验结果的基础上，根据
中心组合试验设计原理，以乙醇浓度、液料比、提取时间作
为自变量， 以所得总黄酮得率为响应值 ， 采用 Design
expert 8 软件设计试验方案并对试验数据进行回归分析，
通过最小二乘法拟合建立模型方程：
Y＝A0＋∑AiXi＋∑AijXiXj＋∑AiiXi2
式中，Y为总黄酮得率，A0为常数项，Ai为线性系数，Aii为
二次项系数，Aij为交互项系数，Xi、Xj为自变量编码值。 多
项式模拟方程的性质由 R2表达， 统计学上的显著性由 F
值检验， 并分析预测葎草黄酮的最佳提取条件以及最大
提取率。 中心组合试验方案设计因素和水平取值见表 1。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇浓度对葎草总黄酮得率的影响 在温度
70℃、液料比 30∶1、提取时间 10 min 的条件下，分别用不
同体积分数的乙醇为溶剂提取葎草总黄酮。 乙醇浓度对
葎草总黄酮得率的影响如图 1所示。 当乙醇浓度为 30%~
40%时， 葎草总黄酮的得率随乙醇浓度的增大而增大，当
乙醇浓度为 40%时总黄酮得率达到最大值， 之后随着乙
醇浓度的升高，总黄酮得率降低。 故选择乙醇浓度 40%为
最佳溶剂浓度。
2.1.2 液料比对葎草总黄酮得率的影响 以 40%乙醇为
提取溶剂，在温度 70℃、提取时间 10 min 的条件下，考察
液料比对葎草总黄酮得率的影响，结果如图 2所示。 随着
液料比的提高，黄酮得率增大，但液料比达到 30∶1 后，随
着液料比的增大，总黄酮得率提高不明显。 故选择液料比
为 30∶1。
2.1.3 提取时间对葎草总黄酮得率的影响 在乙醇浓度
40%、液料比 30∶1、温度 70℃的条件下，考察提取时间对葎
草总黄酮得率的影响， 结果如图 3 所示。 在提取时间为
20 min 时黄酮得率达到最高值， 之后总黄酮得率逐渐下
降。 故取 20 min为最佳提取时间。
2.2 响应面法试验
2.2.1 模型的建立及显著性检验 在单因素试验的基础
上，以乙醇浓度、液料比、提取时间为自变量（Xi），黄酮得
率（Y）为响应值，采用中心试验设计试验方案，并对试验
结果进行分析。 试验方案及结果见表 2，方差分析结果见
表 3。
利用 Design expert 8 软件对数据进行二次多元回归
拟合， 得到葎草总黄酮提取率 （Y） 对自变量乙醇浓度
（X1）、液料比 （X2）、提取时间 （X3）的二次多项回归方程
为：
Y=3.43+0.17X1+0.17X2+0.010X3-0.087X1X2+0.046X1X3+
0.039X2X3-0.24X12-0.070X22-0.13X32
127
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
30
25
20
15
10 20
25
30
35
40
X3：提取时间（min） X
2：液
料比
总黄酮得率（%）
30
25
20
15
10
X 3
：提
取
时
间
（ m
in
）
20 25 30 35 40
X2：液料比图 4 提取时间和液料比对总黄酮得率的影响
总
黄
酮
得
率
（ %
）
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
20
25
30
35
40
30
35
40
45
50
X1：乙
醇浓
度（%
）X2：液料比
40
35
30
25
20
总黄酮得率（%）
X 2
：液
料
比
X1：乙醇浓度（%）
30 35 40 45 50
图 5 液料比和乙醇浓度对总黄酮得率的影响
总
黄
酮
得
率
（ %
）
显著性
**
**
**
**
**
P值
0.0004
0.0009
0.0012
0.7899
0.1055
0.3710
0.4445
<0.0001
0.0828
0.0051
0.254
F值
10.87
21.60
20.02
0.075
3.17
0.88
0.63
41.74
3.71
12.76
1.87
均方
0.2100
0.4100
0.3800
0.0014
0.0610
0.0170
0.0120
0.8000
0.0710
0.2400
0.0190
0.0360
0.0020
自由度
9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
10
5
5
19
平方和
1.8800
0.4100
0.3800
0.0014
0.0610
0.0170
0.0120
0.8000
0.0710
0.2400
0.1900
0.1800
0.0100
2.07
方差来源
模型
X1（乙醇浓度）
X2（液料比）
X3（提取时间）
X1X2
X1X3
X2X3
X12
X22
X32
残差
失拟项
纯误差
总误差
表 3 响应面试验设计结果的方差分析
注：R2=0.9073，调整 R2=0.8238。
Y（总黄酮
得率，%）
2.46514
3.07041
2.96954
3.20798
2.35509
3.12544
2.99705
3.43725
2.71275
2.90534
3.07041
3.48311
3.12544
3.08876
3.36388
3.43725
3.49228
3.41891
3.38223
3.43989
X3（提取时
间，min）
-1
-1
-1
-1
1
1
1
1
0
0
0
0
-α
α
0
0
0
0
0
0
X2（液料比，
mL/g）
-1
-1
1
1
-1
-1
1
1
0
0
-α
α
0
0
0
0
0
0
0
0
X1（乙醇浓
度，%）
-1
1
-1
1
-1
1
-1
1
-α
α
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
表 2 响应面分析方案及试验结果
注：α=1.68。
从表 3的回归模型方差分析可以看出，该模型达到极
显著水平（P<0.01），R2=0.9073、R2adj=0.8238，失拟项不显著
（P=0.2540>0.05），说明回归方程拟合度和可信度高，误差
较小。 因此可用该模型对葎草总黄酮提取进行分析和预
测。
2.2.2 响应面分析 根据回归分析的结果，作出模型的响
应曲面图，结果见图 4~图 6。 根据二次模型所得到的等高
线及响应曲面可以评价试验因素之间的交互作用强度，
以及确定各因素的最佳水平范围。
128
由图 4 可知， 在乙醇浓度不变的条件下 , 提取时间
在 10~20 min 范围内时， 葎草总黄酮提取得率逐渐增
加，并在 20 min 附近达到极大值而后缓慢降低，同时随
液料比的提高，葎草总黄酮提取率显著提高，当液料比
达到 35∶1 以后，总黄酮提取率的提高幅度逐渐降低。 由
图 5 可知，在提取时间不变的情况下，随液料比和乙醇
浓度的增加，葎草总黄酮提取率显著提高，曲面呈现陡
峭上升，之后上升趋势减缓，说明液料比和乙醇浓度在
较低的水平时对葎草黄酮提取率的影响大于较高水平
下的影响。由图 6 可知，在液料比不变的情况下，葎草黄
酮提取率随乙醇浓度的增加而提高， 当乙醇浓度达到
45%以后，黄酮提取率表现出下降的趋势。 同时，从响应
曲面和等高线所反映的结果可以看出，液料比和乙醇浓
度对葎草总黄酮提取率的影响较大，各因素交互作用大
小排序是： 液料比和乙醇浓度>液料比和提取时间>乙
醇浓度和提取时间。
2.2.3 最优提取条件的确定 对回归方程求导，并令其
等于零，可以得到曲面的最大点，即 3 个主要因素的最
佳水平值， 转换后得到提取的最佳条件为： 乙醇浓度
42.1%、液料比 40∶1、提取时间 22.3 min，总黄酮最大得
率为 3.537%。 考虑到实际操作的便利，最终确定优化提
取工艺条件为 ：乙醇浓度 42%，液料比 40 ∶1，提取时间
22 min。 采用上述工艺条件进行总黄酮提取试验，以进
一步验证该试验方法的可靠性。 重复试验 5 次，测得葎
草总黄酮实际得率为 3.472%， 验证试验结果与理论预
测值误差在 2%以内。 因此， 采用响应面分析方法优化
得到的葎草黄酮最佳提取工艺条件具有实际意义与应
用价值。
3 结语
超声波-微波协同萃取法具有溶剂用量少、提取速度
快、提取率高且不易造成物质结构破坏等优点，已广泛应
用于生物活性物质的提取。 本试验利用超声波-微波协
同萃取技术， 运用响应面分析法优化葎草总黄酮的提取
工艺， 对提高葎草资源的综合利用率和利用价值具有较
大的现实意义。 本研究得到超声波-微波协同萃取葎草
总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度 42%、液料比 40∶1、
提取时间 22 min， 此条件下葎草总黄酮实际得率为
3.472%。
参考文献：
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黄酮的工艺[J].浙江农业学报,2010,22(4):521-526.
总
黄
酮
得
率
（ %
）
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
30
25
20
15
10
X
3：提取时间（min）
30
35
40
45
50
X1：乙
醇浓
度（%
）
30
25
20
15
10
X 3
：提
取
时
间
（ m
in
）
X1：乙醇浓度（%）
30 35 40 45 50
图 6 提取时间和乙醇浓度对总黄酮得率的影响
总黄酮得率（%）
129