全 文 ：doi:10.3969/ j.issn.1005-8141.2013.05.004
草及生姜对细菌性腹泻的抑菌研究
陆 波 ,李玲玉 ,刘丹楹 ,褚福龙 ,张崇禧
(山东大学(威海)海洋学院 ,山东威海 264209)
摘要:通过利用农村治病的偏方 , 探究 草 、生姜和 草生姜药对引起细菌性腹泻常见的细菌性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的
抑制作用 ,采用滤纸片法和小鼠腹泻模型来确定抑菌效果与最低抑菌浓度(MIC)。实验结果表明 , 草 、生姜有一定的抑菌效果 ,
草生姜药的抑菌效果较好。该实验结果可为治疗细菌性腹泻提供指导 , 有一定的实际意义。
关键词: 草;生姜;抑菌;细菌性腹泻;小鼠腹泻模型
中图分类号:R915 文献标志码:A 文章编号:1005-8141(2013)05-0461-03
Research on Humulus scandens and Rhizoma Zingiberis Recens for Treatment of Bacterial Diarrhea
LU Bo , LI Ling-yu , LIU Dan-ying , CHU Fu-long , ZHANG Chong-xi
(Marine College , Shandong University at Weihai ,Weihai 264209 , China)
Abstract:Through the use of the folk prescription , this paper explored the Humulus scandens , Rhizoma Zingiberis Recens and Humulus scandens
Rhizoma Zingiberis Recens drugs on the inhibition of bacterial diarrhea caused by common bacteria E.coli and staphylococcus aureus.By filter paper
method and diarrhea in mice model , the authors determined the antibacterial effects and the minimum inhibitory concentration(MIC).The experimen-
tal results showed that the Humulus scandens or the Rhizoma Zingiberis Recens had antibacterial effect.And the effect of Humulus scandens Rhizoma
Zingiberis Recens drugs was better.The experimental results could provide a guide for the treatment of the bacterial diarrhea with practical signifi-
cance.
Key words:Humulus scandens(Lour.)Merr;Zingiber officinale Roscoe;antibacterial;bacterial diarrhea;diarrhea model in mice.
收稿日期:2013-03-15;修订日期:2013-04-26
基金项目:山东大学(威海)科技立项项目(编号:SRTPA12040)。
第一作者简介:陆波(1991-),男 , 山东省平邑人 , 本科 ,研究方向
为天然药物品质评价。
通讯作者:张崇禧(1954-),男 ,吉林省长春人 ,博士 ,教授 ,硕士生
导师 ,执业药师 ,研究方向为药用动植物功能食品开发利用及新药研
究 、天然药物品质评价和质量标准制定。
草为桑科植物 草(Humulus scandens(Lour.)
Merr)的全草 ,一年生或多年生草本植物 ,别名很多 ,主
要有拉拉秧 、拉拉藤 、锯子草 、五爪龙 、降龙草等 ,始载
于《唐本草》[ 1] 。 草生命力顽强 、资源丰富 ,广泛分布
于全国(除青海 、新疆以外)各地区[ 2] ,日本 、朝鲜 、北美
洲等也有分布。 草具有清热解毒 、利尿消肿等功效 ,
可用于治疗肺结核潮热 、胃肠炎 、痢疾 、淋证 、痔疮 、小
便不利 、皮肤瘙痒等证。据报道 , 草全草含青兰苷 、
天门冬素 、挥发油 、鞣质和树脂; 草叶含木犀草素葡
萄糖苷 、大波斯菊苷 、牡荆素等黄酮类成分[ 3 ,4] 。在研
究 草提取物的抗菌作用时发现 ,其水提取液对革兰
阳性菌具有较强的抗菌活性 ,并证实抗菌作用与 草
所含的黄酮类成分有关。据已有的报道 ,不同月份的
草含有黄酮的量不同 ,本实验采用 9月份黄酮含量
最高的 草进行提取[ 5 , 6] 。
生姜(Zingiber officinale Roscoe)又名“姜” ,属姜科
(Zingiberaceae)多年生草本宿根植物 ,其根茎肥厚 ,具
有芳香和辛辣味 ,是最常用的香辛料之一[ 7] ,亚洲 、非
洲 、拉丁美洲等地均有种植 。我国是世界上最大的生
姜出口国之一 ,生姜在南方的广东 、浙江栽培较普遍 ,
其次是江西 、安徽 、四川 、云南 、湖南 、湖北等 ,北方则以
山东为主要产地 ,以及河南 、陕西等[ 8] 。生姜的化学组
分复杂 ,主要有挥发油 、姜辣素 、姜油酮 、姜烯酚 、姜醇 、
水茴香烯 、龙脑 、桉精油 、二苯基庚烷 、黄酮类化合物
等[ 9] 。
本实验通过对 草 、生姜和 草生姜药对引起细
菌性腹泻的抑菌活性进行了研究 ,并确定了 草 、生姜
和 草生姜药对抑菌的最低抑菌浓度 , 草生姜药对
抑菌的最佳浓度配比等 ,为细菌性腹泻的治疗提供了
科学依据 。
1 实验材料与器材
1.1 实验材料
草采自山东大学(威海)校园 ,经韩晓弟副教授
鉴定为桑科 草属 草;生姜买自威海市利群购物广
场;大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌
(Staphyloccocus aureus Rosenbach)均由山东大学(威海)
海洋学院提供;小白鼠(18—22g ,购自绿叶制药厂);乙
醇 、牛肉膏 、蛋白胨 、琼脂 、氯化钠等均为国产分析纯。
1.2 实验仪器
电热鼓风干燥箱(杭州汇尔仪器设备有限公司)、
·461·
资源开发与市场 Resource Development &Market 2013 29(5) ·实验与技术·
分析天平(上海楚柏实验室设备有限公司)、SWB 5200
型超声清洗机(上海必能信超声有限公司)、RE-52AA
旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、DK-8AD电热恒
温水槽(上海精密仪器仪表有限公司)、高压蒸汽灭菌
锅(上海博迅实业有限公司)、超净工作台(上海精密仪
器仪表有限公司)、电热恒温培养箱(上海精密仪器仪
表有限公司)。
2 实验方法
2.1 供试样品液的制备
精确称取干燥且经粉碎的 草 10g ,在 80℃下在
280mL 72%的乙醇中提取 1.2h ,回流提取 2次 ,过滤 ,
合并提取液 ,回收乙醇 ,浓缩至 10mL;采用同种方法提
取生姜的提取液;再分别按照 草∶生姜 3∶7 、4∶6 、1∶1 、
6∶4 、7∶3的比例提取 草生姜药的提取液。
2.2 培养基的制备
牛肉膏蛋白胨培养基[ 10] :牛肉膏 3g、蛋白胨 10g 、
氯化钠5g 、蒸馏水 1000mL、琼脂 20g 、水 1000mL , pH 值
7.0 —7.2。
2.3 供菌悬液的制备
将供试菌种接种在相应的试管斜面培养基上 ,
37℃恒温箱中培养 18 —24h ,活化 2—3代 。用接种环
分别挑取少量活化后的菌体置入装有无菌生理盐水的
试管内 ,震荡均匀 ,制成菌悬液。调整菌悬液的浓度 ,
用平板菌落计数法测定其菌液浓度 ,并用生理盐水将
菌液稀释至105 —106cfu/mL。
2.4 抑菌圈的测定
中草药提取物液抑菌圈的测定采用滤纸片法 。在
超净工作台上按无菌操作方式在无菌培养皿中倒入适
量培养基 ,待培养基凝固后用无菌移液管吸取 0.1mL
菌悬液在相应的营养平板上 ,用无菌涂布棒将菌悬液
涂布均匀。然后 ,按照无菌操作方式取出各溶液浸泡
后的滤纸片(直径6mm),尽量使乙醇挥发完全 ,按培养
皿的标号将滤纸片放入培养基表面相应的位置 ,每个
培养皿等距放 3个滤纸片 ,每个浓度做 3组平行实验 ,
并用无菌生理盐水做空白对照 ,再放入恒温培养箱
37℃下倒置培养 24h ,24h后取出测定滤纸片抑菌圈直
径大小 ,比较抑菌效果。
2.5 最小抑菌浓度的测定
采用平板划线法测定最小抑菌浓度(Mininum In-
hibitory Concentration ,MIC)。将生姜 、 草 、 草药按照
2倍稀释法配制成 0.2mg/mL 、0.39mg/mL、0.78mg/mL 、
1.56mg/mL、 3.13mg/mL 、6.25mg/mL 、 12.5mg/mL、
25mg/mL 、50mg/mL 、100mg/mL 的稀释液;再加入培养
基中混合均匀 ,静置 ,待凝固后制成含有待测浓度供试
样品的平板。然后 ,在培养皿上划线接种 ,每组做 3个
平行 ,并用无菌生理盐水做空白对照 ,放入恒温培养箱
中于 37℃倒置培养 24h ,观察无菌生长的最低浓度为
药物的最小抑菌浓度(MIC)。
2.6 小鼠腹泻实验
选用健康小鼠 60 只 ,随机分组 ,每组 10只;分别
设空白组 、模型组 、 草提取液组 、生姜提取液组 、 草
生姜药对提取液组 、阳性对照组 ,模型组 、 草提取液
组 、生姜提取液组 、 草生姜药对提取液组 、阳性对照
组。然后 , 在小鼠腹腔内注射大肠杆菌菌悬液
(0.3mL/ l0g),造成严重腹泻模型 ,空白组小鼠腹腔注
射等量生理盐水;3h后空白组和模型组小鼠灌胃生理
盐水(0.1mL/l0g); 草提取液组 、生姜提取液组 、 草
生姜药 、提取液组小鼠分别灌胃 草提取液 、生姜提取
液 、 草和生姜混合提取液 ,阳性对照组灌胃市售止泻
药止痢宁水悬液 ,观察腹腔注射大肠杆菌注射液 3h内
的小鼠腹泻情况以及给药后 3h内模型组和治疗组小
鼠的腹泻情况(包括稀便次数 、总便次数 、稀便级),并
计算出腹泻指数[ 11] 。
3 结果及分析
3.1 抑菌效力的测定
采用滤纸片扩散法研究 草 、生姜 、 草生姜药对
大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌的抑制效果 ,以抑菌圈直径
大小为指标 。由表 1和图 1可见 , 草对大肠杆菌及
金黄色葡萄球菌都有一定的抑制作用 ,且 草提取液
的浓度越大 ,对细菌的抑制作用越强; 草提取液对金
黄色葡萄球菌的抑制作用比对大肠杆菌的抑制作用更
强。
图 1 草抑菌抑菌圈平均直径柱状图
由表 2和图 2可见 ,生姜对大肠杆菌和金黄色葡
萄球菌都有一定的抑制作用 ,且生姜提取液的浓度越
大 ,对细菌的抑制作用越强;生姜提取液对金黄色葡萄
球菌的抑制作用比对大肠杆菌的抑制作用弱 。
由表 3和图3可见 , 草和生姜的浓度配比为4∶6
时 ,对大肠杆菌的抑制效果最好;当 草和生姜浓度配
比为 6∶4时 ,对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好。由
·462·
·实验与技术· 资源开发与市场 Resource Development &Market 2013 29(5)
表1—3和图 1—3可得出以下结论 , 草生姜药的抑
菌效果比 草和生姜单种药材的抑菌效果好 ,且 草
提取液对金黄色葡萄球菌的抑制作用比对大肠杆菌的
抑制作用强 ,生姜提取液对大肠杆菌的抑制作用比对
金黄色葡萄球菌的抑制作用强 。
表 1 草抑菌抑菌圈平均直径(mm)
草浓度(mg/mL) 供试菌种大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
0 — —
0.2 6.06 6.11
0.39 6.14 6.24
0.78 6.20 6.29
1.56 6.22 6.38
3.13 6.41 6.50
6.25 6.43 6.73
12.5 6.71 7.13
25 7.11 8.25
50 8.31 8.96
100 9.04 9.78
注:—表示无抑菌圈。
表 2 生姜抑菌抑菌圈平均直径(mm)
生姜浓度(mg/mL) 供试菌种大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
0 — —
0.2 6.28 6.19
0.39 6.47 6.27
0.78 6.52 6.44
1.56 6.69 6.57
3.13 7.20 6.76
6.25 7.99 7.11
12.5 8.38 7.82
25 9.10 8.02
50 10.26 9.25
100 11.18 10.78
注:—表示无抑菌圈。
图 2 生姜抑菌抑菌圈平均直径柱状图
表 3 不同浓度配比的 草生姜药对抑菌圈平均直径(mm)
草∶生姜 供试菌种大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
0 — —
3∶7 14.05 11.20
4∶6 15.04 11.67
1∶1 13.29 12.98
6∶4 12.59 14.39
7∶3 11.58 12.71
注:—表示无抑菌圈。
草∶生姜
图 3 不同浓度配比的 草生姜药对抑菌圈平均直径柱状图
3.2 最低抑菌浓度的确定
由表 4可得出以下结论 , 草提取液对大肠杆菌
的最低抑菌浓度(MIC)为 50mg/mL ,对金黄色葡萄球
菌的最低抑菌浓度(MIC)为 25mg/mL。由表5可见 ,生
姜提取液对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为 25mg/
mL ,对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为
50mg/mL。
表 4 草提取液的最低抑菌浓度(MIC)
草浓度(mg/mL) 供试菌种大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
0 - -
0.2 - -
0.39 - -
0.78 - -
1.56 - -
3.13 - -
6.25 - -
12.5 - -
25 + -
50 + +
100 + +
注:+表示有菌落生长 , -表示无菌落生长。
表 5 生姜提取液的最低抑菌浓度(MIC)
生姜浓度(mg/mL) 供试菌种大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
0 - -
0.2 - -
0.39 - -
0.78 - -
1.56 - -
3.13 - -
6.25 - -
12.5 - -
25 - +
50 + +
100 + +
3.3 小鼠腹泻实验结果
实验中 ,腹泻率为一组动物中排稀便的动物数与
该组动物总数的百分比;稀便率为每只动物所排的稀
便次数与总便次数之比;稀便级表示稀便的程度 ,以稀
便污染滤纸形成污迹面积的大小定级。统计时先逐个
(下转第 471页)
·463·
资源开发与市场 Resource Development &Market 2013 29(5) ·实验与技术·
茵陈挥发油成分 ,并进行抗氧化活性试验目前尚属首
例。利用水蒸气蒸馏法提取茵陈中的挥发油方法简
单 、方便 ,所用设备廉价易得 , DPPH·法和·OH 法更是
国际上认可的研究抗氧化活性的经典方法。
茵陈挥发油的组分种类复杂多样 ,主要以单萜和
倍半萜类为主 ,以酸 、醇 、烯类物质居多 。其中 ,棕榈酸
(33.1%)、氧化石竹烯(19.1%)和匙叶桉油烯醇
(9.9%)三种成分所占比重高达 62.1%, 为茵陈挥发
油中的最主要成分 。虽然在相同浓度下 ,相对于维生
素C ,茵陈挥发油消除 DPPH·的能力还有差距 ,但茵陈
挥发油使用的是生药浓度 ,而维生素 C 是一种单体 ,
两者存在巨大的纯度差异 。此外 ,在清除 OH·自由基
的试验中 ,当挥发油浓度较高时 ,其清除OH·自由基的
能力略高于维生素 C ,说明茵陈挥发油具有较强的消
除自由基的能力 。茵陈挥发油具有较强的清除自由基
的能力 ,将为下一步研究提供数据支持 。
参考文献:
[ 1] 袁伟彬 ,吴启端.枳实挥发油化学成分的 GC -MS 分析[ J] .中药材 ,
2011, 34(7)∶1067-1069.
[ 2] 蔡仲军 ,陈仕江 ,尹定华 ,等.不同产地冬虫夏草清除羟自由基作用
的研究[ J] .中草药 ,2003 , 35(1)∶58.
[ 3] 邓大贵 ,叶青 ,叶红德 ,等.DPPH·法评价 VC 、异 VC及其衍生物的抗
氧化性能[ J] .食品工业科学 , 2008 , 29(4)∶114.
[ 4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[ M] .北京:化学工业出版社 ,
2005∶(附录)57-58.
[ 5] Sharif M Al-Reza , Atiqur Rahman, M A Sattar , et al.Essential Oil Compo-
sition and Antioxidant Activities of Curcuma Aromatica Salisb[ J] .Food and
Chemical Toxicology , 2010 ,(48)∶1757-1760.
[ 6] Kang Raphael ,Helms Randi , Stout Michael J , et al.Antimicrobial Activity of
the Volatile Constituents of Peri lla Frutescens and Its Synergistic Effects with
Polygodial[ J] .J Agri Food Chem , 1992, 40(11)∶2328.
[ 7]Mustafa K , Bektas T C.Composition , Antioxidant andAntimicrobial Properties
of the Essential Oils of Three Salvia Species from Turkish Flora[ J] .Biore-
source Technology ,2008 ,(99)∶4096-4104.
[ 8] 天津市药品检验药物研究所药检室.茵陈蒿挥发油对大白鼠的急性
利胆试验[ J] .天津医药 , 1976 ,(6)∶287.
[ 9] 四川省中药研究所.茵陈挥发油治疗浅层霉菌病的初步报告[ J] .
1976 ,(5)∶65-68.
[ 10] 丛浦珠 ,李笋玉.天然有机质谱学[M] .北京:中国医药科技出版社 ,
2001∶783-1107.
[ 11] 杨书斌,关家锐.茵陈蒿挥发油成分研究[ J] .中草药 ,1996 , 2(5)∶269
-270.
[ 12] 陈建平,苏健裕.梅片树叶挥发油的抗氧化活性研究[ J] .食品工业
科学 ,2012 , 33(5)∶149-151.
(上接第 463页)
统计每一堆稀便的级数 ,然后将该鼠所有稀便级数相
加除以稀便次数得稀便的平均级数;腹泻指数=稀便
率×稀便级。小鼠一般状态与行为的改变表现为腹腔
注射大肠杆菌菌悬液 1h后出现不同程度的腹泻 、便次
增多 、便质稀软 ,到第 3小时时腹泻情况明显加剧 ,部
分小鼠呈明显的倦怠乏力 ,精神萎靡 ,稀水样便(表 5 、
表6)。药物治疗后 ,给药各组的小鼠腹泻症状明显改
善 ,表现为大便数减少 ,便质由稀转干 ,精神状态渐好 ,
饮食恢复 ,情绪稍好 。
表 6 污染直径与稀便级数对照
级数 1 2 3 4
污染直径(cm) <1 1—1.9 2—3 >3
表 7 药材提取液对大肠杆菌所致小鼠腹泻指数的比较(x±s)
组别 腹泻率 稀便率 稀便级 腹泻指数
空白对照组 0 0.009 1 0.009±0.0087■
模型组 1 0.415 4 1.66±0.022＊
草组 0.43 0.226 2 0.452±0.017＊
生姜组 0.39 0.218 2 0.436±0.023＊
草生姜药对组 0.17 0.09 1 0.09±0.021＊
阳性对照组 0.45 0.224 2 0.448±0.025＊
注:模型组与空白组的组间比较:■P<0.05;治疗组与模型组的组
间比较:＊ P<0.05 ,应用 SPSSll.0统计软件做数据处理 ,所有数据采用
x±s表示 ,采用 t 检验 ,P<0.05为有统计学意义。
由统计数据可见 , 草及生姜提取液对治疗小鼠
的腹泻均有一定的作用 ,且与市场上常用的止痢药效
果相当; 草生姜药对治疗小鼠的腹泻有较好的作用 ,
且要比市场上常用的止痢药效果好 。
参考文献:
[ 1] 候宽昭.中国种子植物科属词典[M] .北京:科学出版社 , 1984∶238.
[ 2] 王桃云 ,马红昌 ,刘江颖. 草叶蛋白提取工艺的优化[ J] .苏州科技
学院学报 , 2005 ,(3)∶59-64.
[ 3] 尹海波 ,王颖 ,郑太坤 ,等.中国 草属植物的研究进展[ J] .辽宁中医
学院学报 , 2001 , 3(1)∶63-64.
[ 4] 李俊婕 ,王晓静 ,付义成. 草化学成分的研究[ J] .食品与药学 ,
2008 , 10(5)∶5-6.
[ 5] 邹素华 ,刘太宇. 草不同生长月份营养成分及总黄酮含量的动态
变化[ J] .中国畜牧兽医 , 2010 ,37(5)∶21-24.
[ 6] 陈伟光 ,盛静. 草叶总黄酮的测定及最佳采收期研究[ J] .中草药 ,
2008, 39(1)∶120-122.
[ 7] 谭仁祥.植物成分功能[M] .北京:科学出版社 , 2003.
[ 8] 曹守山.适宜生姜生长的中温带区域范围分析[ J] .河北农业科技 ,
2008,(2)∶52-54.
[ 9] 赵德婉.生姜优质丰产栽培原理与技术[ M] .北京:中国农业出版社 ,
2002∶10-30.
[ 10] 沈萍 ,陈向东.微生物学实验(第 4版)[M] .北京:高等教育出版社 ,
2007∶241.
[ 11]王国芳 ,韩海荣 ,聂尚丹.大蒜水提物对小鼠腹泻治疗作用的实验
研究[ J] .济宁医学院学报 , 2009 , 32(4)∶244-245.
·471·
资源开发与市场 Resource Development &Market 2013 29(5) ·实验与技术·