全 文 ：亮菌多糖-1b清除自由基作用研究
马金宝， 沈业寿 *， 李 峰， 史新强， 赵根海， 解要敏
（安徽大学生命科学学院生化微生物研究所 安徽省生态工程与生物技术重点实验室， 安徽 合肥 230039）
摘要： 采用邻苯三酚自氧化法、Fenton反应体系法、DPPH体系法，以抗坏血酸为阳性对照，对亮菌多糖-1b（ATPS-
1b） 清除超氧阴离子自由基（O2-·）、羟自由基（·OH） 和二苯代苦味肼基自由基（DPPH·） 的效果进行了测定。结果表
明 ATPS-1b对 O2-·、·OH和 DPPH·3种自由基均具有很强的清除作用，且存在良好的量效关系，随着 ATPS-1b浓度的增
大，其清除效果增强；清除 O2-·、·OH、DPPH·3种自由基的 EC50值分别为 0.69 mg·mL-1、8.73 mg·mL-1、2.01 mg·mL-1；
对 3种自由基的最大清除率分别为 86.17%、76.4%、78.52%；ATPS-1b具有显著的体外抗氧化活性。
关键词： 亮菌；多糖；超氧阴离子自由基；羟自由基；二苯代苦味肼基自由基；抗氧化活性
中图分类号： S646.9 文献标识码： A 文章编号： 1003-8310 （2008） 06-0038-03
自由基 (Free Radical) 是独立存在的带有未成对电子
的原子或基团， 可与生物体内的许多物质如脂肪酸、 蛋白
质等作用， 夺取它们的氢原子， 造成相关细胞结构与功能
的破坏， 更重要的是其氧化产物和中间产物会伤害生物
膜、 酶、 维生素、 蛋白质及活细胞， 其中一些还被认为是
致癌物质[1]。许多慢性疾病如癌症和心脏病的病理都与细胞
部件的抗氧化损伤有关 。 活性氧 （ROS） 不仅能损伤
DNA， 而且与癌症、 冠心病和许多与年龄增长有关的健康
问题有密切关系 [2]。因此， 通过发酵微生物的方法， 研制和
开发天然的清除自由基和抗氧化的食品或保健品， 以有效
预防相关疾病的发生、 发展， 对延缓老化和增进健康有着
重要的意义。
亮菌 （Armillariella tabescens） 属白蘑科小蜜环菌 (假
蜜环菌) 属真菌， 食药兼用。 多糖是生物体内普遍存在的
一大类生物大分子， 除有营养作用之外， 还具有特殊的生
物活性和药理特性。 多糖主要应用于食品和药品行业， 除
此之外还大量应用于工业废水处理、 清洁用品、 纺织上
浆、 造纸、 印刷工业及钻井、 选矿、 炸药工业等领域。 国
内外对亮菌多糖的研究在于治疗肝炎、 防辐射、 升白、 抑
瘤和调节免疫等方面 [3，4]，而对亮菌多糖体外清除自由基的
抗氧化作用还未见报道。 本文对亮菌多糖体外清除 O2-·、
·OH 和 DPPH·自由基的作用进行研究， 以期为开发具有
抗氧化活性的保健食品和药品提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 样品、 仪器与试剂
1.1.1 样品
亮菌多糖-1b （ATPS-1b）： 由安徽大学糖复合物与糖
工程实验室提供。 经固态发酵培养、 水提醇沉法提取和柱
层析纯化制得。
1.1.2 仪器
LRH-250A 生化培养箱， 广东省医疗器械厂产品； 净
化工作台， ESCO 公司产品； DK-8D 型电热恒温水浴槽，
上海精宏实验设备有限公司产品； 循环水式真空泵， 郑州
长城科工贸有限公司产品； 旋转蒸发仪， 上海亚荣生化仪
器厂产品； BS224S 电子天平， 北京赛多利斯仪器有限公
司产品； TL-16R 台式高速冷冻离心机， 上海市离心机械
研究所产品； ALphaL-2 冷冻干燥机， 德国 Christ 公司产
品； UV-9200紫外分光光度计， 北京瑞利分析仪器公司产
品； TES-1380数字式酸度 (pH) 计， 江苏省金坛市宏华仪
器厂产品。
1.1.3 试剂
DPPH、 TRIS， Sigma 公司产品； 邻苯三酚， 国药集团
化学试剂有限公司产品， 批号： F20060918； 水杨酸， 上
海试剂一厂产品； H2O2， 中外合资上海远大过氧化物有限
公司产品， 批号： 200311101； 抗坏血酸 (Vc)， 广东汕头
西陇化工厂产品， 批号： 0603271。 其它试剂均为分析纯
试剂。
1.2 试验方法
1.2.1 ATPS-1b对超氧阴离子自由基的清除作用
（1） 邻苯三酚自氧化率的测定
根据文献 [5] 和 [6] 方法加以改进， 在 10 mL 具塞试
管中加入 4.5 mL Tris-HCl 缓冲液 （50 mmo1·L-1， pH 8.2）
和 4.2 mL 蒸馏水。 混匀后在 25℃水浴中保温 20 min， 取
出后立即加入 25℃预热过的 3 mmo1·L-1 邻苯三酚 0.3 mL
(以 10 mmo1·L-1HCl配制， 空白管用 10 mmol·L-1 HCl 代替
邻苯三酚的 HCl 溶液)， 迅速摇匀后倒入比色杯， 325 nm
下每隔 10 s 测定吸光度。 计算线性范围内每分钟吸光度
的增加。 邻苯三酚自氧化率= (第 4 分钟的 OD 值－第 1 分
作者简介： 马金宝 （1972-）， 男， 安徽人， 硕士研究生， 从事糖分子生物学与糖工程研究。
* 通讯作者： 沈业寿， 硕士生导师， 教授。 E-mail: shysh@ahu. edu. cn
收稿日期： 2008-10-06
中国食用菌 2008， 27 （6）： 38～40
EDIBLE FUNGI OF CHINA
CN53－1054 ／ Q ISSN 1003－8310
DOI:10.13629/j.cnki.53-1054.2008.06.024
马金宝等： 亮菌多糖-1b 清除自由基作用研究
图 2 ATPS-1b 和 Vc 对·OH 自由基的清除作用
清
除
率
/%
ATPS-1b 质量浓度/mg·mL-1
钟的 OD值) /3
（2） ATPS-1b活性测定
操作方法同上， 加入邻苯三酚前， 分别加入 1.0 mL、
1.2 mL、 1.5 mL、 1.7 mL、 2.0 mL、 4.2 mL 浓度 5.0 mg·mL-1
的多糖溶液或抗坏血酸溶液， 不足 4.2 mL 的用蒸馏水补
足。 计算加样后邻苯三酚自氧化速率， 得出对 O2-·的 抑制
率。 抑制率 G%= [(△A0－△A) /△A0] ×100%， 对 O2-·自由
基的清除率 K%=1－G%。
式中： △A0为邻苯三酚的自氧化速率； △A 为加入多
糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率。
1.2.2 ATPS-1b对羟自由基的清除作用
参照文献 [5] 方法， 利用 Fenton反应产生·OH， 在体系
内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质， 该物质在 510 nm
下有最大吸收。
Fe2++H2O2→Fe3++OH－+·OH
在 10 mL 具塞试管中加入 l mL FeSO4 （9 mmo1·L-1）、
l mL 水杨酸-乙醇 （9 mmol·L-1） 和 l mL 不同浓度的样品
溶液或抗坏血酸溶液。 随后加 l mL H2O2 （8.8 mmo1·L-1）
启动反应， 37℃反应 0.5 h， 以蒸馏水为参比， 在 510 nm
下测量各浓度的吸光度。
考虑到多糖本身的吸收光值 ， 以 l mL FeSO4 （ 9
mmo1·L-1）、 l mL 水杨酸-乙醇 （9 mmol·L-1）、 l mL 不同浓
度的多糖溶液和 l mL 蒸馏水作为多糖的本底吸收值。 清
除率 (%) = [1－ (Ax－Axo) /Ao] ×100%。
式中： Ao 为空白对照液的吸光度； Ax 为加入多糖溶
液后的吸光度； Axo 为不加显色剂 H2O2多糖溶液本底的吸
光度。
1.2.3 ATPS-1b对有机自由基的清除作用
二苯代苦味肼基自由基 (1, 1-diphenyl-2-picrylhy
drazyl, DPPH·) 是一种稳定的自由基， 其结构中含有 3 个
苯环， 1 个 N 原子上有 1 个孤对电子， 其乙醇溶液呈紫
色， 在 517 nm 附近有强吸收， 当 DPPH·溶液中加入自由
基清除剂时， 孤对电子被配对， 颜色由紫色向黄色变化，
在 517 nm 处吸光度变小， 而吸光度变小的程度与自由基
被清除的程度呈定量关系， 因而可用分光法进行定量分析[7]。
根据文献 [8] 方法并且加以改进， 用无水乙醇配制
2×10-4 mol·L-1 的 DPPH·溶液。 在 10 mL 具塞试管中加 2
mL DPPH·溶液 （2×10-4 mol·L-1） 和 2 mL 不同浓度试样，
总体积 4 mL。 混合均匀， 黑暗下室温避光反应 30 min 后，
以原溶剂调零点， 于光径 1 cm 比色皿中测定 DPPH·混合
溶液在 517 nm 处的 OD 值 。 抑制率 G%= (Ai－Aj) /Ac×
100%， 对 DPPH·自由基的清除率 K% = 1－G%。
式中： Ai 为 2 mL DPPH·溶液+2 mL 多糖溶液的吸
光度； Aj 为 2 mL 多糖溶液+2 mL 溶剂的吸光度； Ac 为
2 mL DPPH·溶液+2 mL 溶剂的吸光度 (上述所有溶剂均
为无水乙醇)。
2 结果与讨论
2.1 ATPS-1b 对超氧阴离子自由基的清除作用
超氧阴离子自由基 （O2-·） 是基态氧接受 1 个电子后
形成的第一个氧自由基， 可经过一系列反应生成其它的氧
自由基， 不仅具有重要的生物功能， 而且与多种疾病的发
生有密切的联系[9]。生物体内氧化还原反应中， 大致有 2%～
5%的氧会产生超氧自由基， 超氧自由基的毒性是机体发
生氧中毒的主要原因[1]。
ATPS-1b 对 O2-·自由基的清除效果如图 1 所示， 随着
ATPS-1b质量浓度的增加， 总体清除率呈上升趋势， 但先
快后慢， 质量浓度在 0.56 mg·mL-1～0.94 mg·mL-1时， 清除
率上升较快， 几乎呈直线上升趋势， 之后逐渐趋于平缓。
在 ATPS-1b 质量浓度为 0.94 mg·mL-1 时 ， 清除率达到
79.53%。 试验中以对 O2-·自由基有较强清除作用的抗坏血
酸作阳性对照， ATPS-1b 清除 O2-·自由基的 EC50值 （清除
率达到 50%时所需的样品浓度） 为 0.69 mg·mL-1， 而抗坏
血酸清除 O2-·自由基的 EC50值是 0.14 mg·mL-1 （表 1）， 这
说明 ATPS-1b在体外可以清除 O2-·自由基， 并具有直接清
除超氧自由基的抗氧化活性。
2.2 ATPS-1b 对羟自由基的清除作用
羟自由基 (·OH) 是一种氧化能力很强的自由基， 它
很容易氧化各种有机物和无机物， 氧化效率高、 反应速率
快， 是造成动植物体内脂质过氧化、 核酸断裂、 蛋白质和
多糖分解的活性氧， 与机体的衰老、 肿瘤、 辐射损伤和细
胞吞噬有关[10]。
ATPS-1b对羟自由基的清除作用见图 2。
图 1 ATPS-1b 和 Vc 对 O2-·自由基的清除作用
ATPS-1b 质量浓度/mg·mL-1
清
除
率
/%
第 27 卷 第 6 期 39
清
除
率
/%
ATPS-1b 质量浓度/mg·mL-1
从图 2 可知， 随着 ATPS-1b 质量浓度的增加， 总体
清除率呈上升趋势。 在 ATPS-1b 质量浓度为 15.0 mg·mL-1
时， 清除率达到 76.4%。 以抗坏血酸作阳性对照， ATPS-
1b 清除·OH 自由基的 EC50 值为 8.73 mg·mL-1， 抗坏血酸
清除·OH 自由基的 EC50 值为 2.94 mg·mL-1 （表 1）， 这说
明 ATPS-1b在体外具有很强的清除·OH 自由基能力。
2.3 ATPS-1b 对有机自由基的清除作用
ATPS-1b 对 DPPH·的清除作用如图 3 所示 ， 随着
ATPS-1b 质量浓度的增加， 总体清除率呈上升趋势 。 在
ATPS -1b 质量 浓 度 为 5.0 mg·mL -1 时 ， 清 除 率 达 到
78.52%。 以抗坏血酸作阳性对照， ATPS-1b 清除 DPPH·
自由基的 EC50值为 2.01 mg·mL-1， 抗坏血酸清除 DPPH·自
由基的 EC50 值为 0.11 mg·mL-1 （表 1）， 可见 ATPS-1b 对
DPPH·自由基也具有较强的清除作用。
3 结论
本文首次对亮菌多糖体外清除自由基的抗氧化活性进
行研究， 实验结果说明 ATPS-1b 对 O2-·、 ·OH、 DPPH·3
种自由基均具有很强的清除作用， 且存在良好的量效关
系， 即随着 ATPS-1b 浓度的增大， 其清除效果增强； EC50
值分别为 0.69 mg·mL-1、 8.73 mg·mL-1、 2.01 mg·mL-1； 对
3种自由基的最大清除率分别为 86.17%、 76.4%、 78.52%。
可见， ATPS-1b具有较强的体外抗氧化活性， 这对亮菌多
糖的进一步开发利用具有重要意义。
参考文献
[1] 许钢． 灵芝提取液清除自由基能力[J]． 无锡轻工大学学报，2005，24
(1)： 92．
[2] Bektas Tepea， Atalay Sokmen. Screening of the antioxidative proper-
ties and total phenolic contents of three endemic Tanacetum sub -
species from Turkish flora [J]. Bioresource Technology， 2006， 98
(16)： 3076~3079.
[3] 沈业寿， 马金宝． 亮菌研究的现状与展望[J]． 安徽大学学报： 自然
科学版， 2007， 31 (1)： 82~86．
[4] 沈业寿， 郑媛， 李赓， 等． 亮菌多糖抗小鼠辐射损伤作用的研究
[J]． 中华放射医学与防护杂志， 2007， 27 （4）： 340~342．
[5] 颜军， 郭晓强， 乌日晓勇． 银耳多糖的提取及其清除自由基作用
[J]． 成都大学学报： 自然科学版， 2006， 25 (1)： 36．
[6] 丰永红， 于淑娟， 李国基． DPPH 法测甘蔗提取物抗氧化活性研究
[J]． 甘蔗糖业， 2003， (1)： 31．
[7] 崔月花， 徐鹏， 章克昌． 灵芝液态发酵有效产物体外抗氧化活性
的研究[J]． 食品与发酵工业， 2006， 32 （8）： 32~34．
[8] 李政， 王国良， 金珊， 等． 31 种常见抗菌中药对 DPPH·自由基清
除作用的分析[J]． 海洋水产， 2005， 26 (1)： 39．
[9] Dejian H, Boxin Ou, Ronald L. The chemistry behind antioxidant ca-
pacity assay[J]. Agric Food Chem, 2005， 53 (6)： 1841~1856.
[10] 何战胜， 曹朝辉， 邓健． 甲苯胺蓝光度法测定 Fenton 反应产生的
羟自由基[J]． 中国卫生检验杂志， 2005， 15 （2）： 160．
图 3 ATPS-1b 和 Vc 对 DPPH·自由基的清除作用
表 1 ATPS-1b 和 Vc 清除 3 种自由基 EC50值的比较 (n=5)
Study on Scavenging Free Radical Effect of Polysaccharide-1b from Armillariella tabescens
MA Jin-bao, SHEN Ye-shou, LI Feng, SHI Xin-qiang, ZHAO Gen-hai, XIE Yao-min
(Institute of Biochemistry and Microbiology, School of Life Science of Anhui University Anhui Key Laboratory of Eco-engineering and
Bio-technique, Hefei Anhui 230039)
Abstract: The effects of polysaccharide-1b from Armillariella tabescens(ATPS-1b) to remove superoxide anion free radical, hydroxyl
free radical and DPPH· free radical were determined by the methods of the auto-oxidation of pyrogallol system, Fenton reaction system
and DPPH· system. The results showed that ATPS-1b had strong scavenging capacity to O2-·,·OH and DPPH·. Furthermore, scavenging
capacity and anthocyanins concentration showed a position of dose-response relationship. The three free radicals had strong scavenging
results with the increasing of concenteation. The EC50 of scavenging free radicals were 0.69 mg·mL-1, 8.73 mg·mL-1, 2.01 mg·mL-1respec-
tively and maximum scavenging rates were 86.17%, 76.4%, 78.52%. ATPS-1b had significant antioxidant activity in vitro experiments.
Key words: Armillariella tabescens; Polysaccharide; Superoxide anion free radical; Hydroxyl free radical; DPPH· free radical; An-
tioxidant activity
中国食用菌 EDIBLE FUNGI OF CHINA Vol． 27 No．640