全 文 ：收稿日期:2013-11-13 接受日期:2014-03-07
基金项目:引进国际先进林业科学技术项目(2011-4-01)
* 通讯作者 Tel:86-25-85482534;E-mail:biliangwu@ 126． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:301-305
文章编号:1001-6880(2015)2-0301-05
响应面法优化泡桐叶中熊果酸的超声波提取工艺
邢雅丽1，毕良武1，2* ，赵振东1，2，夏田娟1
1中国林业科学研究院林产化学工业研究所 生物质化学利用国家工程实验室 国家林业局林产化学工程重点开放性实验室;
江苏省生物质能源与材料重点实验室，南京 210042;2 中国林业科学研究院林业新技术研究所，北京 100091
摘 要:为探讨泡桐叶中熊果酸的超声波提取工艺，通过中心复合设计-响应面法研究乙醇浓度(X1)、液固比
(X2)、超声波提取时间(X3)对泡桐叶中熊果酸提取得率的影响。结果表明，各因素对熊果酸得率的影响顺序
为乙醇浓度(X1)＞超声波提取时间(X3)＞液固比(X2);超声波辅助提取泡桐叶中熊果酸的最优工艺条件为:
乙醇浓度 89%，液固比 31 mL /g，超声时间 37 min;在此条件下，熊果酸得率为 14． 80 mg /g，与预测值相近，二次
回归模型预测性良好。
关键词:中心复合设计;泡桐叶;超声波提取;熊果酸
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 02． 022
Optimization of Ultrasonic Extraction of Ursolic Acid from
Paulownia elongata Leaves by Ｒesponse Surface Methodology
XING Ya-li1，BI Liang-wu1，2* ，ZHAO Zhen-dong1，2，XIA Tian-juan1
1 Institute of Chemical Industry of Forest Products，CAF;National Engineering Laboratory for Biomass Chemical Utilization;
Key and Open Laboratory on Forest Chemical Engineering，SFA;Key Laboratory of Biomass Energy and Material，Jiangsu Province，
Nanjing 210042，China;2 Ｒesearch Institute of Forestry New Technology，CAF，Beijing 100091，China
Abstract:In order to investigate ultrasonic extraction technology of ursolic acid from Paulownia elongate leaves，central
composite design coupled with response surface analysis was adopted to study the effects of ethanol concentration (X1)，
ratio of liquid to solid (X2)and ultrasonic time (X3)on the extraction yield of ursolic acid． The results showed that the
effects of ultrasonic factors on the extraction yield of ursolic acid from P． elongate leaves were in the following order:eth-
anol concentration (X1) ＞ ultrasonic time (X3) ＞ ratio of liquid to solid (X2)，and the optimal extraction conditions
were as follows:89% ethanol solution as extraction solution，30 mL /g as the ratio of liquid to solid，37 min as ultrasonic
time． Under the optimal conditions，the extraction yield of ursolic acid reached 14． 80 mg /g，which was close to the pre-
dicted response value． Hence，the quadratic regression model can be used to predict the ultrasonic extraction conditions
of ursolic acid from P． elongate leaves．
Key words:central composite design;Paulownia elongate leaves;ultrasonic extraction;ursolic acid
泡桐(Paulownia elongate S． Y． Hu)为玄参科
(Scrophulariaceae)泡桐属(Paulownia)多年生落叶
乔木，生长迅速，材质优良，具有抑菌、消炎、抗病毒、
抗氧化等药用价值［1，2］。随着现代波谱技术在天然
资源研究中的应用，泡桐因其所含黄酮、三萜等多种
生物活性成分而受到学术界的广泛关注。熊果酸
(ursolic acid)，又称乌索酸或乌苏酸，是分布于植物
界的 α-香树脂烷(α-amyrane)型五环三萜类化合物，
具有保肝、抗炎、抑菌、抗溃疡、降血糖血脂等多种生
物活性［3-5］。近年来，发现它具有抗致癌、抗促癌、诱
导 F9 畸胎瘤细胞分化作用，极有可能成为低毒高效
的新型抗癌药物［6，7］。此外，熊果酸明显的抗氧化
功能也被广泛用作医药和化妆品原料［8，9］。熊果酸
新功能的发现，其需求量明显增加，预示着熊果酸广
阔的应用前景。
目前，国内对泡桐叶中熊果酸的提取主要采用
溶剂回流和索氏提取法［10，11］，刘名权等［12］将超声波
提取与此两种提取方法进行对比，结果表明，超声波
提取无需加热，在较短的提取时间内，获得较高的提
取率。但采用正交试验法优化超声波提取工艺，各
因素的水平设计有限，优化精确度低，不能有效阐明
各因素交互作用对提取率的影响。中心复合设计
(Central composite design，简称 CCD)，又称二次回
归旋转设计，由全因子设计、轴点设计与零水平的中
心点重复实验 3 部分构成，可根据设计所建立的数
学模型描绘响应面，从其较优区域直接读取最优化
工艺条件，能有效研究多变量系统。该方法设计简
单，实验次数少，精密度高，能够正确认识变量之间
的相互作用，得到较准确的描述研究对象的关联式，
具有良好的预测性［13］。本研究采用中心复合设计-
响应面法对泡桐叶中熊果酸的超声波提取工艺进行
优化，以使熊果酸得率最大化，为进一步开发利用废
弃的泡桐叶资源提供参考。
1 仪器与材料
岛津高效液相色谱仪，配 SIL-20A 自动进样器、
LC-20AT泵、CTO-20A柱温箱、SPD-M20A 二极管阵
列检测器;FZ102 型植物细胞粉碎机，天津泰斯特仪
器有限公司;JY99-ⅡDN型超声波细胞粉碎机，宁波
新芝科技股份有限公司;KQ5200 型超声波清洗器，
昆山市超声仪器有限公司。
熊果酸(98． 79%)对照品均购于成都普瑞科技
开发有限公司;甲醇(色谱纯)购于南京化学试剂有
限公司;磷酸(色谱纯)购于美国 Aladdin 公司。泡
桐叶采自中国林科院林产化学工业研究所，经河南
农业大学退休教授李荣幸老师鉴定，为兰考泡桐。
2 方法与结果
2． 1 泡桐叶中熊果酸的超声波提取
阴干的泡桐叶用粉碎机破碎至一定粒度，40 ℃
烘箱干燥至恒重。准确称取一定量泡桐叶粉末，按
一定液固比加入一定浓度的乙醇溶液，限定提取温
度为 50 ℃，恒定超声频率和超声功率，超声波提取
一定时间。过滤，并用相应浓度的乙醇溶液洗涤滤
渣，合并滤液，旋蒸浓缩，用无水乙醇定容于 100 mL
容量瓶中，摇匀，得样品试液。HPLC 分析前用 0． 45
μm微孔滤膜过滤。
2． 2 HPLC色谱分析方法
2． 2． 1 熊果酸标准样品的配制
准确称取 9． 3 mg 熊果酸对照品，用甲醇溶解，
并定容于 10 mL的容量瓶中，配成熊果酸标准试液，
并用 0． 45 μm微孔滤膜过滤。
2． 2． 2 HPLC色谱条件
岛津色谱柱:Shim-pack ODS-CLC(M)(4． 6 mm
×250 mm，5 μm) ;流动相:甲醇-0． 05%磷酸水溶液
(91． 7∶ 8． 3，v /v);流速:0． 6 mL /min;柱温:30 ℃;检
测波长:210 nm。
2． 2． 3 标准曲线的绘制
精密吸取标准试液 1、2、5、10、15、20 (L，按色
谱条件进样测定，以进样量(X，μg)为横坐标，峰面
积(Y)为纵坐标，得线性回归方程为:Y = 502791 X-
294016(Ｒ = 0． 9993)。熊果酸在 0． 92 ～ 18． 37 μg进
样范围内与峰面积有良好的线性关系。
2． 2． 4 精密度实验
精密吸取熊果酸标准试液 10 μL，重复进样 5
次，峰面积的相对标准偏差(ＲSD)为 0． 10%，仪器
精密度良好。
2． 2． 5 重复性实验
准确称取同批泡桐叶粉末 6 份，按相同方法制
得提取液，测得熊果酸平均含量为 13． 61 mg /g，峰
面积的 ＲSD为 0． 96%。
2． 2． 6 稳定性实验
分别测定同一熊果酸提取液在 0、3、6、9、12、
18、24 h的熊果酸峰面积，其 ＲSD为 0． 79%，熊果酸
提取液在 24 h内稳定。
2． 2． 7 回收率实验
精密称取已知含量的泡桐叶粉末，精密测定后，
分别加入 50%、100%、150%样品含量的熊果酸标
准品，按“2． 1”方法制得加样提取液，HPLC 测定熊
果酸含量，得熊果酸的平均回收率分别为 93． 69%、
95． 44%、93． 21%。
2． 2． 8 样品含量测定
精密吸取提取液 20 μL，用高效液相色谱仪测
定，按外标法计算熊果酸的含量。
2． 3 提取工艺的中心复合设计
采用中心复合设计对泡桐叶中熊果酸的超声波
提取工艺进行优化。选取影响熊果酸提取率的主要
因素:乙醇浓度(X1，%，v /v)、液固比(X2，mL /g)、
提取时间(X3，min)为考察变量，以熊果酸的得率［Y
(UA)，mg /g］为评价指标，根据中心复合设计原理，
其因素水平设计见表 1，设计实验结果见表 2。
2． 4 响应面优化预测与验证
2． 4． 1 二次多项回归模型的建立及显著性分析
应用“STATGＲAPHICS Plus”实验设计与分析软
件，对表 2 中心复合设计实验数据进行回归拟合分
203 天然产物研究与开发 Vol. 27
表 1 熊果酸超声波提取工艺中心复合设计因素和水平
Table 1 Factors and levels of ultrasonic extraction of ursolic acid in central composite design
水平
Level
乙醇浓度 X1
Ethanol concentration(%)
液固比 X2
Ｒatio of liquid to solid(mL /g)
超声时间 X3
Ultrasonic time(min)
-1． 682 60 10 10
-1 68 18 18
0 80 30 30
1 92 42 42
1． 682 100 50 50
表 2 熊果酸超声波提取工艺中心复合设计实验结果
Table 2 Central composite design arrangement and the experimental data of the ultrasonic extraction of ursolic acid
No． X1 X2 X3 Y(UA)(mg /g)
1 0 -1． 682 0 12． 33
2 0 0 0 13． 55
3 0 0 0 13． 48
4 1 -1 1 13． 13
5 0 0 0 13． 65
6 -1． 682 0 0 9． 76
7 0 0 1． 682 13． 61
8 0 0 0 13． 48
9 1 1 1 13． 94
10 0 0 0 13． 75
11 -1 1 1 10． 61
12 1 -1 -1 13． 20
13 1 1 -1 11． 01
14 0 1． 682 0 12． 94
15 1． 682 0 0 13． 32
16 -1 -1 1 11． 34
17 -1 -1 -1 9． 24
18 -1 1 -1 8． 37
19 0 0 -1． 682 9． 35
析，得熊果酸得率与各考察变量的二次回归模型为:
Y (UA) = 13． 60 + 1． 30X1 + 0． 143X2 + 1. 05X3-
0. 813X21 + 0． 028X1X2-0． 185X1X3-0． 426X
2
2 + 0． 393
X2X3-0． 834X
2
3(Ｒ
2 = 0． 9392) (1)
由拟合回归方程(1)的相关系数可知模型拟合
程度良好，可以用此模型对泡桐叶中熊果酸的超声
波提取工艺进行分析和预测。从表 3 回归方程系数
显著性检验可知，各因素对熊果酸得率的影响顺序
为:X1 ＞ X3 ＞ X2，即乙醇浓度 ＞提取时间 ＞液固比。
统计分析结果表明:因素 X1(乙醇浓度)、因素 X3
(提取时间)的 P值均小于显著性水平 α(0． 01)，说
明这两个因素有非常显著影响;X2(液固比)的 P
值大于显著性水平 α(0． 1)，说明该因素无显著影
响;交互项 X1X2、X1X3、X2X3 的 P 值均大于显著性
水平 α(0． 1)，说明该交互项无显著影响;二次项
X21、X
2
3 的 P值均小于显著性水平 α(0． 01)，说明这
些二次项有非常显著影响;二次项 X22 的 P 值小于
显著性水平 α(0． 05)，说明该二次项有显著影响。
根据以上分析结果，删除没有显著影响的因素，
拟合方程变为:
Y (UA) = 13． 60 + 1． 30X1 + 1． 05X3-0． 813X
2
1-
0． 426X22-0． 834X
2
3 (2)
303Vol. 27 邢雅丽等:响应面法优化泡桐叶中熊果酸的超声波提取工艺
表 3 回归方程中系数的显著性检验
Table 3 Significance test of coefficient in regression equation
参数
Parameters
回归方程的各项系数和 P值
The coefficients and P-values in regression equation
独立变量 Independent variables X1 X2 X3
1． 30(＜ 0． 0001) 0． 143(0． 4290) 1． 05(0． 0002)
交互项 Interaction terms X1X2 X1X3 X2X3
0． 028(0． 9057) -0． 185(0． 4336) 0． 393(0． 1161)
二次项 Quadratic terms X21 X22 X23
-0． 813(0． 0011) -0． 426(0． 0359) -0． 834(0． 0009)
注:括号中数值为 P值，此值越小，说明该因素对评价指标影响越显著
Note:The numerical values in parentheses are P-values． The smaller the value is，the more significant effect the factor is on the evaluation index
2． 4． 2 响应面优化与预测
15.5
13.5
11.5
9.5
7.5Y（
UA
）（
m
g/
g） 14.4
12.4
10.4
8.4
6.4
4.4Y（
UA
）（
m
g/
g） 15
13
11
9
7Y（
UA
）（
m
g/
g）
7660 68 84 92 100
Ethanol%concentration(%)
7660 68 84 92 100
Ethanol%concentration(%)
1018
2634
42
50
Ratio%of%liquid
of%solid(mL/g)
1018
2634
42
50
1018
2634
42
50
Ultrasonic%
time(min)
Ultrasonic%
time(min)
10 18 26 34 42 50Ratio%of%liquid
of%solid(mL/g)
A B C
图 1 各因素交互作用对熊果酸的得率影响的响应面图
Fig. 1 Ｒesponse surface plots of mutual influences of extraction conditions on the extraction yields of ursolic acid
图 1 中(A)、(B)、(C)分别是熊果酸得率与乙
醇浓度和液固比、熊果酸的得率与乙醇浓度和超声
时间、熊果酸得率与液固比和超声时间的响应面图。
由图可知，乙醇浓度和超声时间对熊果酸得率影响
显著，表现为响应面陡峭;而液固比的变化对熊果酸
得率的影响相对较小，响应面较平滑。同时，由图 1
中(A)明显看出，随着液固比的增大，熊果酸得率呈
现先增大后减小的趋势，液固比存在最佳值。
Ethanol%concentration(%)
Ul
tra
so
ni
c%t
im
e(
m
in
)
50
42
34
26
18
10Ra
tio
%of
%li
qu
id
%of
%so
lid
(m
L/
g) 50
42
34
26
18
10
50
42
34
26
18
10
60% 68% 76% 84% 92% 100
Ethanol%concentration(%)
60% 68% 76% 84% 92% 100
Ethanol%concentration(%)
60% 68% 76% 84% 92% 100
10.0
10.5
11.0
11.5
12.0
12.5
13.0
13.5
14.0
14.5
Y(UA)(mg/g)
10.0
10.5
11.0
11.5
12.0
12.5
13.0
13.5
14.0
14.5
Y(UA)(mg/g)
10.0
10.5
11.0
11.5
12.0
12.5
13.0
13.5
14.0
Y(UA)(mg/g)A B C
图 2 各因素交互作用对熊果酸的得率影响的等高线图
Fig. 2 Contour plots of mutual influences of extraction conditions on the extraction yields of ursolic acid
等高线图能直观地反映出各因素交互作用对响
应值的影响，圆形表示两因素无交互作用，椭圆形表
示两因素交互作用显著。由图 2 等高线图可知，乙
醇浓度、液固比和超声时间三个因素两两之间不存
在显著交互作用;且乙醇浓度为 85% ～ 94%(v /v)，
液固比为 22 ～ 34 mL /g，超声时间为 29 ～ 44 min时，
熊果酸得率较高。
模型使用快速上升法对工艺进行优化，得泡桐
叶中熊果酸的超声波提取的优化工艺条件为:乙醇
浓度 88． 73%(v /v)，液固比 31． 45 mL /g，超声时间
36． 87 min，在此优化工艺条件下熊果酸的得率
14. 37 mg /g(预测值)。
2． 4． 3 响应面优化验证
将上述优化提取工艺参数修正为:乙醇浓度
403 天然产物研究与开发 Vol. 27
89%(v /v)，液固比 31 mL /g，超声时间 37 min。在
此条件下对泡桐叶中熊果酸进行超声波提取，结果
如表 4 所示，熊果酸的平均得率为 14． 80 mg /g，与预
测值偏差 0． 43 mg /g，说明二次多项回归模型预测
性良好，响应面法得到的工艺参数可靠，有一定实用
价值。将泡桐叶超声波提取残渣以相同条件进行二
次提取，总熊果酸含量几乎不变，说明超声波提取一
次即可实现泡桐叶中熊果酸的完全提取。
表 4 优化工艺熊果酸得率的预测值与观测值
Table 4 The observed and predicted response values for the optimized formulation
No．
超声波提取泡桐叶中熊果酸的得率
Ultrasonic extraction yield of ursolic acid from P． elongate leaves(mg /g)
实验值
Experimental values
平均值
Average value
预测值
Predicted value
偏差
Deviation
1 14． 77
2 14． 86 14． 80 14． 37 0． 43
3 14． 76
3 结论
在超声波提取泡桐叶中熊果酸的工艺过程中，
各因素的影响顺序为:乙醇浓度(X1)＞ 提取时间
(X3)＞液固比(X2)。泡桐叶中熊果酸的超声波提
取最佳工艺为:乙醇浓度 89% (v /v)，液固比 31
mL /g，超声时间 37 min，在此工艺条件下，熊果酸的
平均得率为 14． 80 mg /g。超声波提取泡桐叶中熊
果酸得率的拟合方程为:Y (UA) = 13． 60 + 1． 30X1
+ 1． 05X3-0． 813X
2
1-0． 426X
2
2-0． 834 X
2
3。实验验证，
该方程具有良好的预测性。
参考文献
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