全 文 ：收稿日期:2006-09-25;修回日期:2007-01-25　
基金项目:四川省应用基础研究项目(04JY029-047-2)
作者简介:罗霞(1974-),女 ,2002级博士研究生.
通讯作者:杨志荣.E-mail:bioyang@163.com
文章编号:　0490-6756(2007)04-0887-04
亮菌多糖对 S180荷瘤小鼠免疫功能的研究
罗　霞1 , 2 ,赵弋清1 ,陈东辉1 , 2 ,刘高阳1 , 2 ,许晓燕1 , 2 ,杨志荣1
(1.四川大学生命科学学院 , 成都 610064;2.四川省中药研究所 , 成都 610041)
摘　要:通过对荷瘤小鼠腹腔注射亮菌多糖后 ,观察其对荷瘤小鼠淋巴细胞增殖反应 、NK 细
胞活性及对 IL-1 、IL-2 、TNF-α、IFN-γ诱生的影响.研究结果表明:亮菌多糖能够显著提高荷
瘤小鼠 NK细胞杀伤活性 、对 ConA刺激的小鼠淋巴细胞有明显的促进作用 ,提高荷瘤小鼠脾
细胞产生 IL-2的能力;促进荷瘤小鼠机体细胞分泌 TNF-α;明显提高荷瘤小鼠血清中 IFN-γ
的含量.提示亮菌多糖可通过调节机体免疫功能而间接起到抗肿瘤的作用.
关键词:亮菌多糖;荷瘤小鼠;免疫
中图分类号:Q25　　　文献标识码:A
Study of Liangjun polysaccharide on immunologic function
of S180 tumor bearing mice
LUO X ia1 , 2 , ZHAO Yi-Qing1 , CHEN Dong-Hui 1 , 2 , LIU Gao-Yang1 ,2 ,
XU Xiao-Y an 1 , 2 , Y ANG Zhi-Rong1
(1.Co llege of Life Science , Sichuan University , Chengdu 610064 , China;
2.Sichuan Institute , Chinese Material Medica , Chengdu 610041 , China)
Abstract:To investigate the immunomodulato ry effect of Liangjun polysaccharide on S180 tumor bearing mice.
Lymphocy te proliferat ions , natural killer cell activity and IL-2 product ion w ere measured af ter S180 tumo r
bearing mice t reated w ith int raperi toneal injection of Liang jun polysaccharide.Liangjun polysaccharide
markedly improved lymphocy te proliferation responses and natural killer cell activity , and signif icantly in-
creased I L-2 production of S180 tumor bearing mice.Liangjun polysaccharide could improve the immunological
function of S180 tumo r bearing mice.
Key words:Liangjun polysaccharide ,S180 tumo r bearing mice , immunity
1　引　言
假蜜环菌[ Armillariella tabescens (Scop.ex
Fr.)Sing]是层菌纲口蘑科假蜜环菌属真菌.在我
国最初是从发光柳树朽木中分离而得 ,所以形象地
称为“亮菌”[ 1] .亮菌是我国首次发现并拥有自主
知识产权的一种真菌 ,在民间流传作为治疗急慢性
肝炎及胆道疾患的中草药.亮菌多糖是亮菌的主要
活性成分之一 ,且有研究者提出亮菌多糖具有抗肿
瘤的作用 ,但目前国内外尚缺少对其抗肿瘤作用的
详细研究[ 2] .作者对亮菌多糖抗肿瘤的作用机制
进行了初步研究 ,现报告如下.
2　材料与方法
2.1　材　料
2.1.1　实验动物 　昆明种小鼠 , BalB/C 小鼠及
C57BL/6J小鼠 ,体重 18 ～ 22 g ,雌雄各半 ,均由成
都中医药大学动物中心提供.
2007年 8月　
第 44卷第 4期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)
　 Aug.2007
Vol.44　No.4
2.1.2　亮菌多糖　亮菌菌株购自北京中科院微生
物研究所.26 ～ 28 ℃恒温摇动发酵培养 7 d ,发酵
液过滤除菌 ,提取多糖.
瘤株 S180细胞由本校微生物教研室提供.
2.2　方　法
2.2.1　动物分组　无菌取传代 6 d 的 S180肉瘤细
胞悬液 , 经生理盐水稀释后调细胞数至 4 ×107/
mL ,除正常对照外 ,其余各鼠腋下接种 0.2 mL ,
24 h后随机分组.亮菌多糖组小鼠腹腔注射亮菌多
糖(18×10-3 g/kg 、9×10-3 g/kg),荷瘤模型组小
鼠及正常对照组小鼠腹腔注射生理盐水 ,剂量为
0.1 mL/10 g体重 ,每日 1次 ,连续 10 d ,于接种肿
瘤后第 12 d各组小鼠分别进行以下实验.
2.2.2　对脾脏 NK 细胞活性的影响[ 3] 　NK 细胞
杀伤活性检测参照文献[ 4]的乳酸脱氢酶法进行.
按下列公式计算 NK 细胞的杀伤活性:
杀伤率(%)=(靶细胞 OD 值 -实验组 OD
值)/靶细胞OD值×100%
2.2.3　对淋巴细胞增殖反应的影响[ 4] 　常规制
备脾细胞悬液 ,加入 96孔培养板 ,再加 1×10-3 g/
mL ConA 2 μL.每个组均设 3个平行孔.于培养箱
中培养 72 h ,取出培养板.每孔加入 5.55×105 Bq/
mL(15μCi/mL)的3H-TdR 20μL.
收获处理细胞及检测:培养结束后 ,将各孔细
胞分别吸于 49 型玻璃纤维滤膜上 ,用蒸馏水洗滤
后 ,置于 80 ℃烤箱中干燥 30 min 后 ,用打孔器将
每个样品的滤片取下 ,放入含有 7 mL 闪烁液的闪
烁瓶中 ,避光过夜.次日 ,用液体闪烁计数仪测样品
的每分钟脉冲数(cpm).以 cpm 来反应细胞内3H-
TdR掺入 DNA的量 ,用以表示细胞增殖的程度.
2.2.4　对小鼠 IL-1生成的影响　参照文献[ 4]的
方法.
2.2.5　对小鼠 IL-2生成的影响　参照文献[ 4]的
方法.
2.2.6　对小鼠 TNF-α产生的影响[ 5] 　TNF-α样
品的制备:无菌取小鼠腹腔细胞 ,用 Hank S液洗 2
次 ,再用含 5%FBS的 RPM I1640培养液调细胞浓
度 2×106个/mL ,加入 24孔培养板 ,弃上清 ,洗涤
细胞 ,去除非粘附性细胞.加入 LPS 和含 10%小牛
血清的 RPM I-1640培养液 ,在 37 ℃,5%CO2 潮湿
大气中温育 12 h;收集上清液 , -20 ℃保存 ,即为
TNF-α待测样品.
TNF-α含量的测定:采用结晶紫染色法进行 ,
参见文献[ 5] .靶细胞为 L929细胞 ,以细胞死亡率
作为 TNF-α的活性指标.结果用 t检验比较各组
间差异显著性 ,检验水准 α=0.05.
2.2.7　对小鼠 IFN-γ产生的影响　供试小鼠以
颈椎脱臼法处死 ,在无菌条件下取脾 ,剪碎 ,轻磨 、
过滤 ,制成脾细胞悬液 , 0.83%Tris-NH4Cl破坏红
细胞 ,离心 ,用 RPMI-1640 培养液洗涤细胞.经台
盼蓝染色测定细胞活率大于 95%,再以含 10%胎
牛血清的 RPM I-1640 培养液制成(1×1010/L)脾
淋巴细胞悬液 ,加入 24孔板中 ,每孔 0.5 mL(终浓
度 5×109/L), ConA(终浓度 10×10-3 g/mL)或
10%NBS-RPIM-1640 培养液 ,在 37 ℃,饱和湿度
及 5%CO2 条件下 ,培养 24 h ,离心收集上清 , -20
℃保存 ,采用 ELISA法检测.
3　结　果
3.1　对免疫细胞活性的影响
3.1.1　对小鼠 NK 细胞活性的影响　表 1结果表
明 ,模型组荷瘤小鼠 NK细胞的杀伤活性下降 ,与
正常对照组相比较 ,杀伤率为 45.08%,加用亮菌
多糖后 ,NK 细胞杀伤活性有明显提高(P<0.05).
表 1　亮菌多糖对荷瘤小鼠 NK 细胞活性的影响(n=10)
Tab.1　Effects of Liang jun poly saccharide on natural killer
cell activity of S180 tumor bearing mice
组别 剂量(10-3 g/ kg)
NK 细胞活性
(OD490)
杀伤率
(%)
亮菌多糖 18 0.0372±0.025＊ 60.61±25.99＊
亮菌多糖 9 0.0402±0.024 58.61±24.99
模型 - 0.0416±0.016 56.84±15.59
正常 - 0.0518±0.012 45.08±12.75
与模型组比较 , ＊表示 P<0.05;＊＊表示 P<0.01
3.1.2　对小鼠淋巴细胞增殖的影响　模型组荷瘤
小鼠较正常对照组脾淋巴细胞增殖能力显著下降 ,
而亮菌多糖对 ConA 刺激的小鼠淋巴细胞有明显
的促进作用.
表 2　亮菌多糖对荷瘤小鼠淋巴细胞增殖的影响(n =10)
Tab.2 　Effects o f Liang jun poly saccharide on lymphocy te
proliferation of S180 tumo r bearing mice
组别 剂量(10-3 g/ kg) 3H-TdR(cpm)
亮菌多糖 18 4893±2537＊＊
亮菌多糖 9 4063±2435＊
模 型 - 783±237
正 常 - 2200±1033
与模型组比较 , ＊表示 P<0.05 , ＊＊表示 P<0.01
888 四川大学学报(自然科学版) 第 44卷
3.2　对细胞因子生成的影响
3.2.1　对小鼠 IL-1生成的影响　由表 3结果可
见 ,亮菌多糖对小鼠腹腔巨噬细胞产生 IL-1在 18
mg/ L的剂量下 ,在 1/4 、1/8的稀释比时对 IL-1的
生成较模型组有显著差异.
3.2.2　对小鼠淋巴细胞产生 IL-2 活性的影响　
结果见表 4 ,模型组小鼠脾细胞产生 IL-2的水平明
显低于正常对照组(P <0.05),而亮菌多糖组能显
著提高荷瘤小鼠脾细胞产生 IL-2 的能力(P <
0.01).
3.2.3　对小鼠 TNF-α产生的影响　从表 5 可以
看出 ,在肿瘤生长期间 ,荷瘤机体内 TNF-α含量明
显低于正常水平 ,而亮菌多糖组 TNF-α含量接近
正常水平(P<0.05).
3.2.4　对小鼠 IFN-γ产生的影响　从表 6可以看
出 ,亮菌多糖组荷瘤小鼠机体内 IFN-γ含量显著
高于正常对照组 ,且在 18×10-3 g/kg 的剂量下出
现显著性差异(P<0.05).
表 3　对小鼠腹腔巨噬细胞产生 IL-1 的影响(n =10)
Tab.3　Effect of Armillariella poly saccharide on IL-1 production in spleen cells of mice
组别 剂量(10-3 g/ kg)
OD值 570 nm(-x ±s)
稀释比 1/ 4 1/ 8稀释比 1/ 32稀释比
亮菌多糖 18 0.386±0.016＊ 0.394±0.051＊ 0.321±0.058
亮菌多糖 9 0.338±0.105 0.361±0.068 0.300±0.065
模型 - 0.235±0.065 0.408±0.100 0.320±0.080
正常 - 0.249±0.050 0.435±0.053 0.339±0.127
与模型组比较 , ＊表示 P<0.05 , ＊＊表示 P<0.01
表 4　亮菌多糖对 S180荷瘤小鼠淋巴细胞产生 IL-2 活性的影响(n =10)
Tab.4　Effects of Liangjun polysaccharide on IL-2 activity produced by lymphocy te
proliferation of S180 tumor bearing mice
组别 剂量(10-3 g/ kg) OD570 组别 剂量(10-3 g/kg) OD 570
亮菌多糖 18 0.269±0.008＊＊ 亮菌多糖 9 0.261±0.009
模型 - 0.244±0.010 正 常 - 0.258±0.012
与模型组比较 , ＊表示 P<0.05 , ＊＊表示 P<0.01
表 5　对小鼠单核巨噬细胞产生 TNF-α的影响
Tab.5　Effect of A rmillariella polysaccharide on TNF-αproduction in mononuclear macrophage of mice
组别 剂量(10-3 g/ kg)
OD值 570 nm(-x ±s)
稀释比 1/ 4 1/ 8稀释比 1/ 32稀释比
亮菌多糖 18 1.249±0.109＊ 1.245±0.037 1.224±0.068＊
亮菌多糖 9 1.208±0.033＊＊ 1.290±0.026 1.296±0.033＊＊
模型 - 1.118±0.054 1.294±0.069 1.147±0.032
正常 - 1.142±0.084 1.308±0.037 1.152±0.109
与模型组比较 , ＊表示 P<0.05 , ＊＊表示 P<0.01
表 6　亮菌多糖对荷瘤小鼠 IFN-γ含量的影响
Tab.6　Effects of Liang jun poly saccharide on the content of IFN-γin S180-bearing mice
组别 剂量(10-3 g/ kg) IFN-γ 组别 剂量(10-3 g/kg) IFN-γ
亮菌多糖 18 137.64±4.95＊ 亮菌多糖 9 127.62±3.85
模型 - 124.69±9.50 正 常 - 141.75±7.11＊＊
与模型组比较 , ＊表示 P<0.05 , ＊＊表示 P<0.01
889第 4期 罗霞等:亮菌多糖对 S180荷瘤小鼠免疫功能的研究 　
4　结　语
亮菌是一种抗肿瘤天然药物 ,其活性多糖成分
的免疫药理活性广泛 ,毒副作用低 ,作为新型生物
反应调节剂日益受到重视 ,具有良好的开发应用前
景.本实验提取亮菌发酵液中的亮菌多糖进行体内
实验 ,初步探讨其抗肿瘤作用机制.
本实验结果表明亮菌多糖能促进荷瘤小鼠脾
淋巴细胞的增殖 ,增强NK 细胞的活性 ,促进 IL-1 、
IL-2 、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的分泌.在抗肿瘤
免疫方面 ,细胞免疫占主导地位 , T 细胞为细胞免
疫的主力 ,可通过溶细胞作用 ,直接杀伤肿瘤细胞 ,
或通过分泌细胞因子 TNF-α、IFN-γ等间接地杀伤
肿瘤细胞.NK 细胞是机体内一种重要的免疫细
胞 ,它在无抗体参与情况下 ,能在体内外杀伤肿瘤
细胞 ,在机体防御及肿瘤监视中起重要作用 ,是机
体的一种抗肿瘤生长 、扩散和转移的天然防御系
统.许多因子如 IFN 、IL-2等均可激活 NK细胞 ,杀
伤肿瘤靶细胞 ,活化的 NK 细胞可释放细胞因子
TNFα、IL-2 、IFN-γ等 ,增强巨噬细胞的功能 ,共同
产生抗肿瘤作用[ 6 ,8 ,9] .IL-1 、IL-2作为体内重要的
淋巴因子 ,能促进 T 细胞的增殖 ,B细胞 、巨噬细胞
的活化 ,参与诱导 NK 细胞 、LAK细胞及细胞毒 T
细胞等的成熟分化 ,在抗肿瘤免疫调节方面起重要
作用[ 7 , 9 , 10] ,淋巴细胞增殖实验进一步验证了亮菌
多糖能增强机体细胞免疫 ,促进免疫细胞分泌抑瘤
因子分泌 ,从而提高荷瘤小鼠免疫功能 ,达到抗肿
瘤作用.
综上所述 ,本实验证实亮菌发酵液中提取的亮
菌多糖的抗肿瘤作用 ,主要是通过激活免疫活性细
胞(NK细胞 , T 淋巴细胞 )和调节细胞因子 (IL-
1 、IL-2 、TNF-α、IFN-γ)产生 ,增强机体非特异性免
疫功能.同时 ,也可能是其在诱导过程中还产生了
其他细胞因子和免疫活性细胞 ,通过相互调控 ,协
同发挥免疫调节功能 ,从而间接起到抗肿瘤作用.
相信 ,对亮菌多糖有效生物活性成分进行深入研
究 ,很有可能将其作为新的抗肿瘤生物反应调节剂
得以开发和利用.
参考文献:
[ 1] 　于学娟 , 孙筱林 , 陈培英 , 等.假蜜环菌液体深层发酵
的研究[ J] .山东轻工业学院学报 , 2003 , 17(2):36.
[ 2] 　方积年 , 叶淳渠 , 吴淑云 , 等.亮菌多糖的研究[ J] .生
物化学与生物物理学报 , 1984 , 16(3):222.
[ 3] 　郑芳 , 刘东方 , 熊平 , 等.SNAP-23 对 NK 细胞杀伤效
应的调控[ J] .中华微生物和免疫学杂志 , 2006 , 26
(2):97.
[ 4] 　余梦瑶 , 罗霞 ,陈东辉 , 等.鸡血藤煎剂对小鼠细胞分
泌细胞因子的影响[ J] .中国药学杂志 , 2005 , 1(4):
27.
[ 5] 　宁安红 , 曹婧 ,黄敏 , 等.灰树花提取成分对小鼠免疫
功能影响的实验研究[ J] .中国免疫学杂志 , 2002 , 18:
550.
[ 6] 　刘德谈 , 冯凯 ,陈虎.NK 细胞德生物学特性及临床应
用研究进展[ J] .白血病·淋巴瘤 , 2006 , 15(2):142.
[ 7] 　陈金烟 , 卢政辉.真菌多糖的免疫效应抗肿瘤作用机
理的探讨[ J] .福建轻纺 , 2002 , 4:4.
[ 8] 　涂文利 , 耿越.NKT 细胞抑制或增强抗肿瘤免疫反应
的机制[ J] .生命的化学 , 2004 , 24(6):499.
[ 9] 　Wang G , Zhao J , Tang W , et al.Enhancement of IL-2
and IFN-γexpression and NK cells activity involved in
the anti-tumor effect o f ganoderic acid Me in vivo [ J] .
I nternational Immunopharmaco logy , 2007 , 7(6):864.
[ 10] 　Ozgel G , Akbnga J.In vitro characterization and trans-
fection of IL-2 gene complex [ J] .I nternational Journal
of Pharmaceutics , 2006 , 216(1-2):44.
890 四川大学学报(自然科学版) 第 44卷