全 文 ：山黄皮果总黄酮体外清除自由基活性研究
梁云贞，韦方立，黄秋婵 (广西民族师范学院化学与生物工程系，广西崇左 532200)
摘要 ［目的］研究山黄皮果总黄酮体外清除自由基的活性。［方法］采用 Fenton(邻二氮菲)法和邻苯三酚自氧化法(325 nm)评价山黄
皮果总黄酮体外清除自由基活性，以 Vit C为阳性对照品。［结果］山黄皮果总黄酮清除羟自由基和超氧阴离子自由基的 EC50分别为
58． 7和 23． 5 μg /ml，Vit C清除羟自由基和超氧阴离子自由基的 EC50分别是 128． 8 和 77． 6 μg /ml，表明山黄皮果总黄酮的清除能力比
Vit C强。［结论］山黄皮果总黄酮具有较强的体外清除自由基能力，是一种天然有效的自由基清除剂。
关键词 山黄皮果;黄酮;清除自由基
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2013)18 －07773 －02
Antioxidant Activity of Flavonoids from the Fruit of Clausena indica(Datz)． Oliv．
LIANG Yun-zhen et al (Department of Chemistry and Biological Engineering，Guangxi Normal University of Nationalities，Chongzuo，
Guangxi 532200)
Abstract ［Objective］The antioxidant activity of total flavonoids from the fruit of Clausena indica(Datz)． Oliv． was determined． ［Method］
By using Fenton reaction and self-oxidation of 1，2，3-phentriolassay method(325 nm)，the free radical scavenging activity of total flavonoids
from the fruit of C． indica was evaluated with Vit C as positive CK． ［Ｒesult］The results showed that flavonoids from the fruit of C． indica
have strong scavenging free radical for hydroxyl radical and superoxide anion，their EC50 values are 58． 7 μg /ml and 23． 5 μg /ml respectively，
and vitamin C has scavenging capabilities for hydroxyl radical，superoxide anion and DPPH free radical，its EC50 values are 128． 8 and 77. 6
μg /ml respectively． ［Conclusion］Total flavonoids from the fruit of C． indica have strong free radical scavenging ability． It is an effective na-
tura1 free radical scavenger．
Key words Fruit of Clausena indica(Datz)． Oliv．;Flavonoids;Free radical scavenging
基金项目 广西教育厅科研项目(201010LX558)。
作者简介 梁云贞(1973 － ) ，女，广西龙州人，副教授，从事生物化学教
学与研究工作，E-mail:245514034@ qq． com。
收稿日期 2013-06-08
山黄皮俗称鸡皮果，又名细叶黄皮(Clausena indica
(Datz．)Oliv．) ，为芸香科柑桔亚科黄皮属(Clausena)多年生
常绿小乔木，是一种有丰富野生资源的珍稀野生水果，主要
分布于北回归线以南的南亚热带地区［1］。中越边境的广西
龙州、大新县是山黄皮的主要产区。山黄皮果实为浆果，酸
甜可口，香气独特，富含维生素 C、氨基酸、糖、蛋白质、铁和
钙等营养元素，营养价值高。山黄皮果实、根茎、及枝叶还具
有祛痰化气和消积消滞等药效［2］。
目前，只有李昌宝等人用 DPPH法和水杨酸法研究山黄
皮果总黄酮体外清除 DPPH 自由基和羟自由基的报导［3］。
笔者采用邻二氮菲法和邻苯三酚自氧化法(325 nm)研究山
黄皮果总黄酮体外清除羟自由基和超氧阴离子自由基活性，
以期为更好地开发和利用山黄皮资源提供理论依据，并为寻
找和开发新的安全的天然抗氧化剂提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。山黄皮果，采自广西民族师范学院龙州
校区，经广西民族师范学院化学与生物工程系生物专业黄秋
婵副教授鉴定为山黄皮正品。
1． 1． 2 主要仪器。UV-3200 PCS型紫外可见分光光度计，购
自上海美普达仪器有限公司;FW 800型高速万能粉碎机，购
自天津市泰斯特仪器有限公司;KJ23B-AN型美的微波炉，购
自广东美的微波炉制造有限公司;AＲ124CN型电子天平，购
自奥豪斯仪器(上海)有限公司;电热恒温鼓风干燥箱，购自
上海福玛实验设备有限公司;DKS-12 型不锈钢新型电热恒
温水浴锅，购自杭州蓝天化验仪器厂;PHS-3C 型实验室 pH
计，购自上海今迈仪器仪表有限公司;SHB-Ⅲ型循环水式多
用真空泵，购自郑州长城科工贸有限公司。
1． 1． 3 主要试剂。芦丁标准品，购自 Bioszune． Inc．，生化试
剂，纯度≥98%;邻二氮菲、邻苯三酚、抗坏血酸(VC)、无水乙
醇、双氧水、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、95%乙醇等，均
为分析纯，市售。
1． 2 方法
1． 2． 1 对照品溶液的制备。精密称取芦丁对照品 25． 0 mg，
置于 100 ml容量瓶中，加适量浓度 80%乙醇溶解，再用浓度
80%乙醇定容至刻度，即得。
1． 2． 2 线性关系的考察。精密吸取 0、2． 0、4． 0、6． 0、8． 0、
10. 0和 12． 0 ml 对照品溶液，分别置于 50 ml 容量瓶中，加
1. 5 ml浓度 5%的亚硝酸钠，混匀，放置 6 min;然后加入 1． 5
ml浓度 10%的硝酸铝溶液，混匀，放置 6 min;再加入 20 ml
浓度4%的 NaOH溶液，最后用浓度80%乙醇定容至刻度，摇
匀，放置 15 min，以浓度 80%乙醇为空白，在 510 nm波长下
测定吸光度;以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线
性回归，计算回归方程。
1． 2． 3 山黄皮果总黄酮的提取和测定［4］。按文献方法提
取，并将所得提取液减压浓缩近干，得山黄皮果黄酮浸膏，置
4 ℃冰箱冷藏备用;使用时取一定量的山黄皮果黄酮浸膏，
加蒸馏水溶解，按“线性关系的考察”的方法测定黄酮浓度。
1． 2． 4 山黄皮果总黄酮抗氧化活性的测定。
1． 2． 4． 1 总黄酮对·OH 自由基清除活性的测定。采用
Fenton(邻二氮菲)反应进行测定。参考罗超等［5］和罗宇
倩［6］的方法并进行适当修改。每管以 0． 5 ml 的邻二氮菲
(7. 5 mmol /L)、0． 5 ml 磷酸盐缓冲溶液(0． 75 mmol /L，pH
7. 4)和 0． 5 ml(NH4)Fe(SO4)2(7． 5 mmol /L)溶液混匀，再加
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(18):7773 － 7774，7860 责任编辑 石金友 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.18.041
入 0. 5 ml浓度 0． 1%H2O2 溶液，以 H2O代替 H2O2 为未损伤
管，样品管加入 1． 0 ml不同浓度山黄皮果总黄酮提取液(用
超纯水将“1． 2． 3”所得提取液稀释成一定浓度梯度的含黄酮
溶液) ，未损伤管与损伤管以 H2O代替，混匀后置于 37 ℃水
浴 60 min，于 536 nm波长处测定吸光度;用一定浓度梯度的
Vit C溶液作阳性对照，根据以下公式计算·OH清除率。
清除率(%)=［(A样品 － A损伤)/(A未损伤 － A损伤) ］×100
其中:A样品为 0． 5 ml 邻二氮菲 + 5． 0 ml 磷酸盐缓冲溶液 +
0. 5 ml(NH4)Fe(SO4)2 + 0． 5 ml H2O2 +1． 0 ml样品 + H2O→
10． 0 ml的吸光度值;A未损伤为 0． 5 ml邻二氮菲 + 5． 0 ml磷酸
盐缓冲溶液 +0． 5 ml(NH4)Fe(SO4)2 + 0． 5 ml H2O + 1． 0 ml
H2O + H2O→10． 0 ml的吸光度值;A损伤为 0． 5 ml邻二氮菲 +
5． 0 ml磷酸盐缓冲溶液 + 0． 5 ml(NH4)Fe(SO4)2 + 0． 5 ml
H2O2 +1． 0 ml H2O + H2O→10． 0 ml的吸光度值。
1． 2． 4． 2 总黄酮对超氧阴离子自由基(O －2 ·)清除作用的
测定。采用邻体三酚自氧化方法进行测定。参考文献［5 －6］
的方法并进行适当修改。邻体三酚在酸性条件下是稳定的，
在碱性条件下，邻体三酚会自氧化，释放出 O －2 ·，并生成有
色中间产物，其在 325 nm处有最大吸收峰。当加入抗氧化
剂后，可清除 O －2 ·，从而阻止中间产物的积累，使溶液在 325
nm处的吸光值减弱，因此可通过测定加入样品前后吸光度
值的变化来表示样品对 O －2 ·的清除效果。
取 3． 5 ml Tris-HCl(50 mmol /L，pH8． 2)加入 1． 0 ml不同
浓度样品溶液(用超纯水将“1． 2． 3”所得提取液稀释成一定
浓度梯度的含黄酮溶液)混匀，于 25 ℃水浴 20 min 后加入
0． 5 ml邻苯三酚溶液(50 mmol /L，用 10 mmo /L HCl配制，25
℃水浴20 min预热) ，混匀于25 ℃水浴反应4 min(自加入邻
苯三酚始计算时间)即加入 3 滴 8 mol /L HCl 中止反应;于
325 nm处测吸光度值(A样品)。用超纯水代替样品测空白管
A0，对照管用 10 mmol /L HCl 溶液代替邻苯三酚溶液，测定
A对照;用一定浓度梯度的 Vit C溶液作阳性对照，以下列公式
计算 O －2 ·清除率。
清除率(%)=［1 －(A样品 － A对照)/(A0 － A对照) ］×100
其中，A样品为 3． 5 ml Tris-HCl + 1． 0 ml 样品溶液→(混匀，25
℃水浴 20 min)+0． 5 ml邻苯三酚溶液→(混匀，25 ℃水浴 4
min)+3滴 8MHCL的吸光度值;A0 为 3． 5 ml Tris-HCl + 1． 0
ml H2O→(混匀，25 ℃水浴 20 min)+ 0． 5 ml 邻苯三酚溶液
→(混匀，25 ℃水浴 4 min)+ 3 滴 8 mol /L的 HCl 的吸光度
值。A对照为 3． 5 ml Tris-HCl +1． 0 ml H2O→(混匀，25 ℃水浴
20 min)+ 0． 5 ml 的 10 mmol /L HCl→(混匀，25 ℃水浴 4
min)+3滴 8 mol /L的 HCl的吸光度值。
2 结果与分析
2． 1 线性关系的考察 计算得线性回归方程为:Y =
11. 533X +0． 008，相关系数 Ｒ为 0． 999 8。试验结果表明，在
0 ～0． 06 mg /ml范围内，芦丁浓度与吸光度的线性关系良好。
2． 2 山黄皮果总黄酮抗氧化活性
2． 2． 1 山黄皮果总黄酮对·OH 自由基清除活性。图 1 表
明，随着总黄酮浓度的增加，山黄皮果总黄酮对·OH的清除
能力逐步增强。在 0． 52 ～ 10． 40 μg /ml 范围内，山黄皮果总
黄酮对·OH自由基有明显的清除作用，呈现明显的量效关
系。根据回归方程计算可知，其清除率为 50%的有效浓度
EC50为 58． 7 μg /ml，而 Vit C对·OH自由基清除作用的 EC50
为 128． 8 μg /ml，说明山黄皮果总黄酮对·OH自由基清除作
用强于 Vit C。
图 1 山黄皮果总黄酮消除·OH作用
2． 2． 2 山黄皮果总黄酮对超氧阴离子自由基(O －2 ·)清除
活性。图 2表明，随着总黄酮浓度的增加，山黄皮果总黄酮
清除超氧阴离子自由基(O －2 ·)的能力逐步增强。在 1． 31 ～
4. 37 μg /ml范围内，山黄皮果总黄酮对超氧阴离子自由基
(O －2 ·)有明显的清除作用，呈现明显的量效关系。根据回
归方程计算，其清除率为 50% 的有效浓度 EC50为 23． 5
μg /ml，而 Vit C 对超氧阴离子自由基(O －2 ·)清除作用的
EC50为 77． 6 μg /ml，说明山黄皮果总黄酮对超氧阴离子自由
基(O －2 ·)清除作用强于 Vit C。
图 2 山黄皮果总黄酮对超氧阴离子(O －2 ·)的清除作用
3 结论
试验结果表明，山黄皮果总黄酮清除羟自由基和超氧阴
离子自由基的 EC50分别为 58． 7和 23． 5 μg /ml，Vit C清除羟
自由基和超氧阴离子自由基的 EC50分别是 128． 8 和 77． 6
μg /ml，表明山黄皮果总黄酮具有较强的体外清除自由基能
力，清除能力比 Vit C强，是一种天然有效的自由基清除剂。
参考文献
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(下转第 7860页)
4777 安徽农业科学 2013 年
图 7 梅花与地被景观
劲松或袅娜多姿的翠竹配置在一起，才能显示刚毅、坚贞、团
结和不屈不挠的高尚风格。
3． 2 梅花 －园林建筑 陈俊愉等认为，梅花最宜造成“梅花
绕屋”、“登楼观梅”的景观［9］。选择最好观赏位置，配置供游
人观赏、休闲娱乐的园林建筑，在其周围散植或者密植梅花，
一方面可作为供人赏梅休息的场所，另一方面，建筑本身也
可成为景观的一部分，丰富景观效果(图 8)。
图 8 梅花与建筑、水体景观
3． 3 梅花 －水体 －植物 梅花树形优美、苍劲古朴，傲骨嶙
嶙，配置在水边，枝条伸向水面，平镜倒影，可形成“疏影横
斜”的优美景色。在溪涧曲水的自然山石驳岸，宜配置株型
较小的梅花，使其体量与山石驳岸协调统一。在大面积水体
的缓坡驳岸，适宜配置大株体型歪斜的梅花或大片梅林，使
水中梅树倒影与岸上梅林动静对比，增加了梅水景观的空间
层次，可表现梅水景观独特的风格［10］。
3． 4 梅花 －景石 －青松 梅花有“花魁”的美誉，石为天地
精华，具有历经风吹雨打、严寒酷暑而不变其态的品
性［11 －12］。在主要梅花观赏点配置苍劲挺拔的青松做背景，
疏影横斜的梅花与奇石交错相拥，以梅花枝条包裹奇石，融
为一体，犹如经历了千万年的风吹雨打而不屈(图 9)。
图 9 梅花与景石、青松景观
3． 5 梅花 －山体 －建筑 依托山体种植梅树成林，可形成
梅山、梅岭作为主要赏梅场所，又可作为背景林［13］。在山腰
处修建亭台等便于游客休息赏梅的建筑，形成“梅林绕屋”的
景观。山体上成片梅林随机种植，红、白、粉三色相间，登台
赏梅，满山梅花尽收眼底，绯红粉白，冬雪裹树，形成“香雪
海”的美景，令人心旷神怡［14］。
3． 6 梅花 －道路 梅花结合道路的配置方式，与建筑、草坪
等都不相同，后者是以静止停留观赏为主，前者是动态的观
赏，步移景异的景观效果。梅花与道路的配置形式多样，可
密植在道路旁分割空间，遮挡景观视线;亦可散点在道路旁，
枝条覆盖道路，避免空间过于通透;还可在道路两边片植梅
花，让游人置身梅林、梅海中，构成人梅合一的画面。
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