全 文 ：　
第26卷 第4期 作　物　学　报 V ol. 26, N o. 4
2000 年7月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA July, 2000
小麦株高近等基因系的 RAPD 标记研究X
郭北海3 3 , 1　张艳敏1　李洪杰1　王子宁1　张忠廷2　李松涛2　
王　斌2　杜立群3　李银心3　朱至清3
(1河北省农林科学院粮油作物研究所作物遗传育种省重点实验室, 河北石家庄 050031; 2 中国科学院遗传研究所, 北京
100101; 3中国科学院植物研究所, 北京 100093)
提　要　采用RA PD 技术, 以4个小麦株高近等基因系 (分别含有 rh t、R h t1、R h t2、R h t3基因) 为材料,
筛选了296个单一随机引物 (10个核苷酸)。发现25个引物的扩增产物在近等基因系间表现出特异性。在
6次重复试验中, 有18个引物的特异扩增片段不能重复, 6个引物可以重复2～ 3次, 唯有O PAM 01在全
部试验中均能稳定重复, 其特异扩增片段O PAM 011860可以作为 rh t 基因的RA PD 标记。
关键词　小麦; 基因标记; rh t 基因; RA PD
D etection of a RAPD M arker L inked to rh t Gene in W hea t (Triticum
aestivum L. )
GUO Bei2H ai1　ZHAN G Yan2M in1　L I Hong2J ie1　WAN G Zi2N ing1　ZHAN G Zhong2T ing2
L I Song2T ao2　WAN G B in2　DU L i2Q un3　L I Yin2X in3　ZHU Zh i2Q ing3
(1 Institu te of Food and O il C rops, H A A FS , S h ij iazhuang , H ebei 050031; 2 Institu te of Genetics, CA S , B eij ing 100101; 3 Ins2
titu te of B otany , CA S , B eij ing 100093)
Abstract　Four near2isogen ic lines w h ich con tained rh t, R h t1, R h t2, R h t3 respectively w ere
used fo r po lymorph ic analysis at mo lecular level by RA PD techn ique. O ut of 296 102m er
o ligonucleo tide p rim ers screened, 25 show ed po lymorph ism among near2isogen ic lines. D uring 6
repeat tests of these p rim ers, 18 could no t give the repeat results, 6 could repeat 2 to 3 tim es,
on ly p rim er O PAM 01 show ed the stable results in w h ich a 1. 86 kb additional band w as found in
rh t line. O PAM 011860 could be iden tified as a RA PD m arker linked to rh t gene in w heat.
Key words　T riticum aestivum ; Gene m arker; rh t gene; RA PD
已发现并命名的小麦矮杆基因多达20个[ 1～ 3 ], 在品种中发挥重要作用的有 R h t1、R h t2、
R h t8和 R h t10等, 但有关这些基因的标记研究较少报道。另外, 小麦是六倍体作物, 由于其染
色体组的多倍性和部分同源性, 用片段大小为10个核苷酸的单一引物扩增出的DNA 片段表
现出相对不稳定性[ 4 ]。因此, 有关小麦基因的RA PD 标记研究也还存在争议。但最近的一些
研究表明 RA PD 标记可以在小麦上应用[ 5～ 10 ]。本研究采用一套小麦株高近等基因系 ( rh t、
R h t1、R h t2、R h t3)为材料, 针对重要农艺性状进行 RA PD 标记研究, 获得了一个与 rh t 基因
X 河北省自然科学基金资助, RA PD 实验在中国科学院遗传研究所完成
3 3 中国科学院植物研究所博士研究生
收稿日期: 1998212217, 接受日期: 1999204218

紧密连锁的RA PD 标记, 并进一步证实可以在小麦中获得稳定的RA PD 标记。
1　材料与方法
1. 1　材料　普通小麦品种Bersee 的一套矮秆基因近等基因系 (分别含有 rh t、R h t1、R h t2、
R h t3基因)由M. D. Gale 博士提供, 系回交7代的后代材料。
1. 2　D NA 提取　　取上述4个材料的黄化苗5～ 6g, 在液氮中研成粉末, 移入离心管, 加入
20 mL 预热 (65℃)提取缓冲液 (42% U rea、0. 3 molö L N aC l、50 mmolö L T ris2HC l pH 8. 0、20
mmolö L ED TA、2% Sarcosyl、5% Pheno l)和0. 75 mL 20% SD S, 60℃下保温10 m in; 加入15
mL 氯仿 ö 异戊醇 (24 ÷ 1) , 60℃下保温15 m in, 6000 r ö m in 离心15 m in, 取上层水相; 加入等体
积酚 ö 氯仿抽提, 用冷乙醇沉淀DNA ; 将DNA 溶于2 mL T E 缓冲液, 加入RN ase A (10 Lg ö
mL ) , 37℃下保温30 m in; 先后用酚、酚ö 氯仿、氯仿再抽提一次; 用冷乙醇沉淀DNA , 风干
后溶于1 mL T E 缓冲液。该DNA 作为 PCR 反应的模板。
1. 3　RAPD 反应　　PCR 反应总体积为25 LL 含有10 mmolö L T ris2HC l(pH 8. 8)、50 mmolö
L KC1、2mmolö L M gC l2、4 种 dN T P 各为 0. 15 mmolö L、0. 2 Lmolö L 引物、1. 25 单位
T aqDNA 聚合酶和10～ 20 ng DNA 模板。全部扩增共40个循环。前3个循环97℃变性1 m in,
36℃复性1 m in, 72℃延伸5 m in。后37个循环94℃变性1 m in, 37℃复性1 m in, 72℃延伸5
m in。全部循环结束后, 72℃保温5 m in。用1. 4% 琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物, 经溴化乙锭
染色后, 在紫外灯下观察结果并拍照。分子量标准为 KDNA ö H ind¸ + E coR É 。
本研究所用的296个随机引物均为Operon 公司生产, 长度均为10个核苷酸。
2　结果与分析
在本研究所用的296个引物中, 有23个引物未扩增出任何产物, 约占总数的7. 8% , 其余
273个引物均扩增出产物。从电泳结果看, 扩增产物最少的仅1个片段, 多的达到7～ 8个
表1　 表现出扩增特异性的几个引物碱基序列
Table 1　 Nucleotide sequences of some
pr imers detecting polymorphism
among near- isogen ic l ines
引物
P rim er
序列
P rim er sequence
O PAH 04 5′CTCCCCA GAC3′
O PA K12 5′A GTGTA GCCC3′
O PAM 01 5′TCACGTACGG3′
O PAM 04 5′GA GGGACCTC3′
O PAM 14 5′TGGTTGCGGT 3′
O PAN 05 5′GGGTGCA GTT 3′
O PAN 06 5′GGGAACCCGT 3′
片段, 但大多数为4～ 5个片段。虽然大多数引物均可
产生扩增物, 但在初次扩增筛选试验中只有25个引物
(约占8. 5% ) 的扩增产物在近等基因系间表现出特异
性。对这25个引物6次重复扩增试验中, 有18个引物在
近等基因系间的特异性不能重复, 可以重复的7个引物
是: O PA H 04、 O PA K12、 O PAM 01、 O PAM 04、
O PAM 14、O PAN 05、O PAN 06 (图1a、b、c、d、e、f) ,
其序列列于表1。
　　除O PAM 01外 (图1e) , 其余6个引物在6次重复试
验中仅有2～ 3次可以重复扩增出特异产物, 而在其它
扩增试验中其特异性不能重复。图 1c 和图 1d 是
O PA K12在不同重复试验中的结果。由于在不同重复
试验中表现出不稳定性, 这6个引物的扩增片段很难用作小麦株高基因的标记。唯有
O PAM 01在全部6次试验中均能稳定扩增出特异片段 (图1e) , 其扩增片段在含有 R h t1、R h t2、
R h t3基因的材料上表现一致, 含有 rh t 基因的材料则多扩增出1个片段, 该片段大小为1. 86
kb。因此, O PAM 011860可以作为 rh t 基因的RA PD 标记。
1244期　　　　　　　　　　郭北海等: 小麦株高近等基因系的RA PD 标记研究　　　　　　　　　　　　　

图1　　几个引物的扩增结果。1a、引物O PAM 04扩增结果; 1b、引物O PAH04扩增结果; 1c、引物O PA K12
扩增结果; 1d、引物O PA K12扩增结果; 1e、引物O PAM 01扩增结果; 1f、引物O PAN 05扩增结果。
M : 分子量标准 (KDNA ö H ind¸ + E coR É ) ; 1: R ht1系; 2: R ht2系; 3: R ht3系; 4: rh t 系。
F ig. 1　　PCR results of som e p rim ers. 1a. p rim er O PAM 04; 1b. p rim er O PAH 04; 1c. p rim er
O PA K12; 1d. p rim er O PA K12; 1e. p rim er O PAM 01; 1f. p rim er O PAN 05.
L ane M : molecular w eigh t m arker (KDNA ö H ind¸ + E coR É ) ; L ane 1: R ht1 line;
L ane 2: R ht2 line; L ane 3: R ht3 line; L ane 4: rh t line
　　本试验扩增出特异片段的25个引物, 多数在近等基因系间表现出的特异性较为相似, 即
含有 rh t 基因的材料比含有 R h t1、R h t2、R h t3基因的材料多出一个扩增片段, 而含有 R h t1、
R h t2和 R h t3的材料的扩增产物表现较一致 (图1c、图1e、图1f)。这一结果表明4个近等基因系
材料的遗传背景极为一致, 特别是含有 R h t1、R h t2、R h t3基因的材料间遗传差异很小, 而它
们与含有 rh t 基因的材料间遗传差异相对较大。从本试验结果可以看出 R h t1、R h t2、R h t3矮
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杆基因有可能是从 rh t 基因突变而来, 并且基因序列相当一致。
在本研究中, 多态性扩增产物的分子量大多在1～ 2 kb 之间 (图1a、b、e、f) , 而O PA K12
引物扩增出的片段大小达到3. 06 kb (图1c) , 这一现象我们目前还无法解释, 有待进一步研
究。
3　讨论
小麦株高近等基因系对研究株高基因的标记非常有效。本研究筛选了296个随机引物,
按每个引物平均扩增出5个片段计算, 全部试验共扩增出约1500个片段, 但只有其中1个引物
的1个片段在近等基因系间表现出稳定差异。因此, 可以推断近等基因系间全部DNA 序列中
有差异的片段很少。在对部分引物的6次重复扩增试验中, 唯有O PAM 01引物能够稳定地在
rh t 系上多扩增出1条大小为1. 86 kb 的特异片段。由于这一结果的高度重复性, O PAM 011860
可以作为 rh t 基因紧密连锁的标记。至于O PAM 01的碱基序列是否就是 rh t 基因序列的一部
分, 现在还不能肯定, 也可能是 rh t 基因序列以外与其相距很近的一段DNA 序列。另外, 尽
管筛选了近300个引物, 但未能找到 R h t1、R h t2和 R h t3的RA PD 标记, 表明这三个基因及其
邻近区域的DNA 序列可能非常接近。
对于小麦来说, D evos 和 Gale[ 4 ]认为: 由于试验条件不同而引起的RA PD 标记具有多变
性、RA PD 标记的染色体位置很难确定以及RA PD 标记表现为显性等原因, 目前RA PD 标记
在构建遗传图谱方面还毫无价值。随后的一些研究工作也确实表明, 尽管RA PD 技术已经用
于绘制许多二倍体作物的遗传图谱, 但小麦的RA PD 图谱还未见报道。近几年, 许多研究都
成功地将RA PD 技术用于小麦[ 5～ 10 ]。但这些研究有两个明显特征: 一是利用RA PD 标记来识
别某一特定基因或较小外源染色体片段; 二是利用近等基因系来研究基因标记。本研究结果
与这些研究有相似之处, 就是成功利用近等基因系找到了 rh t 基因的 RA PD 标记。所有这些
意味着只要选取合适的试验材料, RA PD 技术在小麦某一特定基因标记和外源染色体片段鉴
定方面是很有用的。如果将RA PD 特异扩增片段克隆、测序, 标记成特异探针[ 7 ]或合成新的
特定引物[ 11 ] , 可以快速、大量鉴别有用基因或外源染色体。
参　考　文　献
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3244期　　　　　　　　　　郭北海等: 小麦株高近等基因系的RA PD 标记研究