全 文 ：RESEARCH ARTICLE
JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.35 No.1 2016
CHEN Xiaotian，et al： Extraction and Antimicrobial Activity Assay of
Bioactive Compounds from Chestnut Shell
Extraction and Antimicrobial Activity Assay of
Bioactive Compounds from Chestnut Shell
CHEN Xiaotian1， LI Junqing2， SONG Yuanda*1
（1. School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. Zhengzhou lvyetown
Technology Co. Ltd，Zhengzhou 450000，China）
Abstract： The bioactive component of chestnut shell and its inhibitory effect on the food-borne
microbes were studied，and preliminary test of its preservation function was carried out in a food
system. The chestnut shell crude extracts were separated by MCI column and the inhibitory effects
were investigated via agar diffusion method and macrodilution broth method on four bacteria and
two fungi. Column separation showed that the activity component of chestnut shell is hydrolysable
tannin，in vitro antimicrobial assay showed that chestnut shell tannin possesses a remarkable
antimicrobial activity against tested food-borne microbes including Escherichia coli，Staphyloccocus
aureus，Bacillus subtilis，Salmonella typhimurium，Aspergillus niger，Penicillium citrinum with the
minimum bactericidal concentration （MBC） values in the ranges of 0.062 5~2.5 mg/mL on bacteria
and 20~40 mg/mL on fungal spores，but with no inhibitory effect on fungal hyphae. Food
preservation experiment indicated that the chestnut shell tannins have a basically identical antiseptic
capacity than sodium benzoate in apple juice.
Keywords： chestnut shell，tannins，antimicrobial，MBC，apple juice
摘要： 研究了栗壳提取物中抑菌物质的主要成分及其对常见食品污染菌的抑制作用，并且在食
品体系中进行了初步防腐试验。以 MCI为填料，采用柱层析法对栗壳粗提物进行初步分离，采用
琼脂扩散法和常量肉汤稀释法考察栗壳提取物对 4 种细菌及 2 种霉菌的抑制作用。 结果表明，
栗壳提取物种主要抑菌成分可能为可水解单宁，栗壳单宁对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽
孢杆菌、沙门氏菌均有较明显的抑制作用，最低杀菌质量浓度为 0.062 5~2.5 mg/mL，对黑曲霉，
青霉孢子的最低杀菌质量浓度为 20~40 mg/mL，对霉菌菌丝无抑制作用。 食品防腐实验表明，同
等质量浓度的栗壳单宁对苹果汁的防腐效果与苯甲酸钠基本相同。
关键词： 栗壳；单宁；抗菌；最低杀菌浓度；苹果汁
中图分类号：S 664 文献标志码：A 文章编号：1673—1689（2016）01—0054—05
栗壳抑菌物质的提取及其抑菌作用的研究
陈晓天 1， 李俊卿 2， 宋元达 *1
（1. 江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2. 郑州绿叶堂本草科技有限公司，河南 郑州 450000）
收稿日期： 2014-08-29
基金项目： 国家自然科学基金项目（31271812）。
* 通信作者： 宋元达（1964—），男，江苏南通人，理学博士，教授，博士研究生导师，主要从事天然产物生物合成与提取研究。
E-mail：493375956@qq.com
研究论文
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研究论文
2016 年第 35 卷第 1 期食品与生物技术学报
陈晓天，等： 栗壳抑菌物质的提取及其抑菌作用的研究
栗壳为壳斗科植物栗 （Castanea mollissima
Blume）的外果皮，约占栗实质量的 10%，栗壳含有
酚类、有机酸、多糖、黄酮、内酯、香豆素、植物甾醇
和单宁等化学成分。 据联合国粮农组织统计，至
2009 年底，我国板栗产量约为 109 万吨，约占世界
总产量的 77%[1]， 但随之产生的板栗壳却未得到有
效利用，所以挖掘板栗壳的应用价值很有意义。
国际上，食品防腐剂正朝着安全、天然、营养、
多功能的方向发展 [2]，而目前在食品工业中却以苯
甲酸、山梨酸及其盐类和对羟基苯甲酸酯类的人工
合成防腐剂使用最为广泛， 但经长期研究发现，这
些人工合成防腐剂的超量和超范围使用对人体存
在一定的毒副作用及慢性伤害[3]。 周国燕等[4]发现栗
壳中的黄酮类色素对细菌和霉菌有一定抑制作用，
鲁晓翔等 [5]对板栗壳多酚的最佳提取工艺进行了探
讨，在料液质量体积比 1 g∶23 mL（30%乙醇溶液），
70 ℃水浴振荡提取多酚，得率可达 7.9%。 栗壳中含
有的酚类、有机酸、黄酮、单宁等化学成分具有作为
天然防腐剂开发的物质基础。
作者首先采用柱色谱法对栗壳的乙醇粗提物
进行了初步分离，发现主要抗菌物质可能为可水解
单宁。 在此基础上，选择了体积分数 50%丙酮提取
栗壳单宁，并进行了栗壳单宁对常见食品污染菌的
抑菌作用研究，为开发栗壳作为天然防腐剂提供了
理论依据。
1.1 材料与仪器
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆
菌 （Bacillus subtilis）、 金 黄 色 葡 萄 球 菌
（Staphyloccocus aureus）、 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌
（Salmonella typhimurium）、 黑 曲 霉 （Aspergillus
niger）、桔青霉（Penicillium citrinum）：江南大学生物
技术中心提供；MCI 柱（CHP20/P120）：三菱化学公
司产品。
ZHJH-1029C 垂直流超净工作台： 上海智城分
析仪器制造有限公司产品；GRP-9080 型隔水式恒
温培养箱 ： 上海森信实验仪器有限公司产品 ；
ZHTY-70 振荡培养箱： 上海知楚仪器有限公司产
品；RE-52C 型旋转蒸发仪：上海勒顿实业有限公司
产品；DFT-50 型高速万能粉碎机：上海新诺仪器设
备有限公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 栗壳抑菌物质有效成分的定性确定 取干
燥至恒重的板栗壳 20 g， 用 200 mL 体积分数 95%
乙醇于室温浸泡 24 h，提取 2 次，抽滤，蒸发后所得
浸膏用水溶解，上 MCI 柱，分别用 500 mL 水，体积
分数 10%、30%、50%、70%的甲醇溶液及无水甲醇
进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，进行抑菌实验。
对抑菌活性最强的洗脱液部位进行定性实验[6]，
初步明确抗菌物质种类。
1.2.2 栗壳单宁的提取 取干燥至恒重的粉碎后
栗壳 20 g，用 200 mL 体积分数 50%丙酮溶液[7]于室
温浸泡 24 h，浸提 2 次，抽滤，浓缩至干，于 4 ℃冰
箱保存。
1.2.3 抑菌实验
1）供试菌悬液的制备 将供试菌种活化后，细
菌于 37 ℃培养 12~18 h，真菌于 28 ℃培养 48 h，制
备初始菌悬液及孢子悬液。 以无菌生理盐水对菌悬
液进行稀释， 控制培养时细菌终浓度 5×105 cfu/mL，
真菌孢子浓度（0.4~5.0）×104 cells/mL[8]。
2）抑菌效力的评价 细菌：采用琼脂扩散法 [9]，
涂布菌液后用 6 mm 打孔器于培养基上打孔， 孔中
加入 100 μL 0.01 g/mL栗壳单宁提取液，于 37 ℃培
养 12 h，十字交叉法测量抑菌圈直径，以无菌水作
为对照空白对照，100 mg/mL 苯甲酸钠作为阳性对
照，重复 3 次，取均值。
真菌：采用生长速率法[10]，用打孔器取菌落边缘
生长旺盛的菌丝移入含有 10 mg/mL 提取物的查氏
培养基平板上，28 ℃培养， 待对照组菌落生长接近
培养皿边缘时，测定实验组菌落直径，计算抑制率，
重复 3 次， 取均值， 以无菌水作为对照空白对照，
100 mg/mL苯甲酸钠作为阳性对照。
菌丝生长抑制率=（对照组菌落直径-实验组菌
落直径）/对照组菌落直径×100%
3）最低杀菌浓度（MBC）的测定 最低杀菌浓
度测定采用常量肉汤稀释法，取含有 1 mL LB 液体
培养基的灭菌试管， 并取 1 mL 板栗壳单宁提取液
（已过滤除菌）1 mL加入第一支试管，混合均匀后从
中吸取 1 mL 加入第二支试管，再取 1 mL 加入第 3
支试管，依次类推，进行二倍稀释，最后一支试管中
取 1 mL 弃去， 制成含不同质量浓度栗壳提取液的
试管。
在上述含不同浓度提取液的试管中接种供试
材料与方法1
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Bioactive Compounds from Chestnut Shell
菌液及孢子悬液，细菌置于 37 ℃恒温箱中培养16~
20 h，霉菌于 28 ℃培养 3 d。取无明显浑浊的试管涂
布平板，于 37 ℃培养 18~24 h，无菌落生长的平板
对应的最低提取液浓度定义为最低杀菌浓度；观察
接种孢子悬液对应试管，无霉菌生长的试管对应的
提取液浓度定义为最低杀菌浓度。
1.2.4 苹果汁防腐实验 取新鲜苹果，洗净，去皮，
榨汁，分装于灭菌三角瓶中，每瓶 100 mL。向三角瓶
中加入质量浓度 0.05 g/dL的栗壳单宁提取液，对照
组加入 0.05 g/dL的苯甲酸钠， 分装于无菌试管中，
以苹果汁原液为空白对照，37 ℃下放置， 分别于
3，6，9，12，15 d测定菌落总数[13]，所有操作均在无菌
下进行，重复 3次[11]。
2.1 栗壳抑菌物质的确定
栗壳中抑菌成分为中高极性物质，MCI 柱为聚
苯乙烯基的反相树脂填料，主要用于分离中高极性
物质，将体积分数 95%乙醇栗壳粗提液装柱，用不
同体积分数甲醇进行洗脱， 浓缩并检测抑菌效果。
不同洗脱液部位对 4种供试菌的抑菌圈大小见表1，
其中 体积分数 30%甲醇洗脱液对 4 种供试细菌的
抑菌圈直径大于其它洗脱部位，抑菌效果最强，说明
主要抗菌物质集中于体积分数 30%甲醇洗脱液。
结果与分析2
表 1 不同洗脱液对细菌的抑菌圈直径
Table 1 Inhibition zone size by different eluent mm
大肠杆菌 6.0 6.5 19.5 9.2 10.1 6.0
枯草芽孢杆菌 6.0 6.3 20.3 8.7 7.4 6.0
金黄色葡萄球菌 6.0 6.7 13.4 7.5 6.9 6.0
鼠伤寒沙门氏菌 6.0 6.5 15.2 6.8 7.6 6.0
供试菌种 水
甲醇体积分数/%
0 30 50 70 100
对体积分数 30%甲醇洗脱液部位进行定性实
验，结果如表 2 所示，质量分数 1%三氯化铁溶液显
蓝黑色证明存在酚类物质； 明胶沉淀反应显阳性，
证明有单宁存在；饱和溴水、饱和石灰水及稀盐酸
共沸实验进一步证明所含单宁为可水解单宁，推测
栗壳中可水解单宁可能为主要抗菌成分。
表 2 体积分数 30%洗脱液定性实验结果
Table 2 30% methanol eluent qualitative results
注：“+”表示为阳性结果
2.2 栗壳单宁的提取
丙酮-水体系对单宁溶解能力最强， 能够打开
单宁-蛋白质的连接键，且与单宁无溶剂化作用，减
压蒸发易除去，提取效率高，是目前使用最普遍的
溶剂体系 [12]，所以在推测栗壳中主要抗菌成分为单
宁后，后续提取采用丙酮作为溶剂。 20 g 栗壳经体
积分数 50%丙酮-水提取后得 1.1 g 干浸膏， 得率
5.5%，配制 10 mg/mL的栗壳单宁提取液。
2.3 栗壳单宁抑菌实验结果
2.3.1 栗壳单宁提取液对细菌的抑制作用 以抑
菌圈直径和最低杀菌浓度（MBC）为评价指标，通过
琼脂扩散法及常量肉汤稀释法测定栗壳单宁对四
种供试菌的抑制作用，实验结果见表 3，可见 10 mg/
mL 的栗壳单宁提取液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、
金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果要强
于化学防腐剂苯甲酸钠。
2.3.2 栗壳单宁提取液对真菌的抑菌效果 以菌
丝生长抑制率和最低杀菌浓度（MBC）为评价指标，
通过生长速率法及常量肉汤稀释法测定栗壳单宁
对两种供试霉菌菌丝及孢子的抑制作用（表 4）。 实
验结果表明，10 mg/mL 的栗壳单宁对霉菌菌丝生长
无抑制作用；对黑曲霉、桔青霉孢子的最低杀菌浓
度为 40和 20 mg/mL，抑菌效果要弱于苯甲酸钠，说
明栗壳单宁提取物对霉菌的抑制效果较差。
反应条件 实验现象 结果分析
明胶沉淀 白色沉淀 +
质量分数 1%三氯化铁溶液 蓝黑色 +
饱和溴水 黄棕色沉淀
饱和石灰水 青灰色沉淀 +
稀盐酸共沸 暗红色沉淀
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研究论文
2016 年第 35 卷第 1 期食品与生物技术学报
陈晓天，等： 栗壳抑菌物质的提取及其抑菌作用的研究
表 3 栗壳单宁对 4 种细菌的抑制作用
Table 3 Inhibitory effect of chestnut shell tannin on 4 kinds of bacteria
供试菌种
抑菌圈直径/mm MBC/（mg/mL）
栗壳单宁 苯甲酸钠 无菌水 栗壳单宁 苯甲酸钠
大肠杆菌 22.2 16.5 0 2.5 4
枯草芽孢杆菌 19.5 13.6 0 2.5 2
金黄色葡萄球菌 11.6 18.2 0 1.25 4
鼠伤寒沙门氏菌 16.8 12.1 0 0.0625 1
表 4 栗壳单宁对 2 种真菌的抑制作用
Table 4 Inhibitory effect of chestnut shell tannin on 2
kinds of fungi
注：“—”表示无抑制作用。
2.4 苹果汁防腐试验
苹果汁在添加同等质量浓度下（0.05 g/dL）的栗
壳单宁与苯甲酸钠后，37 ℃下放置， 于3，6，9，12，15
d测定菌落总数（图 1）。 实验结果表明，同等质量浓
度下，栗壳单宁的抑菌效果与苯甲酸钠基本相同。
图 1 栗壳单宁对苹果汁的防腐效果
Fig. 1 Antiseptic capacity of chestnut shell tannins in
apple juice
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠
伤寒沙门氏菌以及黑曲霉、青霉是食品生产、加工
和储藏过程中常见的污染菌。 研究发现，栗壳中的
主要抗菌活性物质可能为可水解单宁。 栗壳单宁提
取物对常见食品污染菌均有一定的抑菌作用，其中
对细菌的抑制作用最显著，对 4 种供试细菌的最低
杀菌质量浓度为 0.062 5~2.5 mg/mL。 20~40 mg/mL
的单宁提取物对霉菌孢子的萌发有一定抑制作用，
而对霉菌菌丝生长则无抑制作用。
将栗壳单宁提取物应用于苹果汁中，发现在同
等质量浓度下抑菌效果与化学防腐剂苯甲酸钠基
本相同，表明栗壳单宁提取物具有作为天然食品防
腐剂的潜力[13]。
供试菌种
菌丝生长抑制率 MBC（mg/mL）
栗壳单宁 苯甲酸钠 栗壳单宁 苯甲酸钠
黑曲霉 - - 40 12.5
桔青霉 20 12.5
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结 语3
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CHEN Xiaotian，et al： Extraction and Antimicrobial Activity Assay of
Bioactive Compounds from Chestnut Shell
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Biology，2008，25（4）：4-6.（in Chinese）
会议名称(中文)： 第五届中国食品与农产品安全检测技术与质量控制国际论坛
开始日期： 2016-03-28 结束日期： 2016-03-30
所在城市： 北京市 朝阳区 具体地点： 北京国际会议中心
主办单位： 中国仪器仪表学会分析仪器分会 中国仪器仪表行业协会分析仪器分会 中国质量检验协会
会议主席： 陈洪渊院士 组织委员会主席： 刘长宽
联系人： 于健、蒋士强、刘长宽 联系电话： 010-82967491
E-MAIL： cfas@lanneret.com.cn
会议网站： http://www.cfaschina.com/
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