全 文 ： 超声波辅助水酶法提取蚕蛹油的工艺优化及脂肪酸组成分析
贾俊强1,2，吴琼英 3，杜金娟 3，桂仲争 1,2，颜辉 3
（1. 江苏科技大学 蚕业研究所，江苏 镇江 212018；2. 中国农业科学院 蚕业研究所，江苏 镇江 212018；
3. 江苏科技大学 生物与化学工程学院，江苏 镇江 212018）

摘 要 为了开发蚕蛹油提取新工艺，以蚕蛹为原料，采用超声波辅助中性蛋白酶水解法提
取蚕蛹油。在单因素试验的基础上，以蚕蛹油提取率为响应值，用响应面分析法研究了超声
波功率、底物浓度和加酶量对蚕蛹油提取率的影响，并通过气相色谱对蚕蛹油的脂肪酸组成
进行了分析。结果表明：各因素对蚕蛹油提取率影响从大到小依次为：底物浓度、加酶量、
超声波功率。超声波辅助水解法提取蚕蛹油的最优工艺条件为：底物浓度 68.2g/L， 超声波
功率 121.6W，加酶量 2849.4U/g。在此条件下，蚕蛹油提取率为 90.2%±0.66%。气相色谱
分析表明，超声波辅助水酶法与传统溶剂（正己烷）提取的蚕蛹油中脂肪酸组成与含量基本
一致，均主要由棕榈油酸、软脂酸、亚麻酸、亚油酸、油酸和硬脂酸组成。
关键词 超声波；水酶法；蚕蛹油；脂肪酸组成
中图分类号: TS224.4 文献标识码:A 文章编号:

Optimization of Ultrasonic-Assisted Aqueous Enzymatic Extraction and Fatty Acid Composition
of Silkworm Pupae Oil
JIA Jun-qiang1,2，WU Qiong-ying3，DU Jin-juan3，GUI Zhong-zheng1,2，YAN Hui3
(1. Sericultural Research Institute, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212018, China；
2. Sericultural Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhenjiang 212018, China；
3. School of Biotechnology and Chemical Engineering, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang
212018, China)

Abstract In order to develop new extraction process of silkworm pupae oil, ultrasonic-assisted neutral protease
hydrolysis (UANPH) was used to extract oil from silkworm pupae. On the basis of single factor experiment,
effects of ultrasonic power, substrate concentration and enzyme dosage on the extraction rate of silkworm pupae
oil, taking extraction rate of silkworm pupae oil as response value, were studied with response surface
methodology. In addition, fatty acid composition of silkworm pupae oil was analyzed by gas chromatography. The
results showed that the importance of three factors affecting extraction rate of silkworm pupae oil from big to
small was substrate concentration, enzyme dosage and ultrasonic power, in turn. The optimized processing
parameters were as follows: substrate concentration 68.2g/L, ultrasonic power 121.6W and enzyme dosage 2849.4
U/g. Under the optimal conditions, the extraction rate of silkworm pupae oil was 90.2%±0.66% in experimental
value. Gas chromatography analysis showed that composition and contents of fatty acids in silkworm pupae oils by
UANPH extraction and traditional solvent (hexane) extraction were in substantial agreement. The silkworm pupae
oils were mainly composed of palmitoleic acid, palmitic acid, linolenic acid, linoleic acid, oleic acid and stearic
acid.
Key words ultrasound; aqueous enzymatic extraction; silkworm pupae oil; fatty acid composition

蚕蛹是缫丝工业的主要副产物，其产量约占蚕茧干重的 60％[1]。在我国，每年大约有

收稿日期：
基金项目：江苏省自然科学基金项目（BK2012693）；江苏省科技支撑计划(BE2011389)。
作者简介：贾俊强 (1973-)，男，副研究员，博士，研究方向为生物资源开发与利用。E-mail：
junqiangjia2008@163.com
2014-03-26
1
网络出版时间：2014-03-28 15:29
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20140328.1529.021.html

50 多万 t 干蚕蛹产生[2]。据报道，蚕蛹中含量丰富的油脂，蚕蛹油在干蚕蛹中的含量约为
300mg/g，且不饱和脂肪酸含量高，高达 66.8％，主要由 α-亚麻酸、亚油酸类物质组成。这
些不饱和脂肪酸对动脉粥样硬化、糖尿病、高血压等疾病具有良好的辅助治疗作用[1,3]。因
此，开展蚕蛹油脂深加工是我国蚕桑资源开发研究的热点领域之一。
油脂提取常用的主要方法有压榨法、有机溶剂浸提法、超临界 CO2 萃取法和亚临界萃
取法等[4-7]。在这些油脂提取方法中，压榨法具有出油率低、劳动强度大、生产效率低、饼
粕蛋白易变性等缺点，有机溶剂浸提法易引起毛油色泽深、有机溶机残留等问题，超临界
CO2 萃取和亚临界萃取法则具有设备昂贵、不易操作和批处理量小等不足之处[8]。水酶法是
近年来开发出的油脂提取新技术，具有操作方便、无有机物残留、油料蛋白不易变性，易规
模化生产等优点，已被广泛用于油料作物中油脂的提取，如：葫芦籽油[9]、南瓜籽油[10]和油
茶籽油[11]等。迄今为止，利用水酶法提取蚕蛹油鲜见报道。本文利用超声波辅助水酶法提
取蚕蛹油，利用响应面法优化超声波辅助水酶法提取蚕蛹油的工艺，并通过气相色谱，比较
分析水酶法和传统有机溶剂提取法所得油脂中脂肪酸的组成，为蚕蛹油的开发利用提供理论
和技术支撑。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蚕蛹：中国农业科学院蚕业研究所提供，在 50℃烘干后用研钵研磨成粉末，过 60 目筛
后备用；中性蛋白酶（最适温度 50℃，最适 pH7.0，酶活力 50U/mg）：江苏维赛科技生物公
司；脂肪酸甲酯化标品：Sigma 公司；其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
KQ5200DB 型超声波提取器：昆山市超声仪器有限公司；DHG-9143BS 型电热鼓风干
燥器：上海新苗医疗器械制造有限公司；H205DR-1 型高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪
器有限公司；SSY-H 型恒温水浴锅：上海三申医疗器械有限公司；7820A 气相色谱仪：德国
Agilent 公司。
1.3 方法
1.3.1 蚕蛹油提取工艺流程
本文以中性蛋白酶作为水解用酶，研究超声波辅助水酶法提取蚕蛹油的工艺，具体工艺
流程如下：
蚕蛹 粉碎 用蒸馏水配成悬浮液 置于超声波清洗槽中 水浴温度升至
50℃ 加入中性蛋白酶 开启超声波 提取结束后 离心 吸取油层 脱
水 蚕蛹油
1.3.2 蚕蛹油提取率计算
提取率＝提取的蚕蛹油质量（g）/蚕蛹总脂肪质量（g）×100％
式中，蚕蛹总脂肪质量测定采用 GB /T 14772-2008 索氏抽提法。
1.3.3 蚕蛹油脂肪酸组成分析
1.3.3.1 蚕蛹油甲酯化处理
蚕蛹油甲酯化根据楼乔明等[12]报道的 BF3 -甲醇衍生法，略有修改。精确吸取 20mg 蚕
蛹油，加入 0.5 mol /L KOH -甲醇溶液 2mL，充分振荡后于 70 ℃水浴皂化 90 min，冷却后
加入 5mL 14％ BF3 -甲醇溶液于 70℃水浴甲酯化 90min，冷却后，加入 2mL 正己烷和 2mL
饱和 NaCl 溶液，取上清液，用正己烷定容至 5mL，供气相色谱分析。
1.3.3.2 气相色谱分析
采用 HP -5 石英毛细管柱( 30 m × 0.32 mm ×0.25 μm)，载气为氮气，FID 检测器，柱流
量为 1mL/min，进样量 1μL，不分流模式，进样口温度 270℃，升温程序: 起始温度 130 ℃
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2

保持 1 min，以 10℃/min 升温到 185℃，保持 20min，再以 5℃/min 升温到 220 ℃，然后以
30℃/min 升温到 270℃，保持 5 min。

2 结果与分析
2.1 超声波辅助水酶法提取蚕蛹油工艺优化
在超声波作用下，采用中性蛋白酶降解蚕蛹中的蛋白质，使蚕蛹油释放出来，最后分离
出蚕蛹油。研究单因素（超声波功率、加酶量、酶解时间和底物浓度）对蚕蛹油提取率的影
响，并通过响应面法确定最佳提取工艺条件。
2.1.1 单因素试验
2.1.1.1 超声波功率对蚕蛹油提取率的影响
在超声波频率 40kHz、酶解温度 50℃、酶解 pH7.0、加酶量 500U/g、酶解时间 30min
和底物浓度 50g/L 的条件下，研究不同超声波功率对蚕蛹油提取率的影响，结果如图 1 所示。
由图 1 可以看出，在中性蛋白酶酶解过程中施加超声波处理后，蚕蛹油的提取率明显高于未
施加超声波组（功率 0W），且随着超声波功率的增加，蚕蛹油提取率快速上升，在超声波
功率 120W 时达到最高。这与超声波处理能够增加酶解底物与蛋白酶的碰撞频率有关[13]，
酶解底物与蛋白酶碰撞频率的增加，导致了蚕蛹蛋白酶解反应加快，使油脂从蚕蛹组织中充
分释放出来。当超声波功率大于 120W 时，蚕蛹油的提取率反而有所下降，原因可能是高功
率超声波引起了中性蛋白酶活性部分丧失[14]，使酶解反应减慢，最终导致蚕蛹油提取率下
降。
60
70
80
90
0 80 100 120 140 160
功率 / W
提
取
率
/
％

图 1 超声波功率对蚕蛹油提取率的影响
Fig. 1 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of silkworm pupae oil
2.1.1.2 加酶量对蚕蛹油提取率的影响
在超声波频率 40kHz、功率 80W、酶解温度 50℃、酶解 pH7.0、酶解时间 30min 和底
物浓度 50g/L 的条件下，研究不同加酶量对蚕蛹油提取率的影响，结果如图 2 所示。由图 2
可知，蚕蛹油提取率与加酶量呈现正相关性，随着加酶量的增加，蚕蛹油提取率快速增加，
这是由于加酶量增大引起蚕蛹蛋白水解程度增加，促进了蚕蛹油释放。当加酶量在 2500U/g
以上时，蚕蛹油提取率增幅变缓，这表明加酶量在 2500U/g 时，蚕蛹蛋白几乎已达到最大水
解，提高加酶量对蚕蛹蛋白的水解程度影响不大，故油脂提取率变增幅不大，这一现象与加
酶量对葫芦籽油提取率的作用结果基本一致，随着加酶量的增加，葫芦籽油提取率先迅速增
加后趋于恒定[9]。
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3
70
75
80
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90
500 1000 1500 2000 2500 3000
加酶量 / U/g
提
取
率
/
％

图 2 加酶量对蚕蛹油提取率的影响
Fig. 2 Effect of enzyme/substrate on the extraction rate of silkworm pupae oil
2.1.1.3 酶解时间对蚕蛹油提取率的影响
在超声波频率 40kHz、功率 80W、酶解温度 50℃、酶解 pH7.0、加酶量 500U/g 和底物
浓度 50g/L 的条件下，研究不同酶解时间对蚕蛹油提取率的影响，结果如图 3 所示。由图 3
可知，酶解时间对蚕蛹油提取率的影响较小，随着酶解时间的进行，蚕蛹油提取率缓慢增加，
在酶解 130min 时，蚕蛹油提取率为 82.5％，仅比酶解 30min 的蚕蛹油提取率（79.1％）提
高了 4.3％。原因可能是酶解 30min 前，蚕蛹蛋白酶解反应速度快，加速了蚕蛹油释放，当
酶解 30min 以上时，酶解反应因底物减少以及产物抑制等因素使酶解反应达到平衡，蚕蛹
油提取率增幅变缓[9]。
70
75
80
85
90
30 50 70 90 110 130
酶解时间 / min
提
取
率
/
％

图 3 酶解时间对蚕蛹油提取率的影响
Fig. 3 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of silkworm pupae oil
2.1.1.4 底物浓度对蚕蛹油提取率的影响
在超声波频率 40kHz、功率 80W、酶解温度 50℃、酶解 pH7.0、加酶量 500U/g 和酶解
时间 30min 的条件下，研究不同底物浓度对蚕蛹油提取率的影响，结果如图 3 所示。由图 3
可知，随着底物浓度的增加，蚕蛹油的提取率先增后减，这与水酶法提取葫芦籽油[9]、橡胶
籽油[15]和红花籽油[16]中底物浓度对油脂提取率的影响趋势基本一致。这主要因为随着底物
浓度的增加，底物与蛋白酶接触频率增加，酶解反应速度加快，促使蛋白快速降解和油脂溶
出；然而，当底物浓度过高时，则由于反应体系粘度增大，蛋白酶与底物接触反而受阻，酶
解反应速度下降，蛋白降解和油脂的溶出受阻。
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70
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90
10 30 50 70 90 110
底物浓度 / g/L
提
取
率
/
％

图 4 底物浓度对蚕蛹油提取率的影响
Fig. 4 Effect of substrate concentration on the extraction rate of silkworm pupae oil
2.1.2 响应面法优化
在单因素试验基础上，固定酶解时间为 30min，采用 Box-Behnken 中心组合设计原理，
以蚕蛹油提取率为响应值，选取底物浓度、超声波功率和加酶量进行三因素三水平的旋转正
交试验设计。响应面试验的因素水平设计见表 1。Box-Behnken 设计方案共有 15 次试验，
试验结果见表 2。
表 1响应面试验因素水平设计
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
因素 编号 水平
-1 0 1
底物浓度 / g/L X1 60 70 80
超声波功率/ W X2 110 120 130
加酶量/ U/g X3 2000 2500 3000

表 2 Box-Behnken 设计和试验结果
Table 2 Design of Box-Behnken and experimental results
编号
因素 提取率 / %
Y X1 X2 X3
1 -1 0 -1 83.9
2 0 -1 1 86.8
3 1 -1 0 80.3
4 -1 0 1 87.1
5 1 0 -1 78.3
6 -1 1 0 83.6
7 0 -1 -1 82.4
8 0 0 0 89.1
9 1 1 0 80.6
10 0 1 1 90.3
11 -1 -1 0 85.0
12 0 0 0 89.6
13 1 0 1 82.8
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14 0 1 -1 85.6
15 0 0 0 90.9

2.1.2.1 模型建立及显著性检验
采用 Design Expert 7.1.3 统计软件对表 2 试验数据进行多元回归拟合，建立油脂提取率
（Y）与底物浓度（X1）、超声波功率（X2）和加酶量（X3）之间的响应面回归模型为：Y =89.87
– 2.20X1 + 0.70X2 + 2.10X3 +0.43X1X2 +0.33X1X3 + 0.08X2X3 – 5.37X12 – 2.12X22 – 1.47X32（X1、
X2、X3 为各因素水平的编码数）。响应表面回归模型的方差分析见表 3。从表 3 可以看出，
X1、X3、X12 对蚕蛹油提取率的影响极显著（P<0.01），X22 对蚕蛹油提取率的影响较显著
（P<0.05），X2、X1X2、X1X3、X2X3 和 X32 对蚕蛹油提取率的影响不显著（P>0.05），表明提
取率（Y）与底物浓度（X1）、超声波功率（X2）和加酶量（X3）之间为非线性关系。另外，
从表 3 也可以看出，各因素对蚕蛹油提取率影响大小顺序为：底物浓度（X1）>加酶量（X3）>
超声波功率（X2）。该模型回归极显著（P<0.01），失拟项 P＝0.2433，差异不显著（P>0.05），
并且该模型决定系数 R2为 95.15%，调整后决定系数 RAdj2为 86.42%，变异系数为 1.68％，
说明该模型拟合精确、可信，可用于分析和预测水酶法提取蚕蛹油的情况[17]。
表 3 响应表面回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression parameters for the response surface model
来源 自由度 平方和 均方 F值 P值
模型 9 199.70 22.19 10.90 0.0085
X1 1 38.72 38.72 19.01 0.0073
X2 1 3.92 3.92 1.93 0.2240
X3 1 35.28 35.28 17.33 0.0088
X1X2 1 0.72 0.72 0.35 0.5773
X1X3 1 0.42 0.42 0.21 0.6678
X2X3 1 0.022 0.022 0.011 0.9204
X12 1 106.51 106.51 52.30 0.0008
X22 1 16.61 16.61 8.16 0.0356
X32 1 7.99 7.99 3.92 0.1045
残差 5 10.18 2.04
失拟项 3 8.46 2.82 3.26 0.2433
纯误差 2 1.73 0.86
总和 14 209.88
注： 变异系数1.68％；决定系数R2 95.15％；调整后决定系数RAdj2 86.42％。

2.1.2.2 最优工艺条件确定及验证
采用 Design Expert 7.1.3 统计软件作出底物浓度（X1）、超声波功率（X2）和加酶量（X3）
两两之间的响应曲面图见图 5、图 6 和图 7。
从底物浓度（X1）与超声波功率（X2）对蚕蛹油提取率的响应曲面（图 5）可以看出，
底物浓度（X1）与超声波功率（X2）之间存在交互作用。随着底物浓度和超声波功率的增加，
蚕蛹油提取率逐渐升高，但当底物浓度和超声波功率增加到一定值后，蚕蛹油提取率却随着
底物浓度和超声波功率的增加而下降。因此，在加酶量不变的情况下，底物浓度（X1）与超
声波功率（X2）对蚕蛹油提取率的响应曲面存在极值，在底物浓度 65～70g/L 和超声波功率
120～125W 范围内，蚕蛹油提取率较大。
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6

从加酶量（X3）与底物浓度（X1）对蚕蛹油提取率的响应曲面（图 6）可知，加酶量（X3）
与底物浓度（X1）之间存在交互作用。随着底物浓度和加酶量的持续增加，蚕蛹油提取率先
逐渐升高到一定值后，又呈下降的趋势。因此，在超声波功率不变的情况下，加酶量（X3）
与底物浓度（X1）对蚕蛹油提取率的响应曲面存在极值，在底物浓度 65～70g/L 和加酶量
2500～3000U/g 范围内，蚕蛹油提取率较大。
从超声波功率（X2）与加酶量（X3）对蚕蛹油提取率的响应曲面可知（图 7），超声波
功率（X2）与加酶量（X3）之间存在交互作用。随着超声波功率（X2）与加酶量（X3）的增
加，蚕蛹油提取率先增后减。在底物浓度不变的情况下，超声波功率（X2）与加酶量（X3）
对蚕蛹油提取率的响应曲面也存在极值，在超声波功率 115～125W 和加酶量 2500～3000U/g
范围内，蚕蛹油提取率较大。


图 5 超声波功率与底物浓度对蚕蛹油提取率的响应曲面
Fig. 5 Response surface for interaction effects of ultrasonic power and substrate concentration on the
extraction rate of silkworm pupae oil

图 6 加酶量与底物浓度对蚕蛹油提取率的响应曲面
Fig. 6 Response surface for interaction effects of enzyme/substrate and substrate concentration on the
extraction rate of silkworm pupae oil

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7

图 7 超声波功率与加酶量对蚕蛹油提取率的响应曲面
Fig. 7 Response surface for interaction effects of ultrasonic power and enzyme/substrate on the extraction
rate of silkworm pupae oil

综上所述，由于底物浓度（X1）、超声波功率（X2）和加酶量（X3）两两之间的响应曲
面均存在极值。因此，可以通过对二次回归的数学模型取一阶偏导获得最优试验条件[18]，
确定 X1＝-0.17695，X2＝0.16033，X3＝0.69879；最终得到最优蚕蛹油提取条件为：底物浓
度 68.2g/L， 超声波功率 121.6W，加酶量 2849.4U/g。在此条件下，蚕蛹油提取率预测值为
90.9％，对以上最优提取条件进行验证试验，经 3 次平行试验，蚕蛹油提取率分别为：90.8%，
89.5%, 90.3%，平均值为 90.2%±0.66%。验证结果与理论预测值接近。表明预测值和真实
值之间有很好的拟合性，进一步验证了模型的可靠性。

2.2 超声波辅助水酶法提取的蚕蛹油脂肪酸组成分析
为了研究水酶法提取对蚕蛹油脂肪酸组成的影响，以传统有机溶剂提取的蚕蛹油为对
照，利用气相色谱分析蚕蛹油中的脂肪酸组成（图 8），利用面积归一法获得蚕蛹油中各脂
肪酸的相对含量如表 4 所示。由表 4 可知，水酶法与正己烷提取的蚕蛹油的脂肪酸组成基本
一致，无明显不同，均主要含有棕榈油酸、软脂酸、亚麻酸、亚油酸、油酸和硬脂酸。亚油
酸和亚麻酸为人体必需脂肪酸，不仅具有极高的营养价值而且具有良好的药理功能[1,3]。与
正己烷提取相比，通过超声波辅助水酶法提取的蚕蛹油不仅不饱和脂肪酸含量略高，且色泽
亮黄，气味纯正。另外，超声波辅助水酶法提取蚕蛹油的操作方便，易于工业化生产，因而
具有潜在的应用前景。


A B
图 8 不同方法所得蚕蛹油甲酯化的气相色谱图（A：正己烷提取；B：超声波辅助水酶法提取）
Fig. 8 Gas chromatogram of methyl ester of silkworm pupae oil from different extraction methods
(A：Hexane extraction；B：Ultrasonic-assisted aqueous enzymatic extraction)

表 4 不同方法所得蚕蛹油脂肪酸的相对含量
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8

Table 4 Relative content of fatty acid of silkworm pupae oil from different extraction methods
峰编号 名称 化学式
相对质量分数/ ％
正己烷提取 超声波辅助水酶法提取
1 棕榈油酸 C16:1 C16H30O2 2.67 2.72
2 软脂酸 C16:0 C16H32O2 18.61 17.96
3 亚麻酸 C18:3 C18H30O2 25.12 25.85
4 亚油酸 C18:2 C18H32O2 6.12 6.93
5 油酸 C18:1 C18H34O2 34.85 34.20
6 硬脂酸 C18:0 C18H36O2 5.80 5.69

3 结论
3.1 采用响应面分析法优化了超声波辅助中性蛋白酶酶解法提取蚕蛹油的工艺，各因素对蚕
蛹油提取率影响的大小依次为：底物浓度>加酶量>超声波功率；确定最优工艺条件为：底
物浓度 68.2g/L， 超声波功率 121.6W，加酶量 2849.4U/g。在此条件下，蚕蛹油提取率为
90.2%±0.66%。
3.2 超声波辅助水酶法与正己烷提取的蚕蛹油中脂肪酸组成与含量基本一致，均主要含有棕
榈油酸、软脂酸、亚麻酸、亚油酸、油酸和硬脂酸；因此，超声波辅助水酶法是一种绿色、
高效和安全的提取油脂方法，具有潜在的应用前景。

参考文献

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