全 文 ：植物生理学报 , 19 90 , 1 6 ( 2 ) : 2 0 1一 205
A ` at P hy t oP勺痴log t’ca 丁动 ,’ca
载有首蓓根瘤菌巨型质粒的死豆根瘤菌侵染首蓓根瘤
的形态
王常霖 郭一松 陈一 新
(中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 ZOCO 3 2)
关健词 : 豉豆根瘤菌 , 首偕根瘤 , 生物固氮
生物固氮的过程是把大气氮素还原为
氨 , 为植物生长提供有效的氮素营养 。 在
共生固氮过程中 , 根瘤菌与豆科植物共生
有着较为严格的宿主专性关系 , 如首猎根
瘤菌只诱导首楷植物结瘤固氮 , 豌豆根瘤
菌只诱导豌豆植物结瘤固氮 。
近年来的研究 (K o n d or is 1 9 84
,
B at ut
等 1 9 8 5 , H邓 e s 1 9 5 0 ) 已经表明 , 大多
数首楷根瘤菌中带有两个巨型质粒 , 其中
一个分子量较小的质粒上带有与胞外多糖
有关的基因 , 而另一个分子 量 大 于 1 0 0 0
k b 的巨型质粒上则带有全部有效结 瘤 基
因 , 包括固氮酶结构基因和调节基因在内
的大部分固氮基因 , 因而被称作巨型共生
质粒 。 在三叶草根瘤菌以及农杆菌中转入
首蓓根瘤菌的巨型共生质粒可诱导首蓓植
物形成根瘤状的组织 (W o n g等 19 83 , H
i r s e h 和 S m i t h 10 5 7 ) 。 我们认为在异源根
瘤菌中调查结瘤固氮基因在不同发育阶段
的表达程度 , 对研究扩大共生固氮范畴有
着潜在的意义 。 本文中 , 我们将首稽根瘤
菌中的巨型共生质粒通过转座子 T n 6标记
和诱导转移的方法 , 导入愈豆根瘤菌中 。
从形态和显微结构上调查异源根瘤菌不能
诱导有效固氮首楷根瘤的发育障碍 阶段 。
豆根瘤菌 R . s P . A入 U 2 80 是菌侏 N G R 2 3 4 抗 链
霉素和利福平 s( m 一 r , R i` r ) 的 变 种 ( C hc n 等
19 8 8 )
,其专性宿主是大翼豆 ( s i r a t r o )等 , 而不能
诱导首蓓 ( al fa l fa )结瘤固氮 。杂交菌株 2 8 31 是导
入首着根瘤菌巨型共生质粒的可豆根瘤菌 R . sP ·
A N U Z s o / PR
m S YM
。
2 8 3 1 /双仇”办 P , 28 3 1 /R。 -
P l和 2 831 / Rm P Z 分别是菌株 28 31 中转入有用固
氮酶调节基因 n办 启动子和固氮及固氮酶结构基
因启动子 ( P l , P 2) 推动 少 半 乳糖曹酶表达基因
的融合子 (D it at 等 19 87 ) 。其它菌株和质粒 , 以及
细菌培养条件和杂交菌株的筛选方法同前 (W a n g
和H ir s e h 19 88 ) 。
豆科植物的毅培 除了植物生长 在 3 x 18 c m 试
管的 1 %琼脂斜面上 以 外 , 其 它 条件 均 同前
(W
a n g 等 198 6 ) 。
光学显徽镜及电子显橄镜观案 根瘤用戊 二 醛一
饿酸双固定。 乙醇 脱水 后 , 用 E p o n 包 埋 , 在
L K -B 1 型超薄切片机上切片 , 用柠檬酸铅一醋酸
铀双染色。 然后 , 在 J E O L 一 l o C X I 型电子 显
微镜 ( 8 0 k v 电压 )下观察并拍照 。 另一部分据瘤
用戊二醛固定 , 用 X Y一 86 型振动切片机切片 (5 0
川 , 在 O L Y M P u s光学显微镜下观察摄影 。
结 果 与 讨 论
材 料 与 方 法
细菌菌株和杂交子的获得 首着根瘤 菌 R m 1O2 1
是带有巨型共生质粒的有效 固 氮 根 瘤 菌 菌 株
( M
e a
d
e 等 295 2 ) 。野生型首着根瘤菌R m F 3 4中带
有 R二 n办卜 L a e Z 融合 子 ( D it t a 等 198 7 ) 。 可
首箱根瘤菌巨型共生质拉的 T n 6 诱变及诱
导转移
用转座子 T sn 在首楷根瘤菌 R m 10 2 1
中的随机插入诱 变 方 法 同 前 (W a n g 和
H ir sc h 198 8)
。 筛选获得的卡那霉素抗性
菌株经过分离纯化后 , 用来与诱动转移因
子 R 4P 谁 , 以及受体就豆根瘤菌进行三亲
1 98 9年 6月 20 日 .改到 .
博士后科学基金资助项目。
植 物 生 理 学 报 1 6卷
杂交 (t r iPr e an t al e r o s s e s )。 在约 x八o 的杂
交组合中 , 首稽根瘤菌巨型共生质粒可以
在种族间根瘤菌中转移 , 这一结果同时为
琼脂糖电泳证实 。 从这些组合中纯化分离
获得的杂交子 , 以及其相对应的父本菌株
( R
. 阴 e il lo it 10 2 1) 同时用来诱导首楷植物
形成根瘤 , 从亲本菌株侵染形成固氮根瘤
、的有效程度确定 T n s 在 p Rm s y瓜1 .上的插
入位置无损于首蓓结瘤固氮基因的表达 。
在选出的六株斑豆根瘤菌杂交 子 中 ,
菌株 2 8 31 可诱导近 90 %的首楷植物结瘤 ,
因而选用作本试验的出发菌株 。
可豆根瘤菌杂交子诱导首落根瘤在形态上
的差异
图版 I 一 A 展示了不同根瘤菌诱导的
首楷根瘤在形态上的差异 : ( l )由野生型
首楷根瘤菌 R , F 3 4 诱导的首猎根瘤 , 在
接种根瘤菌后 5 一 7 天内开始形成可见根
瘤 , 并在随后的 2 ~ 3天内开始固氮 。 成
熟根瘤为长椭圆型 , 约 3~ 5 m m 带淡红
色 , 着生部位以主根为主 。 ( 2 )导入首楷
根瘤菌巨型共生质粒的丈豆根瘤菌杂交子
诱导的首楷根瘤全部为无效根瘤 , 即表型
为 No d切i r 。 这些根瘤一般都在 10 天以
后出现 , 乳白色 ; 根瘤个体小 , 大多数在
1 ~ 3 m ln 之间 , 多呈不规则形 态 , 有 时
簇生 , 4 ~ 5 个根瘤堆在一起 ;着生位置以
侧根为主 。 这与首楷根瘤菌的 n以’A 缺陷型
菌株诱导的根 瘤 相 似 (H i sr hc 和 S m it h
1 9 8 7 , S h e n 等 19 5 9 ) 。 由这些杂交菌株
接种的首楷植株生长矮小 , 一般在 4 ~ 5
周后由于氮饥饿而枯萎死亡 。
可豆根瘤菌在导入首蓓根瘤菌巨型共
生质粒以后 , 不影响对本身宿主大翼豆的
有效结瘤固氮特性 。 表明带有两套固氮基
因的共生质粒不属于同一不相容组 , 能够
同时共存 , 并各 自对相应本身宿主植物作
出结瘤反应 (见图版 I 一 B , C ) 。
虹豆根油菌杂交子诱导首楷根瘤的显微结
构
不同根瘤菌诱导生成首楷根瘤的显微
结构如图版 I 和 l 所示 。 野生型首拾根瘤
菌诱导的成熟根瘤中 , 分生组织和含菌组
织之间的区域明显形成 (见图版 I 一 D ) 。
含菌根瘤细胞中的类菌体充分发育 , 形成
完整的细胞周膜 , 有效固氮时期长 (见图版
l 一 B I ,B 幻 。本试验采用 n私启动子推动的
压半乳糖昔酶测定数据表明 , 其诱导活力
在 24 0 个单位以上 , 高于对照 1 0 倍 。 对比
在这些由杂交菌株诱导的无效根瘤中 , 根
瘤的内部结构发育很不完全 。 分生细胞的
区域大 , 细菌的感染区域小 , 且含菌细胞少
(图版 I 一 E ) 。 植物根瘤细胞中的细胞核很
突出 , 有时充满大半根瘤 细 胞 (图版 I -
A l)
, 细胞内有许多线粒体 (图版 I一 4)
及淀粉粒的积累 (图版 I一 l , A 3) , 分散在
细胞内的类菌体数量相对较少 ,个体小 。 并
且 ,在类菌体的转化还没有完成时 , 类菌体
的细胞周膜 已经破损并开始降解 (图版 I -
A Z
,
A 3
,
A 4)
, 大量研究 已经表明固氮基因
n笼fA 受氧调节 , 固氮酶又具有氧敏感性 , 这
些氧的调节都归功于类菌体周膜的天然屏
障 , 以及位于周膜上的豆血红蛋白 , 从而保
证了固氮作用的进行 。 细胞周膜的破损使
得 n扩人失活 , 进而使得结瘤有效基因 O飞fe )
( San ju
a n 和 O li v ar e s 1 9 8 9 )和固氮基因表
达处于抑制状态 。 这一结论 已经在下列试
验中得到证实 。 在调查 n夕if7 x 基因的调节
和表达试验中 , 由首楷根菌瘤固氮及固氮
酶结构基因启动子 ( r l , P Z )和调节基因启
动子 n犷勺 带动的庄半乳糖昔酶融合子 ,
在杂交菌株 2 8 31 诱导的首蓓根瘤中基本上
都不表达 。 另一方面 , 在斑豆根瘤菌本身宿
主大翼豆的根瘤中 , n犷 A P处于抑制状态 ,
而 P I / P Z则处于激活状态 。 有关固氮基因
在异源根菌瘤中调节的研究将另文报道 。


1 期 载有首着根瘤菌巨型质粒的可豆根瘤菌侵染首着根瘤的形态 2 05
嗽谢: 本所陈汉才博士提 供就 豆 根 瘤 菌菌 株
人N U2 80 及其植物宿主大翼豆种子 , 同 时 , 得
到分子遗传生理组同志的热心帮助。
参 考 文 献
j
B a t u t J
,
eT 段 a g h i B , G h e ar d i M , eT r z a g hi E ,
G a r n e or n e A M
,
OB i
s
at
r d P
,
H u gu
e t T
.
oL
e a -
l让 a t i o n o f a s y m b io t ic 沂x r e g io n o n R hiz o biu 二
me li le t玄 P之, 川 m ge aP la s m id om er th
a n ZX() k i
-
Io ab
s es ofr m ht
e n o -d n扩 r e g io n . 人了dl eC n
倪刀` t ` 1 9 8 5, 19 : 2 3 2一 2 3 9
`
C h e n H
,
G r ay JX
,
N
a y u d u M
,
jD
o
drj
e v ie M A
,
B a t l e y M
,
R
e d m
o n d JW R
o lfe B G
.
iF v e
ge
n e t i e lo e i i
vno
lve d i n t h
e s
yn t h巴 15 o f a e id i e
ex
o P o ly s a e e h a r i d e s a r e e lo s e ly l in k e d in t h e
g e n o
me
o f R hf z o b fu m sP
.
s tr a in N G R 2 3 4
.
五如1 eC n 、 eC ne t 1 9 8 8 , 2 1 2 : 3 10一 3 16
,
iD tat G
,
iV
r 坛 E , aP lo m a esr A
,
K i m C H
.
T h e
月洲 g e n e o f hR iz o bi二 , 儿 le t云i: o x y g e n r e gu la -
et d
. 了 B a c衍痴 1 19 8 7, 1 6 9 : 3 2 17一 3 2 23
卜壬U玲ch A M , Sm iht C A . E fe e t s o f R h玄z o bi u m 沁 -
五eI t i n扩 a n d万x m u t a n t s o n a l fa lfa or o t n o d ul e
d ve
e lo Pm e n t
. 了 B a c纪 ior l 1 9 8 7 , 169 : 1 1 3 7一
1 1 4 6
肚 y n es M F , S i m o n R , M u l le r 几 N ie h a u 吕 K , aL d es
M
,
P u h l e r A
.
T h e two me ga P l as而ds of
石场云之口石ium me liOI t i a er i n v o lv e d in t h e e价 e t iv e
n o d u la t i o n o f a l fa l fa
. 五如 1 eG n eG en t 19 8 6 ,
加 2 : 3 5 6一3 6 2
K o n d o or is E
,
aB
n fa vl i Z
,
K
o n do osr i A
.
P h y
.
s ica l a dn ge n
e t i e a an 娜15 of a s丫m b io t ic r ge io n
o f R ihz
o西细成 me l云dlo ; i den t iif e at io n of n o d ul a iot n
g e n es
. 刀为 I eG 月 肠忍才 198 牛, 1 93 : 科 5一45 2
M
e a
de H M
, 助眼 S R , R vu kun G B , B or w n S E ,
A us u b e l F M
.
Ph外 ie a l a n d g e en it e e ha ar c t e .
r i z a t io n o f s y m b i o t i e a n d a ux
o t or P h ie mu
at n st
of hR iz
o石扭m m e红oI t云 i dn uc e d b y t ar sn op s o n
T n s m u t ag
e
en
s is
.
J B
a c幼痴 1 19 8 2 , 149 ,
1 14一 12 2
S
a
nj au n J
,
O li va er
s
J
.
Im P li ca t io n of
。洲 运 -er
, l
a t i o n o f g e n e s l o e at e d o n a hR iz
o西f u m ~
l i l o t i c r冲 t i e P l as m id t ha t a价 e t n o d u la t io n
e if e i e n伴 . J 彻 e介 ior l 1 9 8 9, 17 1 : 4 15斗盛 1 6 1
S h e n S C
, 、V a n g S P , Y u G q , Z hu J B
.
xE p
r es
·
s i o n of t h
e n o d u la t ion
a n d n i t r o g e n 石x a t io n
g e n e s in hR i动吞抽m 柑 l ilo it dur in g d e ve lo P .
m e n t
.
eG
n o
e)n 19 8 9
: 3 1 : 3 5斗一 3 60
W
a n g C L
,
B e ir n罗 r J E , H i sr e h P R . H o s t P h n t
e价 e st o n h y b r ids o f hR iz o biu 沉 奋考帅滋肋`口~
b io v a r o ice ae
a n d t r如 1 . J eG , 翔阶仰b汉
19 8 5
,
1 3 2 : 20 6 3一20 7 0
M怡n g C L , H i sr e h PR , M u t a t i o n , atr n s fer a n d l小
ca t i
o n o f s y l l l b io t i e g e n e : o f hR i
z o西i u m 肠即 m i-
彻拟 、 m b i vo a r 户五a se o il b y in s e r t io n o f T n -s
M
o b
.
hC in J eC ne
t 19 8 8
,
1 5 : 2 3一 3 2
认尸。 n g C H , P a n k h u sr t C E , K o dn o r o s i A , B or u g h ·
t o n W J
.
M
o 甲h o lo g y o f r o o t n o d u le s a nd
n o d u l e
一
l ik e s t r u e t ur
e s
fo mr
e d b y hR i
z o b自Jm
an d 月考or b a cet ~
s tar 油 co n at in i n g a 瓜-otz
b iu m 二 il lo t i m e g a p la s m id . J ce ll B io l 19 8 3 ,
9 7 : 78 7一 79 4
玉度0印h ol o盯 o f却 fal fa N o d记 e s l到比ct e d b y R h衍。占翅 m s p . S t r a运
C o n t a i创泌 9 A R . 娜 e l滋勿 lt’ M eg aP la s m i d
W A N G C il
a n g一 L i n , G U O Y i一 S o n g a n d C H E N Y i- x i n g
(力” 瓦ut 细 of P 勿, t P勺俪 0109 为 A ca 山。 认 5 1 , ica , Sha n g h a , 2 0 0 0 3 2 )
oC w P
o a
hR 泛 o b艺u 份 s t r a i n A N U 28 0 e o n t a -
i n i n g a sy m b i o t i e m
e g a p l as m i d
o r i g in
a t e d fr
o
m
.R 旅 li lo t i~ 匆 u n d
e
aP
a
b l
e o
f fo mr i
n g n
o
d ul
e -
l ik e s tur
e tu r es o n a lfa lfa e x e e P t ht
e i n fe e t i o n
。 n i st o w n h os t o f s i r a t r o
.
T l
l e s e n o d u l
e s a r e
d i价 er n t fr o m ht o se e fe e t iv e n o d ul e s i n d u e e d
by R
.
m e l i lo t i
. 刀飞e y we r e sm a ll e r a n d d is P e r ·
s e
d o n l
a t e ar l or
o st 仿e e lP a t e l ~ , A ) . 飞五 e
n o d lu
e s t
cur
tu r e s w
e r e l ar g e ly e o m Po
s e
d o f
m
e r i s t e m
a t i e e e lls w iht a
s卫似 l e r : ” 叮 b i o t i e
On e s( e e lP a t
e
J
.
- E )
.
N O d川 se w er i二 e乐
e e t iv e
, e o n t a i n e d e l o n g a t e d b a e t e r o id s w i thi n
ht e h
o s t c e ll
s
(
s e e
p l
a t e l 一八卫, A 3 , 4A )
, 加 t
ht e b a e t e
r o i d s q u i e kl y : e n e s e e d an d w
e
er d
e兮
ar d e d
.
S t u d i e s w i th th e c on
s t
ur
e t s o f R m
n口A P , R o p l a n d R m p Z b y p or m o t e r le s aL e Z
g en
e
fus i
o n hs
o
w
e
d th 、 t R m n口A g e n e , w h i hc
w
e r e n o t e x P r e s s e d i n ht e h
e t e or l o g o us R从2 -0
b i u m s t ar in AN U 2 80
,
m i gh t b
e er s P o n s i b l e fo r
ht e a b n o
r m a l m
o甲h o lo gy o f al afl af n o d ul e s .
K e v w o r d s : co w碑 a R石之口b iu勿 , a l af l af n叼 u l es ,
D i t r o ge
O if x at 王。