全 文 ：微生物学通报 Jun. 20, 2013, 40(6): 10081017
Microbiology China © 2013 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn
基金项目：国家自然科学基金项目(No. 30970083)
*通讯作者：高俊莲: Tel: 86-10-51503834; Fax: 86-10-51503834; : gaojunlian@baafs.net.cn
孙建光: Tel: 86-10-82108701; Fax: 86-10-82106239; : jgsun@caas.ac.cn
收稿日期：2012-09-05; 接受日期：2012-11-13
研究报告
苜蓿根瘤菌 17560细胞膜膜脂组成分析及
DGTS合成基因克隆与表达
刘华伟 1,3 马晓彤 2 王旭明 1 李秀爱 1 邹小琳 1 孙建光 2* 高俊莲 1*
(1. 北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 农业基因资源与生物技术
北京市重点实验定 北京 100097)
(2. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业部作物营养与施肥
重点实验室 北京 100081)
(3. 北京联合大学 生物化学工程学院 北京 100023)
摘 要: 【目的】分析一株分离自黑龙江省的苜蓿根瘤菌在低磷胁迫及正常磷含量条件
下细胞膜脂的组成 , 并从该菌中克隆和鉴定细胞膜无磷脂二酰基甘油三甲基高丝氨酸
(DGTS)合成基因。【方法】分别在不同磷含量的 Sherwood基本培养基中进行根瘤菌培养,
采用 Bligh-Dyer方法提取细胞膜脂, 以文献报道 Sinorhizobium meliloti (苜蓿中华根瘤菌)
菌株 1021的脂类图谱和磷脂 PE、PG、PC标准品作为参照, 利用薄层层析方法分析不同
磷含量条件下培养菌株的细胞膜脂组成。根据 GenBank中已发表的 DGTS合成基因 btaA
和 btaB序列设计引物, 以产 DGTS菌株基因组 DNA为模板, 扩增 btaA和 btaB同源基因,
并在 E. coil BL21(DE3)表达。同时检测表达菌株是否合成细胞膜无磷脂 DGTS以验证基
因功能。对菌株 17560进行 16S rRNA基因序列分析。【结果】分离自黑龙江省的苜蓿根
瘤菌 17560与 Sinorhizobium meliloti的 16S rRNA基因序列相似性高达 99.8%, 但其细胞
膜脂组成明显不同于参比菌株 Sinorhizobium meliloti 1021的膜脂组成。在低磷胁迫条件
下, 该菌株的细胞膜脂主要由 OL 和 DGTS 等无磷脂组成, 但 OL 的组成明显不同, 该菌
株含有 3种不同类型的鸟氨酸脂(OLs), 而参比菌株 Sinorhizobium meliloti 1021只含有一
种类型的鸟氨酸脂(OL)。在正常磷含量条件下, 该菌株的细胞膜脂主要由 PE和一种未知
的含氨基磷脂组成, PG与 PC的含量均较少, 而参比菌株 Sinorhizobium meliloti 1021的细
DOI:10.13344/j.microbiol.china.2013.06.010
刘华伟等: 苜蓿根瘤菌 17560细胞膜膜脂组成分析及 DGTS合成基因克隆与表达 1009
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胞膜脂主要由 PE、PG与 PC组成。通过 PCR扩增从产 DGTS 菌株 17560中获得 1 913 bp
DNA 片段, 经序列分析发现其中有两个 ORF 与菌株 Sinorhizobium meliloti 1021 的 btaA
和 btaB基因序列相似性均为 99%。将该 DNA片段克隆于 pET-30a(+)得到重组质粒 pLH01,
转化宿主菌获得表达菌株 E. coli BL21(DE3)·pLH01, 经 IPTG诱导后产生相对分子量约为
45 kD和 25 kD的蛋白。薄层层析验证重组菌细胞膜脂组成, 结果表明, 表达菌株 E. coli
BL21(DE3)·pLH01可以在 IPTG诱导后合成无磷脂 DGTS, 而转入空载体 pET-30a(+)的阴
性对照菌株 E. coli BL21(DE3)·pET-30a(+)则不能合成。【结论】系统发育地位相同的苜蓿根
瘤菌株的细胞膜脂组成明显不同; 苜蓿根瘤菌的细胞膜组成随培养基中的磷含量不同而变
化, 低磷胁迫条件下其细胞膜脂主要由OL和DGTS等无磷脂组成; 在 Sinorhizobium 膜脂中
首次发现一种未知的氨基磷脂及3种不同类型的鸟氨酸脂(OLs); 从菌株17560中克隆获得２
个 DGTS合成基因 btaA和 btaB, 在大肠杆菌中成功表达, 并证实了所表达基因的功能。
关键词: 苜蓿根瘤菌, 细胞膜无磷脂, DGTS, 薄层层析, btaA和 btaB基因克隆与表达
Membrane lipids analysis of a bacterial strain 17560 isolated
from nodule of Alfalfa and cloning and expression
of the genes for diacylglyceryl trimethylhomoserine
(DGTS) biosynthesis
LIU Hua-Wei1,3 MA Xiao-Tong2 WANG Xu-Ming1 LI Xiu-Ai1
ZOU Xiao-Lin1 SUN Jian-Guang2* GAO Jun-Lian1*
(1. Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing Municipal
Key Laboratory of Aricultural Gene Resources and Biotechnology, Beijing 100097, China)
(2. Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Key Laboratory of Crop Nutrition and Fertilization of Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China)
(3. College of Biochemical Engineering, Beijing Union University, Beijing 100023, China)
Abstract: [Objective] The aim of this study is to analyse membrane lipids composition of a
rhizobial strain isolated from nodule of Alfalfa in Heilongjiang province under phospho-
rus-limited condition and to clone and identify the genes required for diacylglyceryl
trimethylhomoserine (DGTS) biosynthesis. [Methods] The rhizobial strain was cultured in
Sherwood minimal medium containing either normal or low concentrations of inorganic
phosphate.The membrane lipids were extracted by Bligh-Dyer method and were analysed by
thin-layer chromatography (TLC) using both the lipids of Sinorhizobium meliloti 1021 and
standard samples of some phospholipid as a reference. PCR primers was designed according to
the sequences of btaA and btaB in the GenBank. The PCR-amplified btaA and btaB genes were
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expressed in Escherichia coli BL21(DE3). The gene function was verified by testing DGTS
production. 16S rRNA gene sequences of the strain 17560 was analysed. [Results] The strain
17560 isolated from Alfalfa in Heilongjiang province shares 99.8% 16S rRNA gene sequence
identity with Sinorhizobium meliloti. But its lipid compositions were quite different from that
of the reference strain S. meliloti 1021. Under phosphorus-limited conditions, the main mem-
brane lipids of the strain17560 were phosphorus-free lipids, such as ornithine lipid (OL) and
DGTS. Strain 17560 contain three different types of OLs meanwhile S. meliloti 1021 contain
only one type of OL. Under normal phosphorus condition, the main membrane lipids of strain
17560 were phospholipid, such as phosphatidylethanolamine (PE) and one unkonw
amino-containing phospholipid, while the main membrane lipids of S. meliloti 1021 are PE,
phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylglycerol (PG). BtaA and btaB genes of strain 17560
were amplified. One PCR product of 1 913 bp was obtained, which contains two ORFs sharing
99% sequence identity with btaA and btaB genes of S. meliloti 1021 respectively. This DNA
fragment was cloned to pET-30a(+) vector and transferred to E. coli BL21(DE3). The proteins
of 45 kD and 25 kD were detected, and TLC analysis further revealed DGTS production in the
expression strain when induced with isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG). [Conclusion]
Membrane lipids of rhizobial strains from Alfalfa could be quite different although their phy-
logenetic position were the same. Membrane lipids of rhizobial strain varies with the phosphorus
content in the growth medium, the main membrane lipids of the strain were phosphorus-free
lipids, such as OL and DGTS under phosphorus-limiting condition. One unknown
amino-containing phospholipid and three different types of OLs was found in Sinorhizobium.
The btaA and btaB genes were cloned and expressed successfully in E. coli.
Keywords: Rhizobia from Alfalfa, Phosphorus-free membrane lipids, Diacylglyceryl trimethylho-
moserine, Thin-layer chromatography (TLC), Cloning and expression of btaA and btaB genes
磷对于整个农业生产具有非常重要的影响。
土壤缺磷及磷矿资源衰竭等问题对农业生产造
成了严重影响。我国约0.8亿hm2的耕地中, 约有
50%−70%的耕地缺乏有效磷[1]。长期不合理使用
化学磷肥造成土壤结构破坏和水源污染, 同时生
产化肥的原料和石油能源资源有限, 依赖有限的
资源终究难以维持农业的持续发展。根瘤菌是发
展可持续农业中的一个极为重要的微生物种质
资源, 不仅可以与豆科植物共生固氮, 将空气中
分子态氮转化为植物可利用的化合态氮, 为植物
提供氮素营养 [2]; 而且近年来国内外研究发现,
在低磷胁迫条件下根瘤菌可以合成不含磷的脂
类, 即无磷脂来替代磷脂构成细胞膜[3−4], 这一特
性增强了根瘤菌在低磷胁迫条件下生存竞争能
力。据文献报道, Sinorhizobium meliloti 1021在低
磷胁迫下可以合成硫苷脂(SL)、鸟氨酸脂(OL)、
二酰基甘油三甲基高丝氨酸(DGTS)等3种无磷脂,
其中DGTS是一种主要的无磷脂, 其含量可达到
总细胞膜脂的50%以上[5]。推测DGTS是根瘤菌的
一种重要的细胞膜无磷脂, 可能在增强根瘤菌的
抗逆性方面起重要作用。苜蓿(Medicago sativa)
是一种优质牧草, 堪称牧草之王, 是世界范围内
栽培最悠久、面积最广泛的豆科牧草。我国现有
苜蓿面积约133万hm2, 居世界第六位[6]。我国对
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苜蓿根瘤菌资源及其在苜蓿种植中应用已有广
泛研究, 但是关于苜蓿根瘤菌细胞膜无磷脂的研
究还未见报道。本研究对采自我国黑龙江省的一
株苜蓿根瘤菌, 分别在低磷胁迫及正常磷含量条
件下进行细胞膜膜脂的组成分析, 明确不同条件
下膜脂的组成, 并进一步对其无磷脂DGTS的生
物合成基因进行克隆与重组表达研究, 旨在发掘
我国无磷脂DGTS合成的菌种及其基因资源, 为
进一步的开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒: 本研究所用一株苜蓿根瘤菌
由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
农业微生物资源与利用研究室提供, 已知根瘤菌
参考菌株 Mesorhizobium huakuii CCBAU2609T和
Sinorhizobium meliloti 1021由中国农业大学提供
(表 1)。E. coli BL21(DE3)和 pET-30a(+) Vector为
本实验室保存, pGEM-T Easy Vector system I试剂
盒购自 Promega公司。
1.1.2 培养基: 根瘤菌培养所用培养基为 TY 培
养基[7]和 Sherwood基本培养基[8], Sherwood高磷
培养基是指含 1.3 mmol/L K2HPO4的Sherwood基
本培养基 ; Sherwood 低磷培养基是指含
0.02 mmol/L K2HPO4的 Sherwood 基本培养基。
E. coli培养采用 LB培养基。
1.1.3 主要试剂和仪器: Silica gel 60 F254高效
薄层层析板(20 cm×20 cm), 购自德国Merk公司;
磷脂标准品 PE、PC、PG, 购自美国 Sigma公司;
限制性核酸内切酶 BamHⅠ、NdeⅠ、BSA、CIP, 购
自美国 NEB公司; T4 DNA Ligase, 购自 Promega
公司; XbaⅠ和 rTaq, 购自 TaKaRa公司; Plasmid
Mini Kit I, 购自OMEGA公司; 总DNA提取试剂
盒, 购自北京天根生化公司; DNA marker 和蛋白
质 Marker, 购自北京全式金公司。实验中所用的
引物, 均为上海生工生物工程技术服务有限公司
合成, 其它常规试剂为国产或进口分析纯。实验中
主要使用的仪器有 : 薄层层析缸 , 27.0 cm×
26.5 cm×7.0 cm, 购自美国Sigma公司; N-EVAP氮
吹仪, 购自美国Organomation公司; 5417C型台式
离心机 , 购自德国 Eppendorf 公司 ; Bio-Rad
PTC-100 型 PCR 仪, 购自美国伯乐公司; 凝胶成
像系统 GDS-8000, 购自美国基因公司。
1.2 根瘤菌的培养与菌体收集
将−80 °C超低温保存的菌种, 接种 100 µL至
5 mL TY液体培养基中, 28 °C振荡培养 2 d以活
化菌株。将活化好的菌液分别按 1%的接种量接
种于 50 mL Sherwood高磷和低磷培养基, 28 °C
振荡培养 3−7 d后, 12 000 r/min离心 5 min收集
菌体 , 以每管约 40 mg 湿菌体的量 , 分装于
1.5 mL离心管中, 于−20 °C冰箱贮存备用。
1.3 16S rRNA基因序列分析
16S rRNA基因的 PCR扩增及序列测定采用
文献[9]的方法, 最后将所获得的 16S rRNA基因
序列通过 EzTaxon (www.eztaxon.org)进行同源性
比对分析。
1.4 细胞膜脂的提取
采用 Bligh-Dyer方法[10]提取细胞膜脂类: 首
表 1 本研究所用根瘤菌菌株
Table 1 Rhizobia strains used in this study
菌株
Strains
宿主植物
Host plant
地理来源
Geographic origin
Mesorhizobiumhuakuii CCBAU2609T Astragalus sinicus 南京
Sinorhizobium meliloti 1021[7] Medicago sativa 美国
17560 苜蓿 黑龙江
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先取装有 40 mg左右湿菌体的 1.5 mL离心管, 菌
体重悬于 100 µL 去离子水中后涡旋 ; 加入
125 µL氯仿和 250 µL无水甲醇涡旋至混合均匀,
14 000 r/min离心 5 min, 破碎的细胞壁等杂质被
离心下来, 将上层清液转入另一新的离心管中;
加入 125 µL氯仿和 125 µL去离子水, 振荡均匀
后 14 000 r/min离心 5 min, 转移下层有机相进入
新的 1.5 mL离心管中, 即得到溶解于氯仿的细胞
膜脂, 于−20 °C冰箱贮存备用。
1.5 细胞膜脂的分析
1.5.1 单向薄层层析分析 [11−13]: 将以上保存于
−20 °C冰箱的膜脂样品用氮吹仪吹干, 重新溶解
于 30 µL氯仿中, 得到所需脂类的浓缩样品。磷
脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰甘油
(PG)标准品粉末分别溶解于氯仿中, 配制成1 g/L
磷脂溶液, 每次点样使用 25 µL。取 20 cm×20 cm
Silica gel 60 F254高效薄层层析铝箔板一张, 用
铅笔在距离层析板下边缘 1.5 cm 处划一条直线,
每隔 1 cm 标出点样点。用移液器小心点样于硅
胶板上, 使点样点尽量小。实验所用展层剂配比
为氯仿:甲醇:水=140:60:10 (V/V/V), 展层时间约
80 min。
1.5.2 脂类的染色: 采用碘蒸气熏蒸方法、茚三
酮法及钼蓝染色法[11−12]对薄层层析板进行染色。
1.6 DGTS 合成基因 btaA 和 btaB 的 PCR 扩
增及序列测定
据文献报道, 在Rhodobacter sphaeroides存在
两个基因btaA和btaB, 它们分别编码DGTS生物
合成过程的两个酶。这两个基因位于同一个操纵
子内, 而且btaA 基因的终止密码与btaB基因的
起始密码重叠 [14]。Sinorhizobium meliloti 中的
Y01848 和 Y01847 基因被鉴定为btaA和btaB基
因[3]。从GenBank中下载btaA和btaB基因序列, 在
DNAMAN上比对后, 用Primer 5.0设计引物序列
如下:
btaA-f: 5′-GGAATACATATGACGACTTCGCCCC
GGAT-3′;
btaA-r: 5′-AAAGGATCC TCATGCTTTCTTCCG
GCAGAT-3′;
btaB-f: 5′-GGAATACATATGAGCGCCGTGCAGA
CCGCGAA-3′;
btaB-r: 5′-AAAGGATCCCTACGGTGCCGCGCG
GCGATAGA-3′。
序列中加下划线部分为保护碱基, 斜黑体部
分在正向引物中为NdeⅠ酶切位点, 在反向引物
中为BamHⅠ酶切位点。挑选一株产DGTS的供试
菌株17560, 以其基因组DNA为模板进行PCR扩
增, PCR采用25 µL反应体系[基因组DNA模板
2 µL, 10×反应缓冲液2.5 µL, btaA-f或 btaB-f
(20 μmol/L) 2 µL, btaB-r 或 btaA-r (20 μmol/L)
2 µL, dNTPs (2.5 mmol/L) 2 µL, rTaq (5 U/µL)
2.5 U, ddH2O补足25 µL], PCR扩增程序为: 94 °C
5 min; 94 °C 1 min, 62 °C 1 min, 72 °C 3 min, 共
35个循环; 72 °C 10 min。采用凝胶回收试剂盒回
收PCR扩增产物 , 克隆于pGEM-T Easy[15]后送
TaKaRa测序, 用BLASTx在GenBank中搜索, 分
析所得的序列。
1.7 btaA和 btaB基因的克隆
对回收的PCR扩增产物与pET-30a(+)质粒分
别进行NdeⅠ和BamHⅠ双酶切, 酶切体系(80 µL)
为 : DNA/pET-30a(+) 10 µL; 10×BamHⅠBuffer
8 µL; BSA (10 g/L) 0.8 µL; NdeⅠ(20 U/µL) 1 µL;
ddH2O 59.2 µL, 37 °C酶切作用1 h后加入1 µL
BamHⅠ(20 U/µL), 37 °C酶切作用2 h。载体酶切
后做去磷酸化反应以防止载体自连, 去磷酸化反
应体系 (100 µL)为 : 载体双酶切产物 80 µL,
10×BamHⅠBuffer 2 µL, CIP (10 U/µL) 1 µL, 无
菌水补足100 µL, 37 °C酶切作用30 min后升温至
52 °C继续作用30 min, 然后加入4 µL 250 mmol/L
EDTA, 65 °C作用20 min。得到产物用DNA柱纯化
试剂盒纯化后, 最终洗脱至20 µL的DDW中。对
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双酶切产物进行胶回收, 然后加入酶切产物3 µL,
pET-30a(+) 3 µL, 0.8 µL T4 DNA Ligase (3 U/µL),
10 µL 2×Buffer和ddH2O 3.2 µL (20 µL体系),
16 °C连接过夜(10 h以上)。连接产物转入预先制
备好的E. coli BL21(DE3)感受态细胞中, 涂布至
含有卡那霉素Kan (50 mg/L)的LB培养基平板上,
37 °C培养过夜(12−14 h), 在含卡那霉素(Kan)的
LB培养基平板上随机挑取单菌落, 接入含同样
浓度Kan的LB液体培养基培养过夜, 提取质粒,
用PCR扩增和双酶切的方法双重验证, 方法同上
一致。克隆过程中涉及的连接、转化、质粒提取、
阳性克隆的筛选等方法参照文献[16]进行。
1.8 btaA和 btaB基因的重组表达
1.8.1 诱导表达: 将含有阳性重组质粒和空质粒
载体 pET-30a(+)的表达菌株 E. coli BL21(DE3)按
文献[16]培养至 OD 为 0.4−0.5, 加入终浓度为
1 mmol/L的 IPTG, 37 °C、150 r/min振荡培养, 分
别在加入 IPTG诱导之前及 IPTG诱导 12 h后, 取
1 000 µL菌液, 14 000 r/min离心 5 min收集菌体,
储存于−20 °C保存。
1.8.2 SDS-PAGE 检测 [17]: 取出以上保存于
−20 °C 的菌体, 用 200 µL 无菌水重悬起来, 取
40 µL菌悬液, 加入 10 µL 5倍蛋白上样缓冲液,
在沸水中裂解10 min, 10 000 r/min离心5 min, 上
清用于电泳上样。蛋白Marker也以同样的方法煮
5 min。用 SDS-PAGE 胶电泳, 考马斯亮蓝染色,
7%的乙酸脱色后观察并照相。
1.9 btaA和 btaB基因的功能验证
将带有阳性重组质粒和空质粒载体
pET-30a(+)的表达菌株 E. coli BL21(DE3)接种于
100 mL含有卡那霉素(50 mg/L)的LB液体培养基
中, 37 °C 振荡培养至 OD=0.4 时加入终浓度为
1 mmol/L IPTG进行诱导, 在 30 °C条件下继续培
养 6 h后取 2 mL菌液, 离心收集菌体, 提取脂类
做薄层层析分析, 检测是否合成 DGTS。
2 结果
2.1 16S rRNA基因序列分析结果
16S rRNA 基因序列比对结果表明 , 菌株
17560与 Sinorhizobium meliloti的 16S rRNA基因
序列相似性高达 99.8%。
2.2 低磷胁迫下苜蓿根瘤菌细胞膜膜脂组成
分析
分别在低磷胁迫下及正常磷含量条件下培养
苜蓿根瘤菌菌株及已知根瘤菌参比菌株, 提取菌
株的细胞膜脂, 与磷脂标准品一起进行做薄层层
析分析, 经碘蒸汽染色和茚三酮染色及钼蓝染色
后, 与参比菌株 Sinorhizobium meliloti 1021的膜
脂图谱和磷脂混合标样图谱对比来初步确定膜
脂的组成成分。结果(图 1)表明, 分离自黑龙江省
的一株苜蓿根瘤菌株 17560的细胞膜组成明显不
同于参比菌株 Sinorhizobium meliloti 1021的膜脂
组成。在低磷胁迫条件该菌株除了含有无磷脂
DGTS (图 1A的泳道 5)外, 还含有 3种类型的鸟
氨酸脂(OLs), 由 3条谱带组成, 上下 2条谱带呈
紫红色, 中间的那条谱带呈橙黄色(图 1B 的泳道
5), 明显不同于参比菌株 Sinorhizobium meliloti
1021 的鸟氨酸脂(OL)的只有 1 条谱带(图１B 的
泳道 3)。在正常磷含量(简称高磷)条件下, 该菌
株的膜脂是主要由磷脂 PE、PC、PG和一种未知
的氨基磷脂组成(图１A、B和 C的泳道 4); 此外
菌株 17560 在高磷条件下合成少量的无磷脂 OL
(图１B的泳道 4), 类似于参比菌株 Sinorhizobium
meliloti 1021 在高磷条件下合成的鸟氨酸脂(OL)
(图１B的泳道 2)。
2.3 btaA和 btaB基因的PCR扩增及序列分析
选取在低磷胁迫下产无磷脂二酰基甘油三甲
基高丝氨酸(DGTS)的菌株 17560, 在 TY 培养基
培养菌株后提取基因组DNA, 采用引物对 btaA-f
和 btaB-r进行 PCR扩增得到一条大小约 2 kb的
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DNA片段, 与预测条带大小基本一致, 切胶回收
目的片段连接于 pGEM T-Easy 载体, 送 TaKaRa
公司测序, 获得全长 1 913 bp 的序列, 采用
DNAMAN软件及 ORF finder在线分析软件对插
入片段进行ORF分析, 结果如图 2所示, 在 plus1
中存在一个长度为 1 251 bp (碱基位置: 1−1 251)
完整的ORF, 编码 416个氨基酸, 命名为ORF416;
在 Plus3中存在另一个长度为 666 bp (碱基位置:
1 248−1 913)完整的 ORF, 编码 221个氨基酸, 命
名为 ORF221 (它们在 GenBank 中的登录号分别
为: JN977501和 JN977502)。
将这两个 ORF 翻译所得的氨基酸序列在线
进行BLASTp相似性比对, 结果显示: ORF416编
码的蛋白分子量大小预测为 45 557.05 Da, 属于
DUF3419 家族, 与 Sinorhizobium meliloti 菌株
1021中由 btaA基因编码的蛋白 SMc01848 (S-腺
苷甲硫氨酸: 二酰基甘油 3-氨基-3-羧丙基转移酶)
相似性 99%; 而 ORF221 编码的蛋白分子量大小
预测为 25 044.71 Da, 属于AdoMet_MTases家族,
与 Sinorhizobium meliloti 菌株 1021中 btaB基因
编码的蛋白 SMc01847 (依赖 S-腺苷甲硫氨酸的
N-甲基转移酶)相似性 99%。
2.4 ORF416和 ORF221基因的重组表达
将目的片段克隆到表达载体 pET-30a(+)后,
图 1 不同培养条件下供试菌株细胞膜脂薄层层析
图谱
Fig. 1 Thin-layer chromatogram of membrane lipids
from tested strains under different culture conditions
注: A: 碘蒸汽染色, B: 茚三酮染色, C: 钼蓝染色. 1: PC, PE,
PG, PS和 CL混合标样; 2, 3: S. meliloti 1021 (高磷, 低磷); 4,
5: 17560 (高磷, 低磷).
Note: Lipids were visualized with iodine (A), ninhydrin (B) and
molybdenum blue reagent (C) respectively. 1: Mixture of PC,
PE, PG, PS and CL; 2, 3: S. meliloti 1021 (Under high or low
concentrations of inorganic phosphate, respectively); 4, 5:
17560 (Under high or low concentrations of inorganic phos-
phate, respectively).
图 2 插入片段的 ORF分析结果
Fig. 2 The ORFs of the insert fragment
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提取质粒, 采用酶切和 PCR两种方法证明所获得
的重组质粒为带有 ORF416 和 ORF221 基因的
pET-30a(+)载体的阳性重组质粒 , 将其命名为
pLH01。转入阳性重组质粒 pLH01 和空质粒载
体 pET-30a(+)的表达菌株E. coli BL21(DE3)分别
命名为 E. coli BL21(DE3)·pLH01 和 E. coli
BL21(DE3)·pET-30a(+) 。 表 达 菌 株 E. coli
BL21(DE3)·pLH01 和 阴 性 对 照 菌 E. coli
BL21(DE3)·pET-30a(+)在 LB 液体培养基中培养,
经 1 mmol/L的 IPTG诱导, 37 °C、150 r/min振荡
培养 12 h 后收集菌体, 以 IPTG 诱导前菌体作对
照, 进行 SDS-PAGE电泳检测, 结果见图 3。
使用 ExPASY对 ORF416和 ORF221所编码
蛋白质的等电点和分子量做预测 , 结果显示 ,
ORF416所编码的蛋白质 pI为 9.07, 分子量大小
为 45 557.05 Da。ORF221所编码蛋白质 pI为 9.88,
图 3 E. coli BL21(DE3)·pLH01的诱导表达
Fig. 3 The SDS-PAGE analysis of btaA and btaB pro-
tein expressed in E. coli BL21(DE3)
注: M: Middle range蛋白分子量标准; 1 : E. coli BL21(DE3)·
pET30a 诱导前; 2: E. coli BL21(DE3)·pET30a 诱导后; 3:
E. coli BL21(DE3)·pLH01诱导前; 4: E. coli BL21(DE3)·pLH01
诱导后.
Note: M: Middle range protein molecular weight standards; 1:
Before induction of E. coli BL21(DE3)·pET30a; 2: After induc-
tion of E. coli BL21(DE3)·pET30a; 3: Before induction of
E. coli BL21(DE3)·pLH01; 4: After induction of E. coli
BL21(DE3)·pLH01.
分子量大小为 25 044.71 Da。由图 3可以看出, 经
IPTG 诱导表达, SDS-PAGE 检测发现, E. coli
BL21(DE3)·pLH01 中出现两种过量表达蛋白, 其
分子量大小分别约为 45 kD和 25 kD, 与预测的
btaA 和 btaB 同源基因表达产物的分子量大小相
符; 而 E. coli BL21(DE3)·pET30a 则在相应位置
没有出现过量表达蛋白条带。
2.5 ORF416和 ORF221基因的功能验证
表达菌株E. coli BL21(DE3)·pLH01和阴性对
照菌 E. coli BL21(DE3)·pET-30a(+)在 LB培养基
中培养, 经终浓度 1 mmol/L 的 IPTG 进行诱导,
在 30 °C条件下继续培养 6 h后, 提取细胞膜脂类
做薄层层析分析 , 结果如图 4 所示 , E. coli
BL21(DE3)·pLH01经 IPTG诱导 6 h后膜脂中检测
到有DGTS合成, 而 E. coli BL21(DE3)·pET-30a(+)
图 4 btaA和 btaB基因在E. coli BL21(DE3)体内诱导
表达蛋白活性检测
Fig. 4 Detection of protein activity for btaA and btaB
genes expressed in E. coli BL21(DE3) after induction
注: 1: PC标样(1 g/L); 2: PG标样(1 g/L); 3: PE标样(1 g/L);
4: S. meliloti 1021 高磷 ; 5: S. meliloti 1021 低磷 ; 6:
CCBAU2609 高磷 ; 7: CCBAU2609 低磷 ; 8: E. coli
BL21(DE3)·pET-30a(+)诱导后; 9: E. coli BL21(DE3)·pLH01
诱导后.
Note: 1: Standard sample of PC (1 g/L); 2: Standard sample of
PG (1 g/L); 3: Standard sample of PCE (1 g/L); 4: S. meliloti
1021 under high phosphate condition; 5: S. meliloti 1021 under
low phosphate condition; 6: CCBAU2609 under high phos-
phate condition; 7: CCBAU2609 under low phosphate condi-
tion;8: Before induction of E. coli BL21(DE3)·pET-30a(+); 9:
After induction of E. coli BL21(DE3)·pET-30a(+).
1016 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.6
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则没有检测到 DGTS, 说明本研究所克隆的 btaA
和 btaB 的同源基因的表达产物具有 DGTS 合成
相关酶活性。
3 讨论
鸟氨酸脂广泛存在于革兰氏阴性细菌中, 在
Mycobacterium和Streptomyces等少数革兰氏阳性
细菌中也有报道, 但似乎在古细菌及真核生物中
未见报道[4,18]。已有报道在Thiobacillus thiooxidans
等抗酸细菌的细胞膜外层膜中富含鸟氨酸脂 ,
因此有人推测氨酸脂可能具有抗酸作用 [19]。
Rhizobium tropici是从墨西哥热带菜豆根瘤中分
离确定的一个种 , 该种的模式菌株CIAT899对
高温或者酸性环境等多种环境胁迫具有很好的
抗性 , 可以在pH 4.0的酸性培养基上生长 , 酸
性条件下的结瘤竞争能力很强 [20]。 2005年 ,
Rojas-Jimenez等[21]报道了模式菌株CIAT899中存
在4种结构不同的鸟氨酸脂, 分别命名为S1、S2
和P1、P2, 并证明其中S1、S2是菌株CIAT899耐
酸性所必需, P1、P2决定了菌株与宿主植物菜豆
(Phaseolus vulgaris)的共生有效性。早先也有研究
报道在Burkholderia cepacia中当温度升高时, 羟
基 化 的 鸟 氨 酸 脂 含 量 升 高 [22] 。 2011 年 ,
Vences-Guzman等[23]对修饰的(羟基化)鸟氨酸脂
的生物合成及其在R. tropici抗逆性中的作用进行
了深入细致的研究, 结果也表明在酸性逆境中, R.
tropici的鸟氨酸脂的生物合成增加, 其细胞膜外
层膜中富含鸟氨酸脂。这些研究结果一致表明,
被修饰的鸟氨酸脂在抵御逆境中起作用。本研究
中一株分离自黑龙江省的苜蓿根瘤菌株在低磷
胁迫条件培养下都合成3种类型的鸟氨酸脂, 对
应于Rhizobium tropici模式菌株CIAT899的鸟氨酸
脂S1、S2及P1, 推测这些菌株中所含有羟基化的
鸟氨酸脂可能也赋予它们对多种逆境抵御能力,
不过这种推测还有待于进一步实验证实。
二酰基甘油三甲基高丝氨酸(DGTS)广泛存
在于绿藻、苔藓植物和蕨类植物低等绿色植物、
真菌和变形虫中[24]。在原核生物中DGTS被鉴定
为一种细胞膜无磷脂, 在低磷胁迫条件下它可以
取代PC构成细胞膜[5,25]。1999年, Geiger等首次报
道了DGTS是Sinorhizobium meliloti在低磷胁迫条
件下, 从头新合成的主要细胞膜脂, 其含量占总
细胞膜脂的57%。已有实验证明DGTS等无磷脂可
促进Sinorhizobium meliloti在低磷胁迫条件下的
生长[3]。本研究中菌株17560合成无磷脂DGTS,
说明该苜蓿根瘤菌株可能在低磷胁迫条件下都具
有较好的生存竞争能力, 具有较好的应用潜力。
目前国内外对根瘤菌细胞膜脂的研究并不多,
据文献报道, Sinorhizobium meliloti 1021在低磷胁
迫下可以合成硫苷脂(SL)、鸟氨酸脂(OL)、二酰基
甘油三甲基高丝氨酸(DGTS)等 3种无磷脂[5]。而本
研究发现分离自黑龙江省的一株苜蓿根瘤菌
17560虽然与 Sinorhizobium meliloti的 16S rRNA
基因序列相似性高达 99.8%, 但其细胞膜脂组成明
显不同于 Sinorhizobium meliloti 1021的膜脂组成,
首次报道在 Sinorhizobium 膜脂中发现了一种未知
的氨基磷脂及 3 种不同类型的鸟氨酸脂(OLs), 揭
示了根瘤菌细胞膜组成的多样性。此外, 菌株
17560 的细胞膜组成随培养基中的磷含量不同而
变化, 在正常磷含量条件下, 该菌株的膜脂是主要
由磷脂 PE、PG、PC 及一种未知的氨基磷脂等组
成; 在低磷胁迫条件培养下, 该菌株的膜脂中无磷
脂含量明显升高, 而磷脂含量有所降低, 膜脂主要
由 3种不同类型的鸟氨酸脂(OLs)和 DGTS等无磷
脂组成。本研究从所获得 DGTS产生菌 17560中
成功扩增得到 btaA和 btaB基因, 克隆至表达载体
pET-30a(+)并在表达菌株 E. coli BL21(DE3)中诱导
表达成功, 并证实目的基因的表达产物具有酶活
性。DGTS合成基因的成功克隆与表达, 为进一步
开发利用奠定了一定工作基础。
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参 考 文 献
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