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UPLC-PDA-QTOF /MS分析肌注胆木注射液后大鼠血浆中的分布
杜迎翔1， 殷 蓉1， 朱粉霞2， 徐金娣3， 贾晓斌2， 王 慧1，2
(1． 中国药科大学 分析化学教研室，江苏 南京 210009;2． 江苏省中医药研究院 国家中医药管理局中药
释药系统重点研究室，江苏 南京 210028;3． 江苏省中医药研究院 中药分析和代谢组研究室，江苏 南京
210028)
收稿日期:2013-10-28
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (81203001)
作者简介:杜迎翔 (1966—) ，男，教授，博士生导师。Tel:13401927478，E-mail:zfxcjq@ 126． com
摘要:目的 分析并鉴定大鼠肌肉注射胆木注射液后的主要入血的成分，初步探究其药效物质。方法 采用 UPLC-
PDA-QTOF /MS分析空白血浆、含胆木注射液血浆、胆木注射液和对照品，对比图谱中色谱峰保留时间以及离子碎片
信息，解析成分的归属。结果 以胆木注射液 11 个化学成分为参照，从大鼠血浆中鉴定了 8 个原形入血成分，分别
是 naucleamide A-10-O-β-D-glucopyranoside、短小蛇根草苷、3-表短小蛇根草苷、3α，5α-tetrahydrodeoxycordifoline lac-
tam、naucleoxoside A、naucleoxoside B、异长春花苷内酰胺、喜果苷。结论 8 个入血成分均为生物碱类成分，提示生
物碱是胆木注射液可能的活性物质。
关键词:胆木注射液;胆木;大鼠血浆;UPLC-PDA-QTOF /MS;药效物质
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2014)11-2339-06
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 11. 026
Analysis of the constituents absorbed into rat blood after intramuscular adminis-
tration of Danmu Injection by UPLC-PDA-QTOF /MS
DU Ying-xiang1， YIN Ｒong1， ZHU Fen-xia2， XU Jin-di3， JIA Xiao-bin2， WANG Hui1，2
(1． Department of Analytical Chemistry，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China;2． Key Laboratory of New Drug Delivery System of
Chinese Meteria Medica，Jiangsu Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210028，China;3． Department of Pharmaceutical ＆
Metabolomics，Jiangsu Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210028，China)
ABSTＲACT:AIM To analyze and identify the constituents in rat plasma after intramuscular administration of
Danmu Injection (Nauclea officinalis Pierre ex Pitard) ，and explore their active materials． METHODS UPLC-
PDA-QTOF /MS analysis was performed on Danmu Injection，rat plasma with and without Danmu Injection and ref-
erences． The constituents in rat plasma were identified by comparing the retention time and mass spectrometry frag-
ment data． ＲESULTS On the basis of eleven constituents of Danmu Injection，eight constituents found in their o-
riginal forms in rat plasma were identified as naucleamide A-10-O-β-D-glucopyranoside，pumiloside，3-epi-pumilo-
side，3α，5α-tetrahydrodeoxycordifoline lactam，naucleoxoside A，naucleoxoside B，strictosamide and vinco-
samide． CONCLUSION The finding of alkaloids in rat plasma should suggest that alkaloids in Danmu Injection
may be the active materials．
KEY WOＲDS:Danmu Injection;Nauclea officinalis Piere ex Pitard;rat plasma;UPLC-PDA-QTOF /MS;active
material
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近年来，中药剂型不断创新，特别是中药注
射剂的出现，推动了中药现代化发展。但是由于
中药注射剂研究体系的不完善，使得其物质基础
不明确，从而导致产品质量标准化不足，阻碍了
药物再评价工作的开展，致使临床用药过程中不
良反应频频发生，因此加强中药注射剂物质基础
研究很有必要。然而中药化学成分众多，作用机
制复杂，难以明确指出具体是何种成分以何种形
式在体内发挥作用。因此药效物质基础研究已经
成为困扰中药现代化研究的难点之一。目前已有
方法指出可以采用现代分析方法，以中药给药后
的血清或血浆为研究对象，针对入血成分及其代
谢产物进行分析鉴定，直观地观察中药化学成分
在体内的形态表现，从而快速寻找其药效物质
基础［1-2］。
胆木注射液由胆木 (Nauclea officinalis Pierre
ex Pitard)药材开发而成，已进入临床使用多年，
用于治疗急性扁桃腺炎、急性咽喉炎、急性结膜
炎及上呼吸道感染，常与多种抗生素配伍应
用［3］。目前，关于胆木注射液的研究主要集中在
体外定性定量分析方面［4-12］，而对于其体内药效
物质基础研究却鲜有报道。为了进一步明确胆木
注射液发挥抗菌抗炎作用的物质基础，本实验采
用 UPLC-PDA-QTOF /MS 分析技术，对给药后的
大鼠血浆进行定性分析，确认胆木注射液主要入
血成分，初步阐明其体内效应物质基础，为进一
步的体内药代动力学研究以及胆木注射液的再评
价提供实验依据。
1 材料
1. 1 仪器 ACQUITYTM UPLC 系统 (美国 Waters
公司) ，包括二元梯度泵、自动进样器、二极管阵
列检测器、柱温箱;SynaptTM G2-S Q-TOF 质谱仪
(美国 Waters 公司)，配有 Lock-spray 接口，电喷
雾离子源 (ESI) ，MassLynx 4. 1 质谱工作站软件;
N-EVAP 112 氮吹仪 (美国 Organomation 公司) ;
IKA Vortex Genius 3 涡旋混合器 (德国 IKA公司) ;
Mettler Toledo NewClassic MF MS105DU 半微量天平
(瑞士 Mettler Toledo 公司) ;Thermo Scientific Mi-
croCL 21 离心机 (美国 ThermoFisher Scientific 公
司);Ｒainin Pipet-One 20 ～ 200 μL 移液枪 (美国
Ｒainin公司) ;Milli-Q 超纯水系统 (美国 Millipore
公司)。
1. 2 药品与试剂 原儿茶酸和獐牙菜苷对照品购
自上海源叶生物科技有限公司;naucleamide A-10-
O-β-D-glucopyranoside、naucleamide G、短小蛇根
草苷、3-表短小蛇根草苷、3α，5α-tetrahydrodeoxy-
cordifoline lactam、异长春花苷内酰胺、喜果苷为实
验室自制［11-13］，纯度均≥98%;甲醇、乙腈、甲
酸均为色谱纯 (德国 Merck公司) ;水为 Milli-Q超
纯水;胆木注射液 (海南制药厂有限公司，批号:
110616)。
1. 3 实验动物 清洁级健康雄性 SD 大鼠，体质
量 220 ～ 250 g，由江苏省中医药研究院实验动物中
心提 供，实 验 动 物 许 可 证 号: SCXK (沪)
2007-0005。
2 方法
2. 1 胆木注射液供试品溶液的制备 取胆木注射
液 1 mL于 10 mL棕色量瓶中，加纯水定容至刻度，
摇匀，即为胆木注射液供试品溶液。
2. 2 混合对照品溶液的制备 称取原儿茶酸、獐
牙菜苷、naucleamide A-10-O-β-D-glucopyranoside、
naucleamide G、短小蛇根草苷、3-表短小蛇根草
苷、3α，5α-tetrahydrodeoxycordifoline lactam、异长
春花苷内酰胺、喜果苷各对照品适量，置于 25 mL
棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度后超声溶解，最终
得到混合对照品溶液，溶液过 0. 22 μm 微孔滤膜
后进样分析。
2. 3 空白血浆和含药血浆样品的制备 取健康雄
性 SD大鼠 6 只，随机分成两组，于给药前 12 h 禁
食，不禁水。给药组按 2 mL /kg 的剂量肌肉注射，
空白对照组给予同等剂量的生理盐水。分别于给药
后 5、15、30、60、120 min 眼底静脉丛取血，注
入涂有肝素钠的 1. 5 mL 离心管中，轻轻混匀，
3 500 r /min离心 10 min，吸取上清液，即为含药
血浆。
取含药血浆和空白血浆各 500 μL，加入甲醇
2 mL，涡旋混合 2 min，12 000 r /min 离心 10 min，
吸取上清液于 45 ℃ 水浴下氮气吹干，残渣加
500 μL甲醇涡旋复溶，12 000 r /min 离心 10 min，
取上清进样分析。
2. 4 色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱
(2. 1 mm × 100 mm，3. 5 μm) ，流动相为 0. 1%甲
酸水溶液 (A)-乙腈 (B) ，梯度洗脱 (0 ～ 5 min，
5% ～ 10% B;5 ～ 17 min，10% ～ 38% B;17 ～
18 min，38% ～100% B;18 ～ 19 min，100% ～ 5%
B;19 ～ 22 min，5% B)。体积流量 0. 3 mL /min，
柱温 30 ℃，自动进样器温度 10 ℃，进样体积为
4 μL，PDA检测器扫描范围为 210 ～ 400 nm。
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2. 5 质谱条件 ESI 离子源，正离子模式扫描，
毛细管电压为 3 kV，锥孔电压为 50 V，离子源温
度 105 ℃，脱溶剂气体积流量 700 L /h，脱溶剂气
温度 350 ℃，锥孔气体积流量 50 L /h，母离子碰撞
能量 4 V，碎片离子碰撞能量 20 ～ 50 V，质量扫描
范围为50 ～ 1000 Da，扫描时间 0. 2 s;准确质量校
正采用 1 ng /μL 亮氨酸-脑啡肽溶液，校正溶液体
积流量为 5 μL /min，正离子模式监测(［M + H］+ =
556. 277 1 Da)。
3 结果
3. 1 胆木注射液中主要化学成分鉴定 在建立的
色谱条件下，对比对照品与供试品溶液的总离子
流图及紫外图谱 (图 1)，发现胆木注射液中成分
较多，根据色谱峰保留时间、紫外吸收以及离子
碎片等信息，结合本实验室前期研究结果以及文
献报道［11-15］，对 11 个色谱峰进行了指认 (表
1)。其中 1 ～ 6，9 ～ 11 号峰有对照品作为参照，
成分信息明确。而色谱峰 7 和 8，数据显示二者
质谱分子离子峰均为 m /z 515，二级质谱中主要
的碎片离子有m /z 353、283、265、160，离子碎
片信息与文献 ［11-12］ 基本一致，推测这两个
峰为 naucleoxoside A、naucleoxoside B，可能的裂
解途径如图 2 所示，由于这两个化合物互为非对
映异构体且目前缺乏对照品作为参考，暂时无法
进行明确归属。
A． 混合对照品溶液 B． 胆木注射液
图 1 混合对照品溶液 (A)和胆木注射液 (B)总离子流
图 (a)以及紫外图谱 (b)
Fig. 1 Total ion chromatography chromatograms (a)and
UV chromatograms (b) of referonce substances
(A)and Danmu Injection (B)
表 1 胆木注射液体内外 UPLC-PDA-MS/MS数据及成分鉴定 (峰号与图 1 和图 3 一致)
Tab. 1 UPLC-PDA-MS/MS data and identification of the components in vitro and in vivo (peak numbers correspond to
those found in figure 1 and 3)
峰号 tＲ /min UV /nm 胆木注射液 MS /MS (m/z) 含药血浆 MS /MS (m/z) 成分鉴别
1 3. 26 260;294
155. 034 0;137. 024 1;109. 028
4;93. 033 6
－ 原儿茶酸 (C7H6O4)
2 7. 71 247
359. 133 5;343. 011 6;197. 081
3;179. 071 7;179. 070 7;127. 039 2
－ 獐牙菜苷 (C16H22O9)
3 8. 75 227;273
519. 233 6;357. 181 5;339. 171 2;
309. 160 4;160. 076 2
519. 236 0;357. 184 2;
309. 079 7
naucleamide A-10-O-β-D-
glucopyranoside(C26H34N2O9)
4 9. 32 229;273 489. 223 6;327. 170 8;309. 160 3 － naucleamide G (C25H32N2O8)
5 10. 24 243;328
513. 187 4;351. 134 9;333. 124 5;
281. 093 0;185. 071 7;158. 060 8
513. 184 8;351. 133 5;333. 124 3;
281. 092 0;185. 116 6
短小蛇根草苷
(C26H28N2O9)
6 10. 90 244;328
513. 187 9;351. 135 0;333. 124 5;
281. 092 8;185. 071 7;;158. 060 5
513. 188 7;351. 132 8;333. 124 3;
281. 095 1;185. 071 5
3-表短小蛇根草苷
(C26H28N2O9)
7 12. 36 242
515. 202 1;353. 150 4;283. 108 4;
265. 098 2;160. 076 2
515. 202 6;353. 149 6
naucleoxoside A or B
(C26H30N2O9)
8 12. 65 246
515. 203 6;353. 150 1;283. 108 2;
265. 097 7;160. 076 0
515. 203 2;353. 150 1
naucleoxoside A or B
(C26H30N2O9)
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续表 1
峰号 tＲ /min UV /nm 胆木注射液 MS /MS (m/z) 含药血浆 MS /MS (m/z) 成分鉴别
9 13. 18 232
543. 198 0;381. 145 2;335. 140 0;
265. 097 9;169. 076 8
543. 197 9;381. 144 4;
335. 140 8;169. 076 0
3α，5α-tetrahydrodeoxycordifoline lactam
(C27H30N2O10)
10 14. 58 228
499. 207 9;337. 155 7;267. 113 7;
171. 092 3
499. 207 5;337. 155 3;
267. 113 4;171. 092 4
异长春花苷内酰胺
(C26H30N2O8)
11 15. 90 243
499. 208 3;337. 155 0;267. 113 2;
381. 144 9;171. 092 2
499. 207 1;337. 155 4 喜果苷(C26H30N2O8)
图 2 Naucleoxoside A or B 质谱裂解途径
Fig. 2 Fragmentation patterns for naucleoxoside A or B
based on MS2spectrum
3. 2 含药血浆中入血成分分析 将空白血浆与给
药 15 min 后含药血浆质谱总离子流图对比发现，
血浆中内源性物质干扰较多，为了获得更加 “干
净”的图谱，结合胆木注射液成分鉴定结果，对
总离子流图进行离子流提取，从而更准确识别入血
成分。将胆木注射液、对照品溶液、含药血浆、空
白血浆分别进行离子提取后，通过峰的保留时间以
及质谱离子碎片对比，可以更直观地对各个成分进
行辨认，分析提取后的图谱，发现绝大多数原形成
分能够被检测到，含药血浆提取离子流图见图 3。
从含药血浆提取离子流图中，根据保留时间
对比可以初步确认 8 个入血成分。为了进一步确定
各化合物的结构，对含药血浆的 EIC图谱进行多级
质谱分析。在对 3 号峰解析中，提取离子流图相应
保留时间处一级质谱图中显示准分子离子峰为 m/z
519，二级质谱中离子碎片 m/z 357 ［M + H-glu］+，
309 ［M + H-glu-H2O-CH2O］
+，根据与对照品对
比，确定为 naucleamide A-10-O-β-D-glucopyranoside
(结构见图 4)。9 号峰的准分子离子峰为 m/z 543，
母离子产生的碎片离子为 m/z 381 ［M + H-glu］+，
335 ［M + H-glu-HCOOH］+， 169 ［M + H-glu-
图 3 大鼠给药 15 min后血浆中化学成分提取离子流图
Fig. 3 Extracted ion chromatograms of rat plasma sample
in 15 min after intramuscular administration of
Danmu Injection
HCOOH-C9H10O3］
+，离子信息与对照品基本一致，
确定为 3α，5α-tetrahydrodeoxycordifoline lactam (结
构见图 4)。
峰 5 和 6、7 和 8、10 和 11 两两准分子离子峰
相同，并且离子碎片信息也基本一致，推测其两两
互为立体异构体。5 号和 6 号峰准分子离子峰为
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图 4 3 号峰和 9 号峰化合物结构式
Fig. 4 Chemical structures of compounds found in peak 3 and 9
m/z 513，产生的碎片离子有 m/z 351、333、281、
185、158 (图 5)，与对照品裂解途径一致，确定
分别为短小蛇根草苷和 3-表短小蛇根草苷。峰 10
和 11 准分子离子峰同为 m/z 499，主要子离子碎片
有 m/z 337、267、171 (图 6)，分别对应化合物异
长春花苷内酰胺和喜果苷;峰 7 和 8 准分子离子峰
质荷比为 515，二级质谱中主要的碎片离子为 m/z
353，推测这两个峰为 naucleoxoside A 或 naucleoxo-
side B。综合上述分析结果，从含药血浆中检测并
确认了 8 种原形成分，鉴定结果及碎片离子信息见
表 1。
图 5 5 号峰二级质谱图
Fig. 5 MS2 spectrum of peak 5
图 6 10 号峰二级质谱图
Fig. 6 MS2 spectrum of peak 10
3. 3 给药后血浆中化学成分动态图谱 胆木注射
液给药后，于不同时间点采血，对大鼠血中移行成
分在体内的动态变化过程进行了初步探索，如图 7
所示。通过比较空白血浆与含药血浆样品紫外色谱
图，发现给药后 5 min，大鼠血浆中即有原形成分
出现，说明肌肉注射给药方式，药物入血迅速，发
挥作用也快。从胆木注射液体内的动态变化图谱可
以看到，给药 5 min 时各成分浓度已达到较高水
平，随着时间的推移，短时间内浓度略有增高，随
后逐渐开始下降，该过程可为进一步的胆木注射液
药代动力学研究提供参考。
图 7 胆木注射液给药后的血浆动态指纹图谱
Fig. 7 Dynamic fingerprint of rat plasma after intramus-
cular administration of Danmu Injection
4 讨论
中药成分不仅复杂，而且多数成分含有量都较
低，尤其进入血液的成分浓度可能会更低，同时一
些内源性物质也会干扰中药成分的鉴定。本实验建
立了高灵敏度、高分辨率的 UPLC-QTOF-MS /MS 分
析方法对胆木注射液体内外样品进行了分析，利用
提取离子流图能够从复杂的背景中辨认源峰，并获
得高精度的碎片离子信息。通过对比胆木注射液、
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含药血浆以及空白血浆的质谱图，从而对入血成分
进行快速识别确证。
本课题组的前期研究［11-12］表明胆木注射液中
主要有三类成分，分别为酚酸、环烯醚萜以及生物
碱。其中生物碱类是中药中常见的有效组分之一，
该类成分通常具有显著的生物活性。胆木注射液给
药后的大鼠血浆中检测到的 8 个成分均属于这一
类，并且它们质谱裂解行为相似，在正离子模式
下，均产生加氢准分子离子峰，碎片离子多发生脱
糖基、脱水、开环裂解。这些入血成分很可能是胆
木注射液体内直接作用物质，与本课题前期体内外
组分抗炎活性研究结果相一致［11］。证明胆木及胆
木注射液抗炎生理活性来自于生物碱类组分。在后
续研究中，若能进一步对这些入血成分进行生物活
性研究，将有助于更好地了解胆木注射液的体内物
质基础及其作用机理，从而推动其再评价工作的开
展，提高临床用药安全性和有效性。此外，对于胆
木注射液质量标准的完善，若能以活性入血成分作
为指标，建立与药效相关的质量控制手段，才能从
根本上保证药品的内在质量。
胆木注射液给药方式为肌肉注射，活性物质通
过组织液经毛细血管网进入血液循环，相对于口服
给药吸收更好、作用更快，大多数成分都能以原形
入血，而原儿茶酸、獐牙菜苷以及 naucleamide G
成分，可能由于含有量较低，也有可能不以原形入
血或者很快被代谢掉，所以未能检测到。本实验初
步完成对胆木注射液的入血成分研究，但是仅考察
了 2 h内的原形入血成分，而某些代谢产物或者是
给药后引起应激反应产生的内源性物质，也有可能
是发挥疗效的物质基础，还有待进一步研究。
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2014 年 11 月
第 36 卷 第 11 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
November 2014
Vol． 36 No． 11