全 文 ：酶法制取早籼米浓缩蛋白＊
谭志光　唐书泽　汪　勇　张志森　曹柏营
(暨南大学食品科学与工程系 , 广州 , 510632)
摘　要　以早籼米为原料 , 采用高温α-淀粉酶酶解工艺 , 制取浓缩蛋白。实验得到的最佳工艺条件是:高温α-淀
粉酶 6 ml/ 100 g(米粉)、固液比 1∶4、酶解温度 95℃、酶解时间 1 h。在此工艺条件下制取的早籼米浓缩蛋白纯度
达 82.41%, 提取率达 94.69%, 比已有的同类方法制取的蛋白纯度 75.26%、提取率 78.95%分别提高了
7.15%、15.74%。聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质分子量的分析结果证实 , 高温酶解并没有引发大的蛋白质聚
合;氨基酸组成也没有明显的变化 ,表明酶法是制取早籼米浓缩蛋白的一种较为优越的方法。
关键词　早籼米浓缩蛋白 , 酶法提取 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,氨基酸组成分析
　第一作者:硕士研究生。
＊湖南太子奶生物科技股份有限公司部分资助项目(445127)
　收稿日期:2005-12-08
　　我国稻谷年产量 2千亿 t左右 ,是世界上稻谷最
大产出国 。大米有粳米和籼米之分 ,籼米又分为早籼
米和晚籼米。晚籼米因为其加工性能和食用品质较
好 ,主要作为主食;早籼米由于加工性能和食用品质
较差 ,而不受消费者欢迎 ,因此导致大量积压。通过
深加工途径提高早籼米的使用价值 ,是解决问题的关
键。
大米蛋白是一种优质蛋白 ,其氨基酸组成合理 ,
与WHO/FAO 推荐理想模式接近[ 1] 。大米蛋白的低
抗原 、低过敏性 ,使其成为婴幼儿断奶食品的理想原
料[ 2] 。大米蛋白具有重要的保健功能:如具有抵抗二
甲基苯并蒽诱导癌变作用[ 3] ,显著降低血清中胆固
醇 、磷脂和甘油浓度[ 4] 。大米蛋白还可以加工成酱
油 、高蛋白饮料 、蛋白发泡粉[ 5]等 。
大米蛋白的提取方法主要有碱法[ 6]和酶法[ 7] 。
碱法提取率高 ,成本低 ,但是采用较高浓度的碱溶液 ,
蛋白质中赖氨酸与丙氨酸或胱氨酸发生缩合反应 ,生
成有毒物质 Lysinoalnine 等[ 8] ,破坏肾脏功能 ,其赖
氨酸营养价值也大大降低 ,因而不适合于食用;蛋白
酶法提取率低 ,经济效益较差 ,不实用;淀粉酶法提取
率较高 ,但纯度较低 。本文的目的是研究采用高温α-
淀粉酶酶法制取早籼米浓缩蛋白的可行性 ,并且进一
步提高蛋白纯度和提取率 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
早籼米 ,市售;高温α-淀粉酶(30 000 u/g),无锡
杰能科公司提供 。
1.2　主要实验仪器和设备
PHS-3C型精密 pH 计 ,上海雷磁仪器厂;9FZ-15
型粉碎机 ,广东阳山县农机厂;DH-100型超级恒槽 ,
上海嘉鹏科技有限公司;JB50-D型强力电动搅拌机 ,
上海标本模型厂;LD4-2型离心机 ,北京医用离心机
厂;DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱 ,上海一恒科
学仪器有限公司;KDN-08A 蛋白质消化器 、定氮仪 ,
上海新嘉电子有限公司;DYY-5型稳压稳流电泳仪 ,
北京市六一仪器厂;高效液相色谱仪 、PICO-TAG 氨
基酸分析柱 ,Waters Corporation 。
1.3　实验方法
1.3.1　工艺流程
早籼米 ※粉碎过筛※加水调浆 ※糊化※液化※离心
上清液
浓缩蛋白※烘干※定氮
1.3.2　操作要点[ 6 , 7]
早籼米粉碎过筛(100目),称取 50 g 米粉 ,加水 、
加酶(酶液稀释 10倍即 3 000 u/g),用电炉快速加热
到所需温度 ,再水浴恒温搅拌 ,到达设定时间后加 2
mol/L的 HCl调 pH 至 5.0灭酶 ,冷却 ,然后离心(2
000×g)20 min ,用温水洗去沉淀物残余的糖 ,再离心
(2 000×g)20 min ,沉淀物于 50℃烘 24 h ,最后将浓
缩蛋白粉碎过筛(40目)测定蛋白质含量。
1.3.3　单因素实验
对固液比 、加酶量 、酶解温度 、酶解时间进行单因
素实验 ,根据其对蛋白纯度的影响 ,确定多因素正交
实验的最佳水平 。
1.3.4　多因素正交实验
通过单因素实验 ,选取较好的因素水平进行正交
实验 ,其因素水平见表 1。
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTAT ION INDUSTRIES
54　 2006 Vol.32 No.4(Total 220)
表 1　实验因素水平表
水平
因　　素
A B C D
固液比(m仁:m水) 加酶量/mL 酶解温度/ ℃ 酶解时间/ h
1 1∶3 2.5 85 1
2 1∶4 3.0 90 1.5
3 1∶5 3.5 95 2
1.4　分析方法
1.4.1　米粉和浓缩蛋白主要成分的测定
米粉和浓缩蛋白的主要成分:水分 、灰分 、淀粉 、
粗蛋白 、粗脂肪和粗纤维的测定均采用相应的国家标
准测定方法进行测定 。
1.4.2　蛋白纯度 、提取率和氨基酸组成计算
纯度/ %=浓缩蛋白中蛋白质质量浓缩蛋白质量 ×100
提取率/ %=浓缩蛋白中蛋白质质量米粉中蛋白质质量 ×100
氨基酸/ %=某种氨基酸质量总的氨基酸质量×100
1.4.3　聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子质量[ 9]
将 3 mg 浓缩蛋白和 30 mg 米粉分别溶解在 3
mL 已经配好的样品溶解液中 ,然后在沸水浴中加热
5 min备用。分离胶浓度为 12%,取 10 μL 样品溶液
注入浓缩胶的梳腔中进行电泳 。
电泳结束后用 2.5%的考马氏亮蓝染色 45 min ,
然后脱色 ,直到背景色完全脱去 ,呈现出清晰的电泳
带为止。
电泳凝胶色带用 Uniscan D3000扫描仪扫描 ,然
后用 Smart view plus软件对图象进行分析处理 。
1.4.4　氨基酸组成分析
准确称取一定量固体样品 ,加入 6 mol/L HCl
(含有 1%苯酚),105℃水解24 h ,干燥 ,衍生 ,进行高
效液相色谱分析检测 。
检测条件:PICO-TAG 氨基酸分析专用柱;柱温
38℃;样品检测流动相:A 液(pH 6.4 醋酸钠-醋酸
缓冲溶液),B液(60%乙腈水溶液),流速 1 mL/L ;检
测波长 254 nm 。
2　结果与分析
2.1　固液比对浓缩蛋白纯度的影响
酶解时固液比与酶解工艺有关 ,它会影响蛋白纯
度。调整固液比分别为 1∶2 、1∶3 、1∶4 、1∶5 、1∶6 ,加酶
量1.5 mL ,酶解时间 1.5 h ,酶解温度 95℃,进行实
验 ,从而确定固液比对蛋白纯度的影响 。结果如下图
1所示。
图 1　固液比对蛋白纯度的影响
　　随着固液比的增加 ,分离提取的浓缩蛋白纯度呈
上升趋势 , 1∶4 时达到最大 ,随后又呈下降趋势。这
说明随着固液比的增加 ,淀粉酶能够更充分地酶解淀
粉 ,所以蛋白质的纯度增加;当固液比继续增大时 ,可
能导致蛋白质溶解量增加 ,即蛋白质损失量增加 ,纯
度降低。
2.2　加酶量对浓缩蛋白纯度的影响
一般来说 ,加酶量越大 ,酶解越快越充分。调整
加酶量分别为 0.5 、1 、1.5 、2 、2.5 、3 、3.5 、4 mL ,固液
比1∶4 ,酶解时间 1.5 h ,酶解温度 95℃,进行实验。
加酶量对蛋白纯度的影响如图 2所示。
图 2　加酶量对蛋白纯度的影响
加酶量从 0.5 mL 增大到 3 mL 时 ,蛋白纯度呈
上升趋势 ,表明高温α-淀粉酶越多 ,淀粉酶解越彻底 ,
在 3 mL 时达最佳 。
2.3　酶解温度对浓缩蛋白纯度的影响
酶的活性受温度影响较大 ,一方面温度升高 ,酶
分子活性增大 ,酶解速度提高 ,另一方面 ,温度过高可
能导致酶蛋白质变性 ,降低酶解速度 。本实验采用的
高温 α-淀粉酶的适宜温度为 90 ～ 105℃, 分别在
80℃、85℃、90℃、95℃、100℃,固液比 1∶4 ,加酶量 3
mL ,酶解时间 1.5 h ,进行实验 ,从而确定酶解温度对
蛋白纯度的影响 ,结果如图 3所示。
温度升高 , 80℃到 90℃,蛋白纯度呈上升趋势 ,
在 90℃时达到最佳 ,但是温度越高 ,也会影响酶的活
生产与科研经验
2006年第 32卷第 4期(总第 220期) 55　
力 ,导致纯度降低 ,而且蛋白颜色加深。
图 3　酶解温度对蛋白纯度的影响
2.4　酶解时间对浓缩蛋白纯度的影响
酶解时间一般应取能使淀粉完全酶解 ,蛋白纯度
有明显提高的最短时间。本实验分别在 0.5 、1 、1.5
、2 和 2.5 h ,酶解温度 95℃,固液比 1∶4 ,加酶量 3
mL ,进行实验 ,从而确定酶解时间对蛋白纯度的影
响 ,结果如图 4所示 。
图 4　酶解时间对蛋白纯度的影响
酶解初始阶段对浓缩蛋白纯度影响很大 ,随着淀
粉的酶解 ,蛋白纯度增加很快 ,酶解 1 h 后达最大 ,但
是时间延长可能导致蛋白部分水解 ,纯度降低 ,而且
蛋白颜色加深。
2.5　四因素三水平正交实验对浓缩蛋白纯度的影响
固液比 、加酶量 、酶解温度 、酶解时间四因素三水
平正交实验结果见表 2。
表 2　正交实验设计与结果
实验号 因　　素
A B C D 蛋白纯度/ %
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
2
3
1
3
1
2
1
2
3
3
1
2
2
3
1
77.72
77.94
80.31
79.50
82.41
79.61
80.11
78.50
79.21
　　4种因素对浓缩蛋白纯度的影响趋势列于图 5。
图 5　因素水平对蛋白纯度的影响
　　图 5说明 A 、C 因素即固液比和酶解温度为最重
要因素 ,四个因素的主次关系为C>A>B>D。
综合考虑 ,选取 A2B2C3D1 即固液比 1∶4 、酶解温
度 95℃、酶解时间 1 h 、加酶量 3 mL 为最佳组合 ,早
籼米浓缩蛋白纯度达 82.41%,提取率达 94.69%。
2.6　酶法对早籼米浓缩蛋白组成的影响
表 3　米粉和浓缩蛋白近似组成成分/ %
组成成分 水分 蛋白质 脂肪 淀粉 灰分 粗纤维
米粉(湿基)
浓缩蛋白(湿基)
12.09
9.18
7.63
74.90
0.37
3.81
78.87
3.38
0.48
2.75
0.56
5.98
　　由表 3 可知 ,虽然浓缩蛋白纯度 74.90%(湿
基),干基达 82.41%,但是要利用它作为添加剂或对
其功能性质进一步研究 ,必须再次提纯 ,得到纯度达
90%以上的分离蛋白 。
2.7　酶法对蛋白质分子量组成的影响
1-浓缩蛋白 , 2-米粉
图 6　蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳图
由图 6 可知 ,酶法制取浓缩蛋白 ,所得到的蛋白
质的分子质量的大小并没有发生明显的变化 。用
Smart view plus生物电泳图像分析软件进行分析处
理 ,得到的蛋白质分子质量及其百分含量如表 4 所
示。
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTAT ION INDUSTRIES
56　 2006 Vol.32 No.4(Total 220)
表 4　蛋白质分子量的大小及百分含量　%
浓缩蛋白 a b c d e f g h
分子质量/ku
百分比/ %
63
2.6
57
3.0
36
26.5
27
4.2
22
30.9
14.6
5.3
13
22.1
11.6
1.9
米粉 a b c d e f g h
分子质量/ku
百分比/ %
63
2.1
57
3.5
36
24.5
27
5.2
22
30.2
14.6
4.6
13
23.1
11.6
1.7
　　表 4说明 ,早籼米中的蛋白质和浓缩蛋白主要由
分子量为 36 ku 、22 ku 、13 ku三个部分组成 ,高温酶
解并没有引发大的蛋白质聚合 ,各种蛋白质分子量的
百分含量也没有发生明显变化 。
2.8　酶法对早籼米蛋白质氨基酸组成的影响
表 5　米粉和浓缩蛋白的氨基酸组成
氨基酸 米粉/ % 浓缩蛋白/ %
Asp
Glu
S er
Gly
His
Arg
Thr
Ala
Pro
Tyr
Val
Met
Cys
Ile
Leu
Phe
Lys
9.20
20.92
5.66
4.87
2.36
9.72
6.89
5.95
4.59
0.95
5.31
2.81
0.11
3.98
7.72
4.82
3.24
9.22
20.66
5.39
4.86
3.14
8.36
4.06
5.65
4.60
5.56
5.42
2.82
0.33
3.82
8.15
5.49
3.32
　　从表 5可知 ,利用高温α-淀粉酶制取早籼米浓缩
蛋白 ,其氨基酸组成中精氨酸(Arg)和苏氨酸(Thr)
的量明显减少(分别减少 1.36%,2.83%),而酪氨酸
(Thr)的量明显增加(增加了 4.61%),组氨酸(His)、
亮氨酸(Leu)和苯丙氨酸(Phe)的量也有较大的增加
(分别增加了 0.82%、0.43%、0.67%),其它氨基酸
组成并没有发生明显的变化。
3　结　论
(1)以早籼米为原料 ,酶法制取早籼米浓缩蛋白
的最佳工艺参数是:高温 α-淀粉酶 6 mL/100 g(米
粉)、固液比 1∶4 、酶解温度 95℃、酶解时间 1 h ,采用
这种方法制取的浓缩蛋白纯度达 82.41%,提取率达
94.69%。
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质的分子量测
定结果表明:酶法制取的浓缩蛋白与未经加热处理的
米粉的蛋白质分子量组成基本相同 ,高温酶解并没有
引发大的蛋白质聚合 。
(3)氨基酸组成分析图谱表明 ,浓缩蛋白氨基酸
组成中必需氨基酸只有苏氨酸的量明显减少 ,组氨
酸 、亮氨酸和苯丙氨酸的量有较大的增加 ,其它必需
氨基酸基本保持不变;而半必需氨基酸酪氨酸和半胱
氨酸的量明显增加。
参 考 文 献
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65 ～ 71
Preparation of Early Indica Rice Protein Concentration
with Enzymatic Method
Tan Zhiguang　Tang Shuze　Wang Yong　Zhang Zhisen　Cao Baiying
(Department of Food Science and Engineering , Jinan University , Guangzhuo 510632 , China)
ABSTRACT　Indica rice protein concentrat ion w as ext racted by using of high temperature α-amylase hydroly sis.
Optimum condition obtained for preparation of protein concentration w ere :3 mL ofα-amylase , solid to liquid ratio
1∶4 and enzymatic hydrolysis at 95℃fo r 1 h , resulting in the rice protein s purity of 82.41% and the ratio of ex-
traction of 94.69%.Pro tein prof ile f rom sodium dodecy l sulphate poly acrylamide gel elect ropho resis diagram(SDS-PAGE), show ed that the high temperature didn t cause polymerization among larger molecular w eight pro-
tein and there w as no significant change in amino acid profile.
Keywords　early indica rice protein concentration , enzymatic extraction , SDS-PAGE , analysis of amino acid composition
生产与科研经验
2006年第 32卷第 4期(总第 220期) 57