全 文 ：收稿日期:2005-06-01
作者简介:王晓(1971-),男 ,博士 ,研究方向为天然产物研究与开发。
文章编号:1002-4026(2005)04-0014-04
酶法提取牡丹花总黄酮
王晓1 ,耿岩玲1 ,李福伟1 ,王萍2 ,程传格1 ,刘建华1
(1.山东省分析测试中心 , 山东 济南 250014;2.山东中医药大学 ,山东 济南 250014)
摘要:对酶法提取牡丹花总黄酮的酶解条件进行了研究。考察了酶解温度 、酶解液初始 pH 值 、酶解时间和酶
用量对总黄酮产量的影响;确定了酶解的最优条件为:酶解温度为 50℃, 酶解液初始 pH=4.5 , 酶解时间为
120min ,酶的浓度为 0.2mg/mL的纤维素酶和 0.1mg/mL的果胶酶的复合酶液;对酶法提取牡丹花总黄酮与传
统乙醇提取法进行比较 , 结果表明在一定条件下 ,酶法提取工艺比传统乙醇提取法牡丹花总黄酮产量提高了
19.8%。薄层层析结果显示 ,酶对提取物性质未产生影响。
关键词:牡丹花;黄酮;酶法提取
中图分类号:　O6-332　　　　文献标识码:A
从植物中提取药用成分的首要条件是被提取物能够快速高效地进入提取介质 ,如水溶液 ,有机溶剂
等[ 1] 。然而大多植物的有效成分存在于细胞内 ,因此萃取的主要问题是如何有效地打破细胞壁这层势垒 ,让
有效成分从细胞中释放出来与溶剂直接接触[ 2] 。植物细胞主要由细胞壁和原生质体组成 ,而在死的细胞中 ,
原生质体大都破裂 ,浸提阻力主要来自于细胞壁 ,构成细胞壁的成分主要有三种 ,即纤维素 、半纤维素和果胶
质[ 3] 。在提取过程中 ,当细胞内的有效成分向提取介质扩散时 ,必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力 。应
用纤维素酶和果胶酶作用于植物材料 ,使细胞壁及其间质结构产生局部的疏松 、膨胀 、崩溃等变化 ,减小细胞
壁及细胞间质等传质屏障对有效成分从细胞内向提取介质扩散的传质阻力 ,从传质角度促使有效成分的提
取率提高 ,此过程的实质是酶解反应促进传质过程[ 4] 。
牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)别称鼠姑 、鹿韭 、白茸 、木芍药 、百两金 ,属毛茛科芍药属灌木 ,又有洛阳
花 、富贵花和“花中之王”之美称。牡丹除了其根皮(牡丹皮)是一种重要的中药外 ,花也具有重要的药用价
值 ,有调经活血的功效[ 5] 。我们研究发现黄酮类化合物是其重要的活性成分[ 6] ,并从中分离得到四种黄酮
苷[ 7] 。本文采用酶法提取牡丹花中总黄酮化合物 ,旨在探索一种在较低温度下快速简便 、最大限度地提取牡
丹花中有效成分的提取方法。
1　材料和方法
1.1　实验材料 、设备与试剂
牡丹花 4月份采收于山东菏泽 ,用烘箱在 50℃条件下鼓风干燥 ,粉碎至 40目备用 。722型光栅分光光
第 18 卷　第 4期
2005 年10月
山 东 科 学
SHANDONG SCIENCE
Vol.18　No.4
Oct.2005
度计(上海分析仪器厂);恒温水浴锅(上海分析仪器厂);PHS-2型酸度计(上海第二分析仪器厂);芦丁标准
品(上海生化试剂厂);果胶酶(天津市利华酶制剂厂 ,酶活力 2000/u);纤维素酶(上海丽珠东风生物技术有
限公司 ,酶活力 15000/u);三氯化铝 ,乙酸钾 ,95%乙醇等均为分析纯。
1.2　实验方法
1.2.1　标准液的制备及标准曲线的制作[ 8] :
精密称取在 120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品 10.6mg ,加甲醇溶解转入 50mL 容量瓶中 ,用甲醇稀释
至刻度 ,即得对照品(0.212mg/mL)。准确吸取该液 0.0 ,0.1 ,0.15 ,0.2 ,0.25 ,0.3 ,0.35 ,0.4 ,0.45 ,0.5mL 分别
置于 15mL大试管中 ,加水至 5mL ,加 0.1mol/L 的三氯化铝液 3mL , 1mol/L 的醋酸钾试液 5mL ,摇匀 ,放置
40min ,以相应试剂作空白 ,于 420nm测定吸光度 。结果见表1。以浓度(C)与吸光度(A)进行线形回归 ,得回
归方程为 A=0.0028C-0.0012 ,R 2=0.9996。
表 1　芦丁浓度与吸光度
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
芦丁(μg/ml) 21.2 31.8 42.4 53.0 63.6 74.2 84.8 95.4 106.0
A 0.058 0.09 0.118 0.148 0.179 0.209 0.239 0.274 0.297
1.2.2　牡丹花黄酮的提取与测定
取样品 1.00g ,加酶液于三角瓶 ,在不同的 pH值 、不同温度 、不同的酶浓度下酶解不同时间 ,然后加 5倍
的95%乙醇回流 1h ,离心后的残渣再加 5倍的 60%乙醇回流 0.5h ,离心后合并上清液 ,并定容到 50mL。然
后按 1.2.1方法测定 ,根据标准曲线计算出浸提液中总黄酮的得率。
1.2.3　牡丹花总黄酮含量的测定
精确称量 5g 样品 ,用 80%乙醇溶液进行回流提取 8h ,提取液抽滤定容 ,按 1.2.1方法测定 A ,计算提取
液中总黄酮的含量 ,求出牡丹花总黄酮的含量 。并以此计算出各处理的黄酮提取率 。
2　结果与讨论
2.1　牡丹花总黄酮酶法提取适宜工艺参数的确定
2.1.1　酶浓度对酶法提取得率的影响
在 T =50℃, pH=4.5 的条件下 ,酶解 90min ,考
察提取介质中酶浓度对提取的影响以确定最佳的酶
浓度 ,各测定值重复 2次 ,结果如图 1所示。在本实
验的条件下 ,纤维素酶的处理效果显然要高于果胶
酶 ,两酶共同使用时 ,以 0.2mg/mL 的纤维素酶和
0.1mg/mL的果胶酶的酶浓度时 ,牡丹花的总黄酮提
取得率最高。
2.1.2　酶解温度对总黄酮得率的影响
在pH =4.5 、酶浓度为:0.2mg/mL 纤维素酶和
0.1mg/mL的果胶酶 ,不同温度下酶解 90min ,考察酶
解温度对提取的影响 ,以确定最佳的酶解温度 ,结果
A:0.2mg/mL的纤维素酶;B:0.2mg/mL的果胶酶;
C:0.2mg/mL 的纤维素酶和 0.1mg/mL果胶酶;
D:0.1mg/mL的纤维素酶和 0.1mg/mL 的果胶酶;
E:0.1mg/mL 的纤维素酶和 0.2mg/mL的果胶酶
图 1　酶对总黄酮得率的影响
15第 4 期 王晓 ,等:酶法提取牡丹花总黄酮
如图 2所示。图 2表明在 40℃～ 50℃随着温度的升
高 ,总黄酮的得率不断增加 ,当温度达到 50℃时 ,总
黄酮得率最高;在 55℃时总黄酮得率减少 ,因为当温
度升高到一定程度时 ,酶蛋白受热变性 ,从而影响对
细胞的分解 ,降低了总黄酮的得率 。
2.1.3　酶解时间的选择
在 pH=4.5 ,酶浓度为:0.2mg/mL 的纤维素酶和
0.1mg/mL的果胶酶 ,在 50℃下 ,酶解不同时间 ,考察
酶解时间对提取的影响 ,以确定最佳的酶解时间 ,结
果如图 3所示。图 3表明 ,随着时间的延长 ,提取率
增加 ,而在酶解 120min 以后 ,提取率的增加缓慢 ,因
为此时的细胞壁已基本被破坏 ,再延长酶解时间 ,得
率增加的幅度不是很大。本着节约时间的原则 ,选用
酶解时间为120min。
2.1.4　酶解 pH值的选择
在酶浓度为0.2mg/mL的纤维素酶和 0.1mg/mL的
果胶酶 ,50℃下 ,以不同的介质pH 值酶解 90min不同时
间 ,考察酶解 pH值对提取的影响 ,以确定最佳的酶解酸
度 ,结果如图4所示。图4表明 ,在pH=3.5时提取率最
低 ,随着pH值的升高而逐渐增加 ,在pH=4.5时达到最
高 ,而后随着pH值的升高 ,反而得率下降。因为酶活力
受环境的影响 ,pH值不仅影响酶的构象 ,而且也影响底
物的解离状态。在该实验中 ,pH=4.5为该复合酶的最
佳pH值。
2.2　不同处理方式对总黄酮提取率的影响
以0.2mg/mL的纤维素酶和 0.1mg/mL 的果胶酶
的复合酶液 ,在 50℃,pH=4.5的条件下酶解 120min ,
然后进行醇提 ,与传统的直接醇提工艺相比(结果见
表2),发现用复合酶酶解后处理 ,其总黄酮的提取率
比直接醇提法提高了 19.8%,这是由于复合酶可充
分破坏牡丹花以纤维素为主的细胞壁结构及其细胞
间相连的果胶物质 ,使提取传质阻力减小 ,使内容物
总黄酮易于溶出 。
表 2　不同处理方式对总黄酮提取率的影响(n=2)
处理 浸提时间(min)
95%乙醇 60%乙醇 得率(%) 提取率(%)
加酶处理 120min 60 30 1.43 91.2
不加酶 60 30 1.12 71.4
图 2　酶解温度对总黄酮得率的影响
图 3　酶解时间对总黄酮得率的影响
图 4　不同 pH 值对总黄酮得率的影响
a 酶法提取物　b 传统醇提取物
展开剂:正丁醇:乙醇:水(1:4:5)
图 5　牡丹花提取物薄层色谱图
16 山　东　科　学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2005 年
2.3　薄层层析
将加酶粗提取物甲醇溶液(a),未加酶粗提物甲醇溶液(b),在聚酰胺薄膜上展开 ,取出晾干 ,喷 AlCl3 的
乙醇溶液 ,于紫外灯下观察比较。层析结果见图 5。结果发现化学成分没有发生变化。
3　结论
本文提出了牡丹花总黄酮提取的酶法提取新工艺即:以 0.2mg/mL的纤维素酶 0.1mg/mL的果胶酶的复
合酶液 ,在 50℃, pH=4.5的条件下酶解 120min ,先对牡丹花酶解处理 ,破坏细胞壁 ,然后再进行醇提 ,与传统
的工艺相比 ,提取率提高了19.8%,本工艺提取率高 ,提取条件温和。薄层分析没有发现酶对化合物性质产
生影响。
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Enzymatic extraction of total flavonoids from Paeonia suffruticosa Andr .flowers
WANG Xiao ,GENG Yan-ling ,LI Fu-wei ,WANG Ping ,CHENG Chuan-ge ,LIU Jian-hua
(1.Shandong Analysis and Test Center , Jinan 250014 , China;
2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine , Jinan 250014 , China)
Abstract:By using enzyme , a new technology of extracting total flavonoids from Paeonia suffruticosa Andr.flowers is
studied.By experiments we observe the influence of enzymatic hydrolysis temperature ,pH of the enzyme solution , the time
of enzymatic hydrolysis and the amount of enzyme on extraction of total flavonoids.The optimum conditions for enzymatic
hydrolysis were defined ,which enzymatic hydrolysis temperature is 50℃,pH of enzyme solution is 4.5 , and the time of
enzymatic hydrolysis is 120min.Compared with the traditional alcohol extraction , the extraction yield of total flavonoids
has increased by 19.8%.
Key words:Paeonia suffruticosa Andr.flowers;total flavonoids;enzymatic extraction
17第 4 期 王晓 ,等:酶法提取牡丹花总黄酮