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食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY年 第卷 第期 生物工程
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)
是一种非蛋白质类氨基酸，广泛分布于动植物体
内[1]。研究表明，在植物体中，GABA有参与植物
的胁迫反应和调节植物生长方向的功能[2]；在动
物体内，GABA是一种重要的抑制性神经传递物
收稿日期：2012-09-26 *通讯作者
作者简介：姚子鹏(1989—)，男，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向为粮食油脂及其蛋白工程。
质[3]。适量补充GABA具有活化肾功能、改善脑机
能、缓解疼痛和降血压等多种功用[4-6]。因此，对
于GABA的研究一直受到广泛关注。
乳酸菌是公认的有益菌。研究表明，乳酸菌
可以合成谷氨酸脱羧酶(GAD)，用于催化谷氨酸脱
姚子鹏，吴 非*
(东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)
摘要：研究了黄浆水培养基组分的优化与Lactobacillus bulgaricus 1.0205在培养基中生产GABA
的最佳发酵条件，并对其发酵过程进行动态分析。结果表明，培养基中各组分添加量为：葡萄
糖2%，蛋白胨2%，(NH4)SO4 1%，KH2PO4 0.08%。在接种量3%、培养温度42 ℃、初始pH7、
谷氨酸钠添加量3%、发酵时间40 h的条件下，GABA产量为6.22 g/L。应用此方法不仅能获得高
浓度γ-氨基丁酸，而且使黄浆水得到充分利用，为工业化生产γ-氨基丁酸提供新的方法和研
究思路。
关键词：乳酸菌；黄浆水；γ-氨基丁酸
中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)04-0007-04
Enrichment of GABA in wastewater of tofu by lactic acid bacteria
YAO Zi-peng, WU Fei*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030)
Abstract: The optimization of the culture medium in wastewater of tofu and the best fermentation
conditions which produced GABA by Lactobacillus bulgaricus 1.0205 strain in optimal medium were
studied. Then the fermentation process was analyzed. It was shown that the composition of optimal
medium was as follows: glucose 2%, peptone 2%, (NH4)SO4 1%, KH2SO4 0.08%. GABA yield could reach
6.22 g/L under the conditions of inoculation amount 3%, reaction temperature 42 ℃, initial pH7, sodium
glutamate 2%, fermentation time 40 h. This method can not only get high concentrations of γ-aminobutyric
acid, but also make the wastewater of tofu be further utilized, and may provide new research directions
and methods for the industrial production of γ-aminobutyric acid.
Key words: lactic acid bacteria; wastewater of tofu; γ-aminobutyric acid
乳酸菌发酵黄浆水富集GABA的
研究
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2013.04.036
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羧生产GABA。利用乳酸菌生产GABA，在食品和
医药行业具有更高的安全性和高效性[7-8]。
随着我国豆腐行业的发展，黄浆水的产量越
来越高，因此黄浆水的处理问题日益受到关注。
黄浆富含丰富的营养物质和无机盐，其中C:N:P平
均比为100:4.7:0.2[9]。在此基础上进行组分优化可
以很好满足乳酸菌的生长代谢。同时黄浆水中含
有的大量Ca2+离子可以促进谷氨酸脱羧作用，提高
GABA的产量[10]。本论文通过黄浆水中营养物质组
分优化和发酵条件来富集高浓度GABA，旨在为工
业化利用黄浆水富集生产GABA提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆：国家大豆工程技术研究中心；
Lactobacillus bulgaricus 1.0205：东北农业大学乳品科
学教育部重点实验室；GABA标样：Sigma公司；次
氯酸钠、硫酸镁、碳酸钙等：国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HZQ-F160恒温培养箱：哈尔滨市东联电子
技术开发有限公司；LG-2.4高速离心机：北京医
用离心机厂；高压湿热灭菌锅：上海博讯实业有
限公司医疗器械厂；722可见光分光光度计：上
海菁华科技仪器有限公司；超净台：苏州净化设
备有限公司；pHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪
器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 黄浆水的制备 采用传统豆腐加工方法[11]，
蹲脑后剩余的淡黄色液体即为本试验所需要的黄
浆水。称取一定量的黄浆水，在4000 r/min条件下
离心5 min，置于50 mL的三角瓶中，放入高压蒸
气灭菌锅，在115 ℃下灭菌15 min。
1.3.2 种子培养液的制备 在无菌条件下，将冻存
管内的菌液接入到50 mL MRS液体培养基中，42
℃活化培养18 h，再吸取3 mL菌液于100 mL MRS
液体培养基中，42 ℃下培养16 h，作为种子液。
1.3.3 黄浆水培养基的优化 前期的单因素试验
表明，葡萄糖、蛋白胨、(NH4)2SO4、KH2PO4四类
营养物质对Lactobacillus bulgaricus 1.0205的发酵
具有较大影响。为确定培养基的最佳组分，采用
4因素3水平的正交试验，检测指标为Lactobacillus
bulgaricus 1.0205发酵过程中的生物量和GABA产
量。试验因素水平见表1。
1.3.4 初始pH值对生物量和GABA含量的影响 将
优化后的黄浆水培养基的初始pH值分别调整为5、
6、7、8，再将Lactobacillus bulgaricus 1.0205分别
接入不同初始pH值的培养基中避光发酵24 h，测
定发酵液中生物量和GABA含量，确定最适初始
pH值。
1.3.5 谷氨酸钠添加量对生物量和GABA含量的影
响 在确定最适初始pH值的黄浆水优化培养基中
分别添加1%、2%、3%和4%的谷氨酸钠，再接入
Lactobacillus bulgaricus1.0205，避光发酵24 h，测
定发酵液中生物量和GABA含量，确定谷氨酸钠的
最适添加量。
1.3.6 发酵液中GABA含量的测定 将发酵液定时
取出，于4000 r/min离心10 min，抽取1 mL上清
液，以蒸馏水为对照。依次加入0.01 mol/L四硼酸
钠缓冲液1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL、7.5%次氯
酸钠溶液2.5 mL，混匀，沸水浴10 min后立即冰浴
5 min，待溶液出现蓝绿色后，加入60%乙醇溶液
2.0 mL，于645 nm测定吸光值。通过GABA标准曲
线计算发酵液中GABA含量。
1.3.7 发酵液中生物量的测定 在发酵培养过程
中，定时取样，以空白培养基作为对照，在600
nm下测定吸光值。
1.3.8 发酵液pH值与蛋白质含量的测定 采用pH
计测定pH值，Bradford法[12]分析蛋白质。
1.3.9 统计分析 所有试验均重复3次，运用Origin
8.0对单因素条件进行分析，采用SPSS18.0进行正
交分析。
2 结果与讨论
2.1 黄浆水培养基的优化
根据因素水平表的设计安排，按接种量3%接
入Lactobacillus bulgaricus 1.0205，在42 ℃条件下，
发酵24 h，以发酵液中的生物量和GABA含量为指
标进行正交试验，结果见表2。
从表2可以看出，在乳酸菌发酵过程中，4个
因素对Lactobacillus bulgaricus 1.0205生物量的影响
程度与对GABA富集量的影响程度不同。对于生物
量来说，最优方案为A2B2C3D3，即葡萄糖2%、蛋
表1 试验因素水平表
水平
因素
葡萄糖/% A 蛋白胨/% B (NH4)2SO4/% C KH2PO4/% D
1 1 2 0.8 0.08
2 2 3 1 0.1
3 3 4 1.2 0.12
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白胨3%、(NH4)2SO4 1.2%、KH2PO4 0.12%。该结果
表明，在黄浆水中需加入一定量的碳源、氮源和
无机盐才能满足菌体的生长繁殖。
4个因素对发酵液中GABA含量的影响程度大
小依次为A>B>D>C，最优方案为A2B1C2D1，即葡萄
糖2%、蛋白胨2%、(NH4)2SO4 1%、KH2PO4 0.08%。
其中，(NH4)2SO4对GABA含量和菌体生物量的影
响程度与KH2PO4正好相反，即与(NH4)2SO4含量相
比，KH2PO4含量对GABA富集的影响更显著。
从以上分析可知，通过改变培养基的组分
可调节Lactobacillus bulgaricus 1.0205的生物量和
GABA的含量。为得到高浓度GABA和节约培养
基经济成本，因此选择发酵条件为A2B1C2D1，即
葡萄糖2%、蛋白胨2%、(NH4)2SO41%、KH2PO4
0.08%。
2.2 初始pH值对菌体生物量和GABA含量的影响
在接种量3%和42 ℃条件下，将Lactobacillus
bulgaricus 1.0205接入到不同初始pH值的黄浆水优
化培养基中培养24 h，测得生物量和GABA含量如
图1所示。
由图1可知，pH4~7时，La c t o b a c i l l u s
bulgaricus 1.0205生物量和GABA含量随着初始
pH值的增加而逐渐升高。当pH值达到7时，
Lactobacillus bulgaricus 1.0205生物量(OD600)和GABA
含量均达到最高，分别为1.63 g/L和3.76 g/L。pH
值为8时，生物量和GABA的含量均明显降低。由
此可知，pH7为该菌株生长和生产GABA的最佳初
始pH值，这与刘清等[13]人的研究结论一致。
2.3 谷氨酸钠添加量对菌体生物量和GABA含量
的影响
在黄浆水优化培养基中分别加入1%、2%、
3%、4%的谷氨酸钠并将初始pH值调节为7。在接
种量3%和发酵温度42 ℃条件下分别培养24 h，测
得生物量和GABA含量如图2所示。
图1 初始pH对生物量和GABA含量的影响
图2 谷氨酸钠添加量对生物量和GABA含量的影响
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表2 黄浆水培养基优化的正交试验结果
试验
号
因素 生物量/
OD600
GABA含量/
(g/L)A B C D
1 1 1 1 1 1.31 2.73
2 1 2 2 2 1.28 2.49
3 1 3 3 3 1.42 2.03
4 2 1 2 3 1.49 2.98
5 2 2 3 1 1.32 2.18
6 2 3 1 2 1.52 3.06
7 3 1 3 2 1.33 2.19
8 3 2 1 3 1.48 2.37
9 3 3 2 1 1.27 2.12
生
物
量
K1 1.24 1.38 1.34 1.34
K2 1.45 1.43 1.35 1.34
K3 1.39 1.28 1.4 1.4
R 0.21 0.16 0.07 0.06
G
A
B
A
K1 2.15 2.63 2.38 2.66
K2 2.74 2.59 2.55 2.29
K3 2.02 2.13 2.43 2.41
R 0.54 0.5 0.173 0.37
从图2可以看出，谷氨酸钠的添加量对
Lactobacillus bulgaricus 1.0205生物量的影响不大，
生物量(OD600)均在1.63左右，但对于GABA富集量
的影响较大。谷氨酸钠添加量为1%~3%时，发酵
液中GABA含量随着谷氨酸钠添加量的增加而逐渐
增加。当谷氨酸钠添加量为3%时，GABA含量高
达4.63 g/L。当谷氨酸钠添加量为4%时GABA含量
明显下降，这与穆琳[14]等人研究结论相似。因此
谷氨酸钠的最佳添加量为3%。
2.4 Lactobacillus bulgaricus 1.0205发酵产
GABA过程的研究
将 Lactobacillus bulgaricus 1.0205以3%的接
种量接入到初始pH7和谷氨酸钠3%的黄浆水优化
培养基中，在42 ℃条件下培养46 h，每隔2 h检测
发酵液的GABA含量、蛋白质含量、pH值和生物
量，以了解Lactobacillus bulgaricus 1.0205在发酵产
GABA过程的生理代谢情况，结果见图3。
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1%、KH2PO4 0.08%。通过对黄浆水优化培养基
的初始pH值和谷氨酸钠添加量的研究，确定初
始pH7.0、谷氨酸钠的添加量为3%。Lactobacillus
bulgaricus 1.0205的发酵动态研究表明了发酵过
程中生物量、蛋白质含量、pH值以及GABA含量
的变化情况，进一步说明Lactobacillus bulgaricus
1.0205的生长情况及其产GABA特性，确定最佳
发酵时间为40 h，此时发酵液中生物量(OD600)为
1.63，GABA 含量可达6.22 g/L。
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图3 Lactobacillus bulgaricus 1.0205发酵过程曲线
从图3可以看出，Lactobacillus bulgaricus
1.0205在黄浆水优化培养基中培养2 h后开始迅速
生长繁殖，在20 h时生物量达到最大。20~30 h内
生物量基本无变化，30 h之后生物量开始降低，
这可能是由于此时营养物匮乏，无法满足全部乳
酸菌的生长代谢，致使一部分乳酸菌死亡分解。
发酵液的蛋白质含量在0~12 h时略微上升，
这可能是由于在发酵初期阶段，乳酸菌将蛋白质
分解为分子量较小的肽类甚至氨基酸[15]，而考马
斯亮蓝染色是通过与氨基(尤其是碱性氨基酸和芳
香族氨基酸残基)显色反应而指征蛋白质含量，因
此在发酵初期表现为蛋白质含量略微上升。在12
h后，乳酸菌将发酵液中的氮源迅速消耗，在20 h
时几乎被消耗完。
在发酵过程中，pH值在初始阶段迅速下降，
这是由于乳酸菌在生长阶段产生大量的乳酸所
致。18 h时，pH值降到4.17。24 h后，pH值有所
上升，并保持稳定，这可能是由于酸性条件诱导
GAD的表达，进行谷氨酸钠脱羧反应，此反应过
程需要消耗溶液中的H+，所以pH值升高[16]。
在前18 h，GABA含量随着pH值的降低而增
加，这可能是由于GAD是一种酸性酶，随着pH的
降低，其活性开始增加，GABA的合成能力增强所
致[17]。在18~40 h期间，随着蛋白质含量的降低，
谷氨酸钠的利用率开始迅速增加，促进了GABA的
生成[18]。到40 h时，GABA含量达到6.22 g/L。而在
此之后，GABA含量开始大幅下降，此现象可能是
由于GABA被分解利用所导致[14]。
3 结论
通过对黄浆水培养基组分进行优化，得出
Lactobacillus bulgaricus 1.0205生产GABA最优培
养基条件为：葡萄糖2%、蛋白胨2%、(NH4)2SO4 (下转第16页)
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培养的目的。
3 结论
在单因素实验的基础上，利用响应面法对乳
酸乳球菌的发酵培养基进行了优化，建立了活菌
数与酵母粉浓度、酶水解酪蛋白浓度、碳酸钙浓
度3个因素的二次多项式回归模型，经验证实验证
明该模型合理可靠。
3个因素对菌株KLDS4.0424活菌数的影响大
小依次为：酵母粉＞酶水解酪蛋白＞碳酸钙。
最优培养基的组成为：碳酸钙5.57 g/L，酵母粉
9.80 g/L，酶水解酪蛋白8.74 g/L。在此条件下，菌
株KLDS4.0424发酵12 h后活菌数为3.10×109 cfu/
mL。
经发酵罐恒pH发酵，菌株KLDS4.0424的活菌
数达2.6×1010 cfu/mL，较优结果提高一个数量级。
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(上接第10页)
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