全 文 ：森林病虫通讯 Fo e rst Pe sta n dD ie sa se 1988。 3 : 15一 17
油桐根腐病菌醋酶同工酶测定
肖 育 贵
(四川省林业科学研究所 )
【摘要】 应 用聚丙烯酸胺凝胶垂直平板电泳 , 时油桐根腐病菌及国内发生的 8 种腐
皮镰抱 专化型菌株进行 了醋酶同工酶的测 定 。 分析表明 , 油桐根腐病菌F uS 盯 iu o s ol an i
( M a r t
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a e e .
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. a le u r i t i d i s c h e n e t X i a o f
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. 有三条醋 酶同工酶带 ,
其 中两条色浅且 宽 , 另一条色深带宽 , R , 值分 为 0 . 4、 0 . 61 、 0 . 89 , 与其他 8 种腐 皮镰
袍专化型均 有显著差异 , 为该菌新专化型的鉴定提供 了生理 生化指 标 。
油桐根腐病菌一一腐皮镰抱在自然中分布
十分广泛 , 其专化型众多 , 在形态上往往难以
区别 , 加之变异性大 , 在不同培养条件下其形
态都有不同 。但菌体中同工酶类由于受遗 传 基
因的控制 ,具有相对稳定性 。 1 9 8 6一 19 8 7年 ,我
们在研究油桐根腐病菌的形态特征 、 生物学特
性及寄生性的基础上 , 利用聚丙烯酸胺凝胶 电
泳 , 分析了该菌和其它 8种腐皮镰抱专化型菌
株之间的差异 。
菌种来源
油桐根腐病菌 F u s a r i u m s o l a n i于 19 8 5年 5
月 3 0 日从四川万县病株上分离得到 ; 甘薯专化
型 F . s o l a n 艺 f . s p . b a t a t u s 、 黄瓜专化型 F . s o la n i
f
. s p
. e o e u r b i t a t e
、 蚕豆专化型 F . s o la n i f . s p .
f u b a e
、 菜豆专化型 F . s o l a n i f . s p . p几a s e o l i 、
豌豆专化型 尸 . so la 瓜 f . sP . p is 、 桑专化 型
F
. s o l a n 落 f . s p . m o r i . 束IJ槐专化型 F . s o l a n ￡
f
. s p
. r o b i n ￡a e 、 马铃薯专化型 F . s o l a n ￡ f . s p .
。 “ m ar il 共 8 个国内发生的专化型菌 株分别 由
南京林业大学张素轩教授 、 兰莹副教授和云南
农业大学阮兴业教授提供 。
P D A斜面培养基上 25 ℃恒温培养 5 天 , 移接到
1 %马铃薯蔗糖液体培养基中 (马铃薯 10 克 、
蔗糖 10 克 、 蒸馏水 10 0 0毫升 ) , 25 ℃振荡培养
(每天振荡 4 小时 ) , 8 天后将菌液 2 0 0 0转 /分
离心 10 分钟收集菌体 , 经蒸馏水漂洗 2 次 , 用
滤纸吸干称重后置于 O一 4 ℃备 用 。
2
. 酶液制备 将每个供试菌株称取 4 克
菌体 , 注入 2 毫升蒸馏水和少许 1 8 0 0 目金钢
砂 , 在冰浴中研磨匀桨 , 加入样品提取液 4 毫
升 ( 0 . 2M 磷 酸缓冲液 , p H 6 . 7用 T r i s调到 7 . 5 )
混合后 , 置于冰箱中浸提 30 分钟 , 再在 。 ℃ 以
下 12 0 0 0转 /分离心 10 分钟 , 取上清液于指形管
中 O一 4 ℃备用 。
3
。 凝胶贮备液制备 按 表 1 配 方 配 制
后 , 在冰箱中保存 。
4
. 凝胶板制备 分别按表 1 将所需溶液
按序混合均匀后灌入胶板中 , 其上端注入一层
无离子水 , 置于 30 ℃恒温箱 中聚合 30 分钟后 ,
用吸水纸吸去胶粒和水 , 然后注入浓缩胶 , 再
置子3 0℃恒温箱中聚合 30 分钟 。
5
. 电泳分离 采用聚丙烯酞胺凝胶垂直
平板 电泳法 , p H连续缓冲凝胶的T ir s一柠檬酸
缓冲系统 , 电极缓冲液为 T ir s一甘氨 酸 , p H
二 、 试验方法
菌体培养 将供试菌株分 别 在 新 鲜
本文 由陈守常高级工程师审阅 , 实验得到王季勋高级工
程师指导 , 江玲同志 帮助 , 一并致谢 。
裹 1扭胶贮备液 a胶板创备砚方 门曰盛日洲川漏一日川漏编 贮 备 液 欲配 0 % 1配制浓编号 分离胶 胶漪要 ,药品名称 用 云 定落 体积 需要量
(克 )
1 T
r
i
s 15
。
5 用重燕水将两物 2 9 . 2毫升 1 7。 7毫升
2 柠像酸 1。 O 混合定溶到 10 。毫 4。 。 。毫升 0 。 0 3毫升
3 人 C r 2 4 。 3 5 升 2 6 。 8毫升 0 。 3毫升
4 B 15 0
。
7 5 用 1号液定 溶到 10 。 3 。 。毫升 6 。 O毫升
5 乙二胺四 0 。 1 87 毫升 。 . 0 2毫升 用于 电极
6 乙酸二钠 原液 用 1号液定 溶到 10 1 . 。毫升 缓冲液
7 T E M E D O
。
4 毫升
8 过硫酸按 1 0 用 1号液 15 毫升溶
A C r 2
。 5 解
B is 6
。
2 溶于 l。毫升重燕水
几 15 2 。 O 中
甘红酸 用重燕水定溶到
I Q0毫升
用重燕水定溶到
6 0 0 0毫升
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油桐根腐病 菌株与 8种专化型 菌株醉谱 比较图
三 、 结果分析
注 : 1 号贮备液 p H为 8 . 。 , 8 号贮备液 pH 为 8 . 7
6
.
7 , 每 .种供试样品点样 10 0微升 。 电泳前在上
槽缓冲液中加入一滴 0 . 2%澳酚兰作为指示剂 。
电泳在冰箱中进行 , 开始 以 10 毫安 /厘米电流
强度 , 待澳酚兰在胶板上呈一条直线后 , 加大
电流为 25 毫安 / 25 0伏 。 嗅酚兰泳动到离胶板下
端约 1 . 5厘米左右停止电泳 。
6
. 染色 电泳完毕后取出胶板 , 用 T ir s
_柠檬酸缓冲液漂洗 10 分钟 , 置于染色液中 ,
在 30 ℃ 条件下染色至 酶带清晰可见后 , 用流水
冲洗半小时 , 放入 70 %醋酸中保存 。
7
.酶带确定 将所有供试样品酶带出现的
位置 , 按向正极泳动的速度顺序编号 ( E , E Z
… … ) , 求算酶带的相对泳动率 ( R . 值 ) 。
1
. 酶谱比较 供试菌株经 4 次重复试验 ,
各自醋酶图形稳定 。 油桐根腐病菌株有三条酶
带 , 二条带宽而色浅 , 一条带宽色深 , 与其它
8 种专化型显著不同 (见上图 ) 。 那些酶带数目
相同的菌株 ,其带宽色泽差异显著 , 说明菌体内
含的醋酶同工酶分子数目相同 , 但由于各菌株
体内基因碱基排列顺序的差异 , 表现出醋酶分
子的结构 、 大小的不同 , 从而影响到酶谱的色
泽 、 宽窄的差异 。 可 以认为 , 菌株的寄主范围
和寄生性主要是由菌株体内生理生化所决定 。
2
. 相对泳动率比较 相对泳动率主要由
酶蛋白分子所带的电荷和分子量大小决定。 在
电泳过程中 , 因电场和凝胶分子筛的作用 , 将
表 2 油桐根腐病 , 与供试 , 株 . 日同工璐电泳 . 带相对迁移率 ( R `位 )
公石,澳赘带序 ” E i E : { ( E ` E , E . E , E 1 . E i : E i : E i , 醉. 一 、 \ E 3
}
E ` 带
一 -一 _二 一 \ 、 \ { 数 (条〕比试菌株 一一一 ~一 :
马铂薯专型化 0 。 2 6 0 。 4 0 0 。 4 4 0 。 5 1 0 。 5 6 0 。 59 0 一 6 2 0 。 6 5 0一 7 1 0 。 7 6 0 。 8 1 0 。 8 3 0 。 8 9 4
桑专化型 0 。 4 5 0 。 52 0 。 6 0 0 。 6 1 0 。 7 0 0 . 7 9 0 . 8 1 0 。 9 1 4
刺槐专化型 0 。 4 9 0 。 5 9 0 。 7 1 0 。 7 8 0 。 8 1 0 。 8 9 4
黄瓜专化型 0 。 6马 0 。 7 6 0 。 3 1 3
莱豆专化型 3
蚕豆专化型 4
豌豆专 化型 2
甘薯 专化型 3
油桐根腐病 苗株 、 3
菌体中各种蛋白质分子分离, 经特殊染色而显
示出酶带 。 从表 2看 出 ,各供试菌株醋酶同 I 酶
R : 值有显著的差异 。 在酶带数目相同的菌 株
中 , 各条酶带的 R , 值没有一条相同 。 这主要
是各酶分子所带 电荷和结构 、 大 小 而 引起 。
四 、 结 论
利用聚丙烯酞胺凝胶垂直平板电泳技术 ,
对 9 种不同寄主 上分离的腐皮镰抱醋酶同工酶
分析表明 , 在不同寄主上寄生的同一种类腐皮
抱 ,不仅在形态特 征上不同 ,而且直接表现在醋
酶 同工酶上的差异 。 这种差 异性直接反应了腐
皮镰抱不同的专化型生理生化特性以及在 D N A
上基 因片段的微弱变化 。 因此 , 用凝胶电泳技
术对腐皮镰抱专化型的划分具有实际意义 。
, 考 文 峨
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(责任编辑 周水林 )
第十八届国际昆虫学大会在加拿大温哥华举行
第 18 届国际昆虫学会于 1 9 8 8年 7月 3 日至 9日在加拿大温哥华举行 , 与会代表 3 0 0 0余人 ,历时 {
夭 ,盛况空前。 加拿大政府对本届大会的召开极为重视 ,政府科技部长 、 哥伦比亚州环境与公园音
长等参加开幕式并致词祝贺 , 加邮政总局特地为大会发行了四枚一套彩蝶纪念邮票 。 大会分下只
个组进行学术交流 : ( 1 ) 分类学 、 动物地理学与古生物学 , ( 2 ) 细胞生物学生理及生物化学 ,
( 3 ) 形态学与进化 , ( 4 ) 遗传学与物种形成 , ( 5 ) 行为学 , ( 6 ) 生态学 , ( 7 ) 社会性
昆虫与养蜂业 , ( 8 ) 昆虫病理学与生物防治 , 又 9 ) 卫生与畜牧业昆虫学 (包括法医昆虫学 ) ,
<10 ) 农业昆虫学及害虫治理 , l( l) 森林昆虫学及害虫治理 , ( 12 ) 仓库及建筑害虫 , ( 13 )
昆虫毒理学 , ( 14) 农药进展 、 管理与调节 。 大会共收到论文摘要 2 0 0 0余篇 , 其中直接论述森林
昆虫的论文有 20 0多篇 , 占10 %左右 。 从总的趋势来看 ,国际上当前对昆虫分类学 、 生态学 、 生理生
化及行为科学的基础研究十分活跃 , 而且各学科之间相互渗透 , 不断取得新进展 。 例如本届大会
的开幕词与闭幕词就是关于保幼激素与性外激素研究内容及其趋势的论述 , 并认为随着对这些问
题研究的深入将会促进其他学科的发展 。 美国著名科学家 W . L . 罗洛夫根据性外激素左右光学对
称性的不 同而将红带卷叶蛾分为 “ 左撇子” 与 “ 右撇子 ” 两个种 , 这对于传统的昆虫分类学无疑
是一种挑战或补充 。 另一方面 , 生物防治及森林害虫综合防治等应用技术进展很快 , 成效显著 。
大会还设立了展览厅与巨大帐篷 , 各国科学家在此展现或介绍 自已的研究成果 、 图书资料 、
仪器设备等 , 特别是板报 ( p os )t , 图文并茂 , 且作者恭候其侧 , 现身说法 , 亲切生动 。
经过中国代表团和与会同志的努力和争取 , 下届 (即第 19 届 ) 国际昆虫学大会将于 1 9 9 2年在
北京召开 。 这对我国的科学技术 , 特别是昆虫学的发展将是一个有力的推动 。 我国代表团团长朱
弘复研究员在闭幕式作答词 , 欢迎 各国科学家届时光临北京 , 受到与会代表的热烈鼓掌欢迎 。
(赵清山 )