全 文 ：123※工艺技术 食品科学 2009, Vol. 30, No. 14
蚕蛹多肽的制备工艺及其体外抗氧化活性
闵建华，李建科 *，陈 婷
(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062)
摘 要：采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解蚕蛹蛋白，以水解度和清除
DPPH·能力为指标对酶解过程进行分析，并研究水解产物多肽的体外抗氧化活性。结果表明，碱性蛋白酶对蚕
蛹蛋白具有较好的水解效果，其水解产物有较高抗氧化活性，对DPPH·、超氧阴离子自由基(O 2·)和羟自由基
(·O H )都具有较强的清除能力。
关键词：蚕蛹蛋白；水解；抗氧化性
Preparation and Antioxidant Activity in vitro of Silkworm Pupa Polypeptide
MIN Jian-hua，LI Jian-ke*，CHEN Ting
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xian 710062, China)
Abstract ：As a high quality protein resource that contains 18 amino acids including 8 essential ones accounting for 40% of total
amino acids, silkworm pupa protein is more nutritional than soybean protein isolate. However, silkworm pupa protein is
generally processed into powder with poor water solubility and unfavorable odor, which greatly retards its application in food
industry. Silkworm pupa protein was hydrolyzed with five proteases (Alcalase, Flavourzyme, Protamex, Papain and Trypsin)
respectively. Alcalase was confirmed as an optimal enzyme preparation to prepare silkworm pupa polypeptide in terms of
degree of hydrolysis (DH) of material and DPPH· scavenging activity of hydrolysates. The enzymatic hydrolysis procedure
was optimized using orthogonal array method and the corresponding product was subjected to further analysis of antioxidant
activity such as reducing power and O2·, ·OH and DPPH·scavenging activities. The optimal Alcalase-catalyzed hydrolysis
parameters were as follows: substrate concentration 4%, enzyme/substrate concentration ratio 2:100, temperature 60 ℃, pH 4,
and hydrolysis duration 4 h, and under such conditions a DH of 28.2% was achieved. The hydrolysis product could effectively
scavenge DPPH·, O2· and OH· radicals, suggesting its strong antioxidant activity.
Key words：silkworm pupa protein； hydrolysis；antioxidant activity
中图分类号：TQ936.16 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)14-0123-04
收稿日期：2008-10-17
作者简介：闵建华(1982－)，男，硕士研究生，研究方向为食品营养与卫生。E-mail：bobo123876@stu.snnu.edu.cn
*通讯作者：李建科(1960－)，男，教授，博士，研究方向为食品营养与安全。E-mail：jiankel@snnu.edu.cn
生物活性肽是由蛋白质水解产生的含有数个到数十
个氨基酸组成的具有特殊生理功能的多肽类物质，其不
仅能够提供人体生长发育所需的营养物质，且具有重要
的生理功能，如神经、激素和免疫调节、抗血栓、抗
高血压、抗胆固醇、抗细菌、抗病毒、抗癌、抗氧
化、抗衰老等生理活性。生物活性肽的研究开发利用
已经成为全球食品和营养等相关领域研究的一个重要发
展方向 [ 1 ]。
蚕蛹蛋白是一种优质蛋白质资源，含有 18种氨基
酸，其中 8种人体必需氨基酸含量超过氨基酸总量 40%
以上，是一种比大豆蛋白更具营养价值的优质蛋白质资
源。我国蚕蛹资源非常丰富，但是长期以来，国内生
产的蚕蛹产品主要为蚕蛹蛋白粉，这种蛋白粉水溶性
差，含有一定的腥味，极大的阻碍了其在食品工业中
的应用。本实验拟以蚕蛹蛋白为原料，采用酶水解法
制备蚕蛹蛋白肽，研究水解过程中水解度的变化，并
对水解产物的还原力及清除自由基的能力进行探讨，以
期为充分利用我国丰富的蚕蛹资源，促进蚕蛹深加工及
工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蚕蛹 陕西安康百瑞丝绸有限公司；蚕蛹蛋白粉
自制。
－
－
－
2009, Vol. 30, No. 14 食品科学 ※工艺技术124
碱性蛋白酶(alcalase)、风味蛋白酶(flavourzyme)、
复合蛋白酶(protamex) 丹麦Novo酶制剂公司；木瓜蛋
白酶、胰蛋白酶 Amresco生化试剂公司；牛血清白
蛋白 北京舟鼎国生物技术有限责任公司；DPPH· 美
国 Sigma 公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
KDY-9810型凯氏定氮仪 KeTUO公司；501(A)型
超级恒温器 上海实验仪器厂有限公司；TGL-16G型高
速离心机 上海安亭科学仪器厂；真空冷冻干燥机 巩
义予华仪器有限责任公司；雷磁 PHS-3C型精密 pH计
上海精密科学仪器有限公司；XX80EL005型超滤设备、
超滤膜(截留分子量 30万 D、1万 D，滤膜有效面积为
0.1m2) Milipore 公司；JB-3型定时恒温磁力搅拌器 上
海雷磁新泾仪器有限公司。
1.3 蚕蛹蛋白多肽的制备
1.3.1 蚕蛹蛋白酶解工艺
取一定量蚕蛹蛋白粉，按 4%(m/V)底物浓度加入双
蒸水，在夹层玻璃反应器中搅拌，待温度恒定后，调
节一定的 pH值，按酶与底物比(E/S)为 2:100(m/m，每
100g蛋白质中所加的酶为 2g)加入蛋白酶开始水解，搅
拌状态下不断加入 0.5mol/L NaOH，以使反应体系的 pH
值始终维持在实验规定值范围内，用 pH-stat法测定水
解度，水解一定时间后，终止反应，沸水浴灭酶
15min。冷却后以 4000r/min离心 20min，收集上清液
4℃贮藏备用。
1.3.2 水解度的测定
采用 pH-stat法[2]，以式(1)计算水解度，此处水解
度的含义为水解打断的肽键数目占原料蛋白质中总肽键
数的百分数。

C×V
DH(%)=———————× 100
α×mp× htot
式中：C、V分别为水解过程中所加 NaOH的浓度
(mol/L)和体积(ml)；mp为原料中净蛋白质质量(g)；h to t
为 1g原料蛋白质中所含肽键的毫摩尔数(取为 7.8mmol/g
蛋白)；α为氨基的平均解离度，可按α= ————计算
(pH为水解溶液的 pH值，pK为α-氨基的解离度的负对
数，此处取值为 7 . 0 )。
1.3.3 水解工艺条件的优化
利用正交试验设计法，选定温度、p H 值、底物
浓度、酶用量为考察因素，以蚕蛹蛋白水解度为指标，
确定最佳酶解条件。
1.3.4 蚕蛹蛋白活性多肽的分离
参考文献[3]、[4]，在最佳酶解工艺条件下进行水
解，水解液 10000r/min离心 10min，上清液通过截留分
子量为 10000D的超滤膜进行分离，收集滤过液冷冻干
燥；超滤分离条件为操作压力 0.1M Pa，温度为常温。
1.4 蚕蛹蛋白多肽体外抗氧化活性的研究
1.4.1 还原能力的测定
采用普鲁士兰法，参照文献[5 ]的方法测定。反应
液在 700nm处的吸光度越高，还原力越强，抗氧化性
越好。
1.4.2 清除超氧阴离子自由基(O2·)能力测定
采用核黄素 -光 -氮蓝四唑体系测定，参照文献[6]
的方法。

A0－A
O2·清除率(%)=————× 100

A0
式中：A 0为空白对照液 560nm时的吸光度；A为
样品液 560nm时吸光度。
1.4.3 清除羟自由基(·OH)能力测定
采用邻二氮菲 -Fe 2+氧化法，参照文献[7]测定。

A－A0
·OH清除率(%)=(1－————)× 100

A1－A2
式中：A 为加样品而不加 H 2O 2 的反应管吸光度；
A0为加入样品及 H2O2的反应管吸光度；A1为不加样品
也不加H2O2的反应管吸光度；A2为加H2O2而不加样品
的反应管吸光度。
1.4.4 清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)活性测定
方法
参考 Negi [8 ]和 Kaur [5 ]的方法，在此基础上进行改
进。在比色皿中加入1.95ml质量浓度为24mg/L的DPPH·
乙醇(体积分数 95%)溶液，测定其在波长 515nm处的吸
光度，然后加入 50μl样品，记录加入提取物溶液后第
2、3、4、5min的吸光度，5min后每 5min记录吸光
度 1次，直到吸光度的改变在每分钟内不超过 0.003单
位为止。

A0－At
DPPH·清除率(%)=—————× 100

A0
式中：A 0 为 D PPH·乙醇溶液与对应溶剂的吸光
度；A t为加入样品后 D PPH·乙醇溶液时的吸光度。
2 结果与分析
2.1 水解蚕蛹蛋白最适用酶的选择
具有生理活性的多肽主要是一些分子量较小的肽
段，而蚕蛹蛋白的水解度大小直接决定了多肽的分子量
大小，所以活性较强的肽段可能是那些水解度较大的酶
的酶解产物。而酶的专一性决定了某种蛋白酶可能只对
10pH－ pk
1+10pH－pK
－
－
125※工艺技术 食品科学 2009, Vol. 30, No. 14
某些肽键或带有某种基团的氨基酸所形成的肽键作用[9]。
因此，不同的蛋白酶具有不同的水解度，酶解产物的
活性也会不一样，在筛选制备蚕蛹抗氧化肽的最适酶种
时，不仅需要考虑水解度的大小，还应该考虑酶解物
的抗氧化能力大小。DPPH·是一种较为稳定的以氮为
中心的自由基，化学性质稳定，不易被清除，若受试
物能够清除它，则表示受试物具有较强的自由基清除能
力[10]。因此，DPPH·清除模型是一种广泛用于评价抗
氧化剂自由基清除能力的快速方法。
由图 1可知，在前 30min内，各酶水解度增速较
快，其后逐渐趋于平缓，表现出各自不同的特性。随
着酶解的进行，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的水解度增大趋
势明显，一直高于木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋
白酶的水解度；1h 后，除碱性蛋白酶外，其他四种蛋
白酶水解进程曲线变得很平缓，其水解度明显低于碱性
蛋白酶。因此可以认为碱性蛋白酶不仅具有较高的酶活
力，同时也具有较好的稳定性。从图 2 可以看出，各
蛋白酶对蚕蛹蛋白的 DH不同，其清除 DPPH·能力大
小也不同，在实验研究的范围内，DH 与清除 DPPH·
能力呈正相关；碱性蛋白酶 DH最高，其水解产物清除
DPPH·能力也最强，达到 63.4%，大大高于其他四种
蛋白酶水解液对其的清除能力，所以选择碱性蛋白酶为
蚕蛹蛋白的水解用酶。
试验 号
因素
水解度(%)
A底物浓度(%) B酶与底物比(m/m) C 温度(℃) D pH
1 1(2) 1(1.5:100) 1(40) 1(7.0) 17.2
2 1 2(2:100) 2(50) 2(8.0) 27.4
3 1 3(2.5:100) 3(60) 3(9.0) 21.0
4 2(4) 1 2 3 20.6
5 2 2 3 1 24.9
6 2 3 1 2 25.5
7 3(6) 1 3 2 26.4
8 3 2 1 3 23.8
9 3 3 2 1 19.7
k 1 21.87 21.40 22.17 20.60
k 2 23.67 25.37 22.57 26.43
k 3 23.30 22.07 24.10 21.80
R 1.80 3.97 1.93 5.83
表1 正交试验设计及结果
Table 1 Orthogonal array design arrangement for optimizing
Alcalase-catalyzed hydrolysis of silkworm pupa protein and the
experimental data
1 .碱性蛋白酶；2 .风味蛋白酶；3 .木瓜
蛋白酶；4 .胰蛋白酶；5 .复合蛋白酶。
图2 5种蛋白酶的水解度和水解产物的DPPH·清除能力
Fig.2 Comparison of DHs and scavenging DPPH· scavenging
activities of the hydrolysates of silkworm pupa protein by five
proteases at the end of hydrolysis
30
25
20
15
10
5
0
水解度
DPPH·清除率
水
解
度
(%
)
1 2 3 4 5
70
60
50
40
30
20
10
0
D
P
P
H
·
清
除
率
(
%
)
图1 5种蛋白酶水解进程曲线
Fig.1 Hydrolysis course curves of silkworm pupa protein by five
pro teases
30
25
20
15
10
5
0
碱性蛋白酶
木瓜蛋白酶
复合蛋白酶
水
解
度
(%
)
时间(min)
0 50 100 150 200 250
风味蛋白酶
胰蛋白酶
一样，得到的多肽活性强度也不同。本实验目的是得
到高活性的较短的多肽，因此，在提高水解度的同时，
研究了水解产物多肽的抗氧化活性。本实验在单因素试
验的基础上，选用底物浓度、酶与底物比、温度、pH
值为主要考察因素，利用正交试验设计对水解蚕蛹蛋白
的工艺条件进行了优化，试验结果见表 1。
由表 1可知，影响水解度大小的主要因素为 pH值
(D)，其次为酶用量(B)，各因素的主次顺序是D>B>C>
A；最佳酶解条件为 A2B 2C3D2，即底物浓度为 4%、酶
与底物比(E/S)2:100、水解温度 60℃、水解 pH值 8.0、
时间 4h。通过验证实验，在此条件下，蚕蛹蛋白的水
解度为 28.2%，其水解液按 1.3.4节方法超滤分离，冻
干滤过液，对冻干粉进行体外抗氧化活性研究。
2.3 蚕蛹蛋白多肽体外抗氧化活性研究
2.3.1 蚕蛹蛋白水解液的还原力测定
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
多肽
BHT
吸
光
度
多肽浓度(mg/ml)
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
图3 水解产物还原能力
Fig.3 Relationships between reducing power and concentration
of Alcalase-hydrolyzed silkworm pupa protein and BHT
还原力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指
标，抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子而使自由基
变为稳定的分子，从而失去活性。还原力越强，抗氧
化性越强。因此，可通过测定还原力来说明抗氧化活
性的大小。由图 3 可看出，随着多肽浓度的增加，吸
2.2 蚕蛹蛋白酶解工艺条件的优化
对于同一种蛋白酶，水解条件不同，水解度会不
2009, Vol. 30, No. 14 食品科学 ※工艺技术126
光度增大，相应的还原力增强。当浓度大于 0.2mg/ml
时，水解液的吸光度明显高于对照物 B HT，表明蚕蛹
蛋白水解液具有较强的还原能力。
2.3.2 蚕蛹蛋白多肽清除 O 2·能力测定
超氧阴离子自由基( O 2·)不仅具有重要的生物功
能，也与多种疾病有密切的联系。它是基态氧接受一
个电子后形成的第一个氧自由基，可经过一系列反应生
成其他的氧自由基，因此具有特别重要的意义。由图 4
可知，在检测浓度范围内，蚕蛹蛋白多肽对 O 2·的清
除率随着多肽浓度的增加而增高；在同一浓度下，其清
除O2·的能力大大高于BHT，同时也高于文献[11]报道
同种酶作用条件下大豆多肽的清除 O 2·能力。因此，
蚕蛹蛋白多肽具有较好的清除超氧阴离子的能力。
3 结 论
3.1 根据酶的作用位点的专一性特点，分析了 5种酶水
解蚕蛹蛋白的水解进程及其水解产物蚕蛹蛋白多肽清除
DPPH·能力大小，筛选出碱性蛋白酶为最佳水解酶。
3.2 优化了碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白的工艺，得到
最佳酶解工艺条件为底物浓度 4%，酶与底物比(E/S)
2:100、水解温度 60℃、pH8 .0、时间 4h。
3.3 研究了水解产物的还原力及清除自由基能力大小，
其清除自由基能力的大小顺序为DPPH>O2·>·OH，对
D P P H、O 2·和·O H 具有较好的清除能力，说明蚕
蛹多肽可以作为一种良好的抗氧化剂应用于食品工业。
参考文献：
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－
图4 多肽对O2·的清除能力
Fig.4 Relationships between O2·scavenging activity and concen-
tration of Alcalase-hydrolyzed silkworm pupa protein and BHT
80
60
40
20
0
多肽
BHT
清
除
率
(%
)
多肽浓度(mg/ml)
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
－
－
2.3.3 蚕蛹蛋白多肽清除·OH 能力测定
羟自由基(·OH)是已知的最活泼的活性氧自由基，
也是毒性最大的氧自由基。它几乎能与活细胞中任何分
子发生反应，可介导机体组织脂质过氧化，蛋白质解
聚、聚合，核酸断裂和多糖裂解等生化过程，引发组织
细胞病变，导致各种疾病发生和加速机体衰老。由图 5
可以看出，蚕蛹多肽清除· OH能力和对照物BHT相似，
在浓度小于 20mg/ml时，其清除·OH能力小于 BHT；
在浓度大于 30mg/ml时，其清除·OH能力稍大于BHT，
但低于文献[12]报道的VC对羟自由基的清除率。
样品直接捕获或与 DPPH·相结合的行为，可以大致推
测抗氧化剂对芳香自由基的清除能力[10 ]。由图 6可知，
蚕蛹蛋白多肽清除 DPPH·的能力很强，明显高于对照
组 B HT；在研究的浓度范围内，随着浓度的增大，其
清除能力也逐渐增强，呈现较好的量效关系。因此，
蚕蛹蛋白多肽具有较好的清除 DPPH·能力。
图6 多肽对DPPH·的清除能力
Fig.6 Relationships between DPPH·scavenging activity and
concentration of Alcalase-hydrolyzed silkworm pupa protein and BHT
多肽浓度(mg/ml)
80
60
40
20
0
清
除
率
(%
)
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
多肽
BHT
图5 水解产物对·OH的清除能力
Fig.5 Relationships between·OH scavenging activity and
concentration of Alcalase-hydrolyzed silkworm pupa protein and BHT
60
50
40
30
20
10
0
清
除
率
(%
)
多肽浓度(mg/ml)
1 2 3 4 5 6
多肽
BHT
－
－
－
－
2.3.4 蚕蛹蛋白多肽清除 DPPH·能力测定
DPPH·是一种较为稳定的以氮为中心的自由基，
它具有 3个芳环结构，属于芳香类自由基，研究抗氧剂
－ －