全 文 ：复合酶法制备早籼米多孔淀粉的工艺条件
何国庆＊　刘彩琴　陈启和　阮　晖　邬应龙
(浙江大学 生物系统工程与食品科学学院 , 浙江杭州 310029;＊通讯联系人 , E-mail:gqhe@z ju.edu.cn)
Hydroly sis Conditions for Porous Starch Preparation w ith Early-indica Rice
by Compound Enzyming
HE Guo-qing ＊ , LIU Cai-qin , CHEN Qi-he , RUAN Hui , WU Ying-long
(College o f B iosystem Engineer ing and Food Science , Z hej iang Universi ty , Hangzhou310029 , China;＊Correspond ing author , E-mail:gqhe
@z ju.edu.cn)
Abstract:Po rous starch is a good car rier as many functional components in food o r medicine industry.The preparation
methods for porous starch usingα-amy lase and glucoamylase to hydro lyze early indica rice starch were presented.Main hydro-
lyzing factor s such as temperature , pH value, time and quantity of the enzymes were investigated by statistical method.In
each case, the best technique conditions for preparing po rous starch were different fo r three respo nse values:yield rate, water
abso rption and adsorption capacity of ponceau 4R.Based on the water absorption of po rous starch , the best condition obtained
from enzymatic experiment was the enzymatic temperature 55℃, pH 4.0 and hydrolyzing time 16 h , the ratio of α-amylase to
glucoamy lase in volume 1∶3 , enzyme active 14.00 KNU/ g , 90.00 AGU/ g , respectively.When validated twice under the opti-
mized co nditions , the po rous starch yield rate w as 41.07% and 43.37%, water absorption w as 148.03% and 155.61%, ad-
sorption capacity of ponceau 4R was 9.37 mg/ g and 9.38 mg/ g , respectively.
Key words:po rous starch;α-amylase;glucoamy lase;hy droly sis condition;early indica rice
摘　要:以早籼米淀粉为原料 ,探讨了复合酶法制备多孔淀粉的工艺条件。在适宜条件下用一定比例的α-淀粉酶与糖化酶复合酶水解早籼米淀粉 ,以形成多孔淀粉。主要考查了温度、pH 值 、时间、酶用量和复合酶比对多孔淀粉得率、吸水率
和吸附色素能力的影响。研究表明 ,针对多孔淀粉的得率、吸水率和对胭脂红吸附量 3个指标 , 其最佳工艺条件不一致 ,以吸水率最佳为标准 ,最佳制备条件为温度 55℃, pH 4.0 ,时间 16 h , α-淀粉酶与糖化酶体积比 1∶3 ,酶活分别为 14.00 KNU/
g和 90.00 AGU/ g。在此条件下经两次验证 , 多孔淀粉的得率分别为 41.07%和 43.37%, 吸水率分别为 148.03%和
155.61%,对胭脂红的吸附量分别为 9.37 mg/ g 和 9.38 mg/ g 。
关键词:多孔淀粉;α-淀粉酶;糖化酶;水解条件;早籼米
中图分类号:S511.099;TS236 文献标识码:A 文章编号:1001-7216(2006)02-0227-04
　　多孔淀粉是用物理 、机械以及生物方法使淀粉颗粒由表
面至内部形成孔洞的淀粉[1] 。由于其表面具有很多伸向淀
粉中心的小孔 ,因而具有良好的性能 ,可用作功能性物质(如
药剂、香料 、色素 、保健物质)的吸附载体 ,广泛应用于医药 、
化工和食品等工业[2] ,其吸附性能尤以酶法制备的多孔淀粉
为好[ 1] 。酶法制备的多孔淀粉是将天然淀粉经酶水解处理
而形成的一种蜂窝状 、多孔性淀粉载体[ 3] ;而且酶对淀粉的
水解并非均一 ,有些部位较易被酶水解 ,孔大且深 ,有些部位
只留下痕迹[ 4] 。所以 , 制备的工艺条件(酶 ,包括酶的品
种[ 5] 、来源[ 6] 、浓度等;作用条件 ,包括反应的温度 、pH 值、时
间 、搅拌程度以及反应的介质等)极大影响着多孔淀粉的形
成和产品的得率[ 1 , 7] 。早籼米制备多孔淀粉的研究较少 ,且
早籼米营养价值不高 ,如果对其进行开发 ,可提高其附加值;
但早籼米淀粉有时是以复合淀粉粒形式存在 ,呈球形或椭圆
形 ,直径为 7 ～ 39 μm , 内部包含有约 20 ～ 60个小淀粉颗粒;
在所有已知谷物当中 ,大米淀粉颗粒最小 ,粒径约为 3 ～ 8 μm
[ 8] ,特别的分子结构使单酶制备效果较差 。因此本研究探讨
α-淀粉酶与糖化酶复合酶配比的条件并对早籼米淀粉进行水
解 ,得到了吸附性能较好的产品 。
1　材料与方法
1.1　实验材料与试剂
早籼米淀粉;α-淀粉酶:NOVO 诺和强效耐高温淀粉酶
LS型(Termamyl , Type LS Plus),酶活 , 140 KNU/g;糖化
酶:NOVO 的 AMG(Amylog lucosidase Novo),酶活为 250
AGU/g;无水醋酸钠;冰乙酸;葡萄糖;苯酚;氢氧化钠;亚硫
酸氢钠;3 ,5-二硝基水杨酸;酒石酸钾钠;胭脂红 。试剂均为
分析纯 。
1.2　实验设备
DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器(江苏太仓市实验设
备厂);LXJ-ⅡB型离心机(上海医用分析仪器厂);SHZ-Ⅲ型
循环水真空泵(浙江临海市精工真空设备厂);UV-2102 PC
型紫外可见分光光度计 [ 尤尼柯(上海)仪器有限公司 ] ;
101A-2型干燥箱(上海市实验仪器厂);FA1004型分析天平
(上海天屏仪器仪表有限公司)。
1.3　检测方法
1.3.1　多孔淀粉得率的测定
多孔淀粉得率为早籼米淀粉水解后所得产品的质量与
原淀粉质量的百分比值 。水解生成的还原糖用 3 , 5-二硝基
水杨酸法测定[ 9] 。
1.3.2　多孔淀粉吸水率的测定
将精确称量的多孔淀粉(干基)与适量蒸馏水混合搅拌
收稿日期:2005-02-01;修改稿收到日期:2005-03-21。
基金项目:浙江省重大招标项目(021102528)。
第一作者简介:何国庆(1957-),男 ,博士 ,教授。
227
中国水稻科学(Chinese J Rice Sci), 2006 , 20(2):227～ 230
http:// www.ricescience.org
30 min ,1800 r/min下离心30 min ,根据其吸水前后质量差计
算吸水率 。
1.3.3　多孔淀粉对胭脂红吸附量的测定
取多孔淀粉 0.5 g ,浸泡于 10 mL 浓度分别为 0.2 、0.4 、
0.6 、0.8 、1.0 m g/mL的胭脂红溶液中 ,振荡 ,计时 2 h后 ,
将淀粉液过滤 ,在 515 nm处测定滤液的吸光度 ,查标准曲线
换算成浓度并计算淀粉对胭脂红的吸附量 ,据吸附量曲线确
定 0.6 mg/mL 为最佳吸附浓度 。在最佳吸附浓度下测定并
计算淀粉对胭脂红的吸附量 。
1.4　多孔淀粉的制备
称取适量早籼米淀粉 ,置于 250 mL三角瓶中 ,加入适量
一定 pH值的醋酸钠缓冲液 ,置于一定温度的恒温振荡水浴
锅中预热 20 min。精确量取酶液 ,用适量缓冲液全部转移到
淀粉悬浮液中 ,反应一定时间后 ,停止反应 ,将悬浮液在 3000
r/min下离心 5 min ,上清液移入容量瓶中 ,待测定还原糖用;
沉淀置砂芯漏斗中 ,经水洗 、抽滤 、干燥得多孔淀粉制品 。
2　结果与分析
2.1　复合酶正交试验 Ⅰ
复合酶正交试验 Ⅰ试验因素及水平见表 1 ,结果见表 2 。
产品得率是制备多孔淀粉的重要控制指标 ,吸附性能可
直接反映出淀粉多孔形成情况 ,形成多孔状结构后 ,有一定
的孔容 ,同时比表面积增大 ,对某些液体吸附能力增大[ 6] 。
总体上说 ,当多孔淀粉得率在 60%～ 70%时 ,为最佳的吸附
区间[ 10] 。对表 2 作极差分析 , 多孔淀粉得率最佳的条件为
A1B1C3D1 ,即温度 40℃、pH 4.0 、时间 24 h 、α-淀粉酶与糖化
酶体积之比为 2 ∶1 , 酶活分别 为 18.67 KNU/g 和
20.00 AGU/g ;主次因素次序为温度 、时间 、酶量 、pH 。最佳
吸水率条件为 A 3B2C2D3 ,即温度 50℃、pH 5.0 、时间 20 h 、α-
淀粉酶与糖化酶体积之比为 1∶2 ,酶活分别为 9.33 KNU/g
和40.00 AGU/g;主次因素次序为 pH 、酶量 、温度 、时间 。吸
附胭脂红色素的最佳条件是 A3B2C2D3 ,即温度 50℃, pH 5.
0 ,时间 20 h , α-淀粉酶与糖化酶体积之比为 1∶2 ,酶活分别
为 9.33 KNU/g 和 40.00 AGU/g;主次因素次序为时间 、酶
量 、pH 、温度。在得率最佳的反应条件下 ,吸水率和对胭脂红
的吸附量都较低 ,故不考虑此产品得率的条件 。在吸水率和
吸附色素的最佳工艺条件下验证 , 多孔淀粉的得率为
51.59%,吸水率为 123.75%, 对胭脂红的吸附量为 8.13
mg/g 。
2.2　复合酶正交试验Ⅱ
由复合酶正交试验方案 Ⅰ得知α-淀粉酶与糖化酶体积
之比为 1∶2时 ,多孔淀粉的吸水率最高 ,说明α-淀粉酶用量
小于糖化酶用量时效果较好 ,故考虑以α-淀粉酶与糖化酶体
积之比为 1∶2 、1∶4 、1∶6 、1∶8 进一步试验 。试验因素及
水平的设置见表 3 ,结果见表 4。
对表 4作极差分析 ,最佳得率的条件是 B1C1 D4 ,即 α-淀
粉酶与糖化酶体积之比为 1∶8 ,酶活分别为 3.11 KNU/g 和
53.33 AGU/g , pH 4.0 ,时间 16 h;以酶量的影响最大 。最佳
吸水率条件是 B1C1D2 ,即α-淀粉酶与糖化酶体积之比为 1∶
4 ,酶活分别为 5.60 KNU/g和 48.00 AGU/g , pH 4.0 ,时间
16 h;以酶量的影响最大 。吸附胭脂红色素的最佳条件是
B2C2D3 ,即α-淀粉酶与糖化酶体积之比为 1∶6 ,酶活分别为
4.00 KNU/g和 51.43 AGU/g , pH 5.0 ,时间 20 h;其中以
pH的影响最大 。此正交试验中吸水率和对胭脂红的最佳吸
附量的制备条件不同 ,可能是水和胭脂红(分子结构中含有
苯环和两个磺酸基)分子结构不同 ,与多孔淀粉的亲水基结
合能力不同造成的 。在最佳吸水率条件下验证 ,多孔淀粉的
得率为 46.08%,吸水率为 126.17%。验证结果低于试验结
果 ,故此方案下最佳反应条件是 pH 5.0 ,时间 20 h , α-淀粉酶
与糖化酶体积之比为 1 ∶4 , 酶活分别为 5.60 KNU/g 和
48.00 AGU/g 。
表 1　复合酶正交试验Ⅰ因素及水平
Table 1 .Factors and levels of compound enzymes in perpendicular ex-
perimentⅠ .
水平
Level
温度
Temp.(A)
/ ℃
pH(B)
时间
Time(C)
/ h
酶量 Enzyme(D)
酶比1)
Ratio
1)
α-淀粉酶酶活
α-amylase
/(KN U· g-1)
糖化酶酶活
Glucoamylase
/(AGU· g-1)
1 40 4.0 16 2∶1 18.67 20.00
2 45 5.0 20 1∶1 14.00 30.00
3 50 6.0 24 1∶2 9.33 40.00
　　1)α-淀粉酶与糖化酶体积之比 ,下同。
1)Ratio ofα-amylase to glucoamylase.The same as in the tab les
below.
表 2　复合酶水解正交试验Ⅰ数据
Table 2.Data of the perpendicular experimentⅠ .
序号
No.
因素 Factor
A B C D
多孔淀粉得率
Yield rate
/ %
吸水率
Absorpt ion of w ater
/ %
色素的吸附量
Adsorption of ponceau 4R
/(mg· g-1)
1 1 1 1 1 73.48 106.07 6.93
2 1 2 2 2 61.15 111.97 7.17
3 1 3 3 3 66.67 109.99 7.16
4 2 1 2 3 63.21 114.36 7.17
5 2 2 3 1 62.56 115.97 7.16
6 2 3 1 2 57.04 111.99 7.01
7 3 1 3 2 65.41 112.00 7.15
8 3 2 1 3 55.64 121.07 7.18
9 3 3 2 1 50.63 117.02 7.14
228 中国水稻科学(Chinese J Rice Sci)　第 20卷第 2期(2006年 3月)
表 3　复合酶水解正交试验Ⅱ因素及水平
Table 3 .Factors and levels of compound enzymes in perpendicular ex-
periment Ⅱ.
水平
Level
酶量 Enzyme(D)
酶比
Ratio
α-淀粉酶酶活
α-amylase
/(KN U· g-1)
糖化酶酶活
Glucoamylase
/(AGU· g-1)
温度
Temp.
(A)
/ ℃
pH
(B)
时间
Time
(C)
/ h
1 1∶2 9.33 40.00 50 4.0 16
2 1∶4 5.60 48.00 5.0 20
3 1∶6 4.00 51.43
4 1∶8 3.11 53.33
表 5　复合酶水解早籼米淀粉正交试验Ⅲ因素及水平
Table 5 .Factors and levels of compound enzymes in perpendicular ex-
periment Ⅲ.
水平
Level
酶量 Enzy me(D)
酶比
Ratio
α-淀粉酶酶活
α-amy lase
/(KNU· g-1)
糖化酶酶活
Glucoam ylase
/(AG U· g-1)
温度
Temp.
(A)
/ ℃
pH
(B)
时间
Time
(C)
/ h
1 1∶3 7.00 45.00 50 4.0 16
2 1∶4 5.60 48.00 55 5.0 20
3 1∶3 14.00 90.00
4 1∶4 11.20 96.00
表 4　复合酶水解正交试验Ⅱ数据
Table 4.Data of the perpendicular experiment Ⅱ.
序号
No.
因素 Factor
A B C D
多孔淀粉得率
Yield rate
/ %
吸水率
Water ab sorpt ion
/ %
色素的吸附量
Adsorption of ponceau 4R
/(mg· g-1)
1 1 1 1 1 48.47 126.91 8.38
2 1 2 2 1 38.54 118.22 8.40
3 1 1 1 2 45.56 123.48 8.31
4 1 2 2 2 44.16 133.66 8.41
5 1 2 2 3 49.87 123.60 8.47
6 1 1 1 3 46.26 121.79 8.36
7 1 2 2 4 51.67 122.63 8.37
8 1 1 1 4 48.27 130.49 8.42
表 6　复合酶水解早籼米淀粉正交试验Ⅲ数据
Table 6.Data of the perpendicular experiment Ⅲ.
序号
No.
因素 Factor
A B C D
多孔淀粉得率
Yield rate
/ %
吸水率
Water ab sorpt ion
/ %
色素的吸附量
Adsorption of ponceau 4R
/(mg· g-1)
1 1 1 1 1 55.40 133.48 8.53
2 2 2 2 1 46.98 140.53 8.42
3 2 1 1 2 60.21 137.02 8.43
4 1 2 2 2 49.69 132.55 8.44
5 1 2 2 3 49.49 134.05 8.53
6 2 1 1 3 39.27 145.93 8.38
7 2 2 2 4 51.89 140.82 8.36
8 1 1 1 4 46.08 128.00 8.52
2.3　复合酶正交试验Ⅲ
复合酶正交试验方案Ⅱ中α-淀粉酶与糖化酶之比为 1∶
4时 ,所得多孔淀粉吸水率最高;进一步考虑以α-淀粉酶和糖
化酶体积之比为 1∶3 、1∶4 ,温度为 55℃和 50℃条件下 ,制
备多孔淀粉 。因素及水平设置见表 5 ,结果见表 6。
经极差分析 ,多孔淀粉最佳得率条件是 A 1B1C1D2 ,即α-
淀粉酶与糖化酶体积之比为 1∶4 ,酶活分别为 5.60 KNU/g
和 48.00 AGU/g ,pH 4.0 ,时间 16 h ,温度 50℃;主次因素次
序为酶量 、时间 、pH 、温度 。最佳吸水率条件是 A2 B2C2D3 ,
即α-淀粉酶与糖化酶体积之比为 1∶3 ,酶活分别为 14.00
KNU/g 和 90.00 AGU/g , pH 5.0 ,时间 20 h ,温度 55℃;主
次因素次序为温度 、酶量 、时间 、pH 。吸附胭脂红色素的最佳
条件是 A1B2C2D1 ,即α-淀粉酶与糖化酶体积之比为 1∶3 ,酶
活分别为 7.00 KNU/g 和45.00 AGU/g , pH 5.0 ,时间 20 h ,
温度 50℃;其中以温度的影响最大 。在最佳吸水率条件下验
证 ,结果为:多孔淀粉得率 36.54%、吸水率 142.65%,其吸
水率低于正交试验中的数据 。
因此 ,选用吸水率作为响应值 , 在最佳吸水率条件
A 2B1C1D3(α-淀粉酶与糖化酶体积之比为 1∶3 ,酶活分别为
14.00 KNU/g 和 90.00 AGU/g , pH 4.0 , 时间 16 h ,温度
55℃)下进行试验验证两次 ,得到多孔淀粉的得率分别为
41.07%、43.37%,吸水率分别为 148.03%、155.61%,对胭
脂红的吸附量为 9.37 mg/g和 9.38 mg/g ;而原淀粉的吸水
率和对胭脂红的吸附量分别为 116.7%和 0.6 mg/g 。表明
复合酶制备的多孔淀粉吸水率和对胭脂红的吸附量有明显
增加 。
3　结论
α-淀粉酶和糖化酶按一定比例混合后作用于早籼米淀
粉 ,产品的吸水率和对胭脂红的吸附能力(吸水率最高为
229何国庆等:复合酶法制备早籼米多孔淀粉的工艺条件
155.61%,对胭脂红的吸附量最高为 9.38 mg/g)较原淀粉
(吸水率为 116.7%,对胭脂红的吸附量为 0.6 mg/g)有明显
增加 ,尤以对胭脂红的吸附量增加最明显 。
得率是制备多孔淀粉的重要控制指标 。适当降低制品
得率 ,利于多孔淀粉的形成 ,但得率太低 ,多孔淀粉颗粒不坚
固 、结构不稳定 ,比表面积也会变小 ,生产成本提高 。本研究
得出产品的吸水率最高(155.61%)时 ,得率为 43.37%。
针对多孔淀粉的得率 、吸水率和对胭脂红吸附量 3个指
标 ,所需的最佳工艺条件不一致 ,以吸水率最佳为标准 ,多孔
淀粉的最佳制备条件为温度 55℃,pH 4.0 ,时间 16 h ,α-淀粉
酶与糖化酶体积比 1∶3 , 酶活分别为 14.00 KNU/g 和
90.00 AGU/g 。在此条件下经两次验证 ,多孔淀粉的得率分
别为 41.07%和 43.37%, 吸水率分别为 148.03%和
155.61%,对胭脂红的吸附量分别为 9.37和 9.38 mg/g 。
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