全 文 ：世界科学技术—中医药现代化★中药基础研究
〔WorldScienceandTechnology/ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedica〕
结血蒿(Artemisiavestita)系菊科蒿属植物,具
有清热、消炎、祛风、利湿之功效,是一种传统的藏
药,广泛应用于多种炎症相关疾病的治疗[1],但是至
今对它的药理作用及机制仍知之甚少。我们的前期
研究发现结血蒿水提物对 2,4,6-三硝基氯苯诱导
的小鼠接触性皮炎有明显的抑制作用,并阐明了其
体内的作用机理[2]。在本研究中,我们利用 ConA
刺激小鼠脾细胞的体外模型,观察了结血蒿醇提物
对脾细胞增殖和活化的影响。
一、材料与方法
1.材料
(1)动物。
雌性 BALB/c小鼠(SPF),体重 18~22g,由上海
实验动物中心提供。
(2)试剂。
RPMI1640细胞培养基 (美国 GIBCO,BRL),
四甲基偶氮唑盐(MTT,Sigma公司美国),二甲亚砜
(DMSO,天津市化学试剂厂),刀豆蛋白 A(Con-
canavalinA,ConA,Sigma公司),抗小鼠 CD69单抗
(antiCD69,eBioscience公 司 , 美 国 ),24、96孔 板
(Costar,美国),羧乙基锗倍半氧化物 (5,6-car-
boxyfluorescein diacetate succinimidylester,CFSE,
Sigma公司)。
(3)药品制备。
结血蒿购自西藏大学制药厂,经西藏大学次仁
顿珠教授鉴定为菊科(Compositae)蒿属(Artemisia)
结血蒿醇提物对小鼠脾细胞
增殖和活化的抑制作用*
□李轶华 孙 洋 郭宗辉 陈 婷 徐 强**
(南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室 南京 210093)
摘 要:目的:观察藏药结血蒿 75%乙醇提取物对体外丝裂原刀豆蛋白 A(ConcanavalinA,Con
A)刺激的小鼠脾细胞活化和增殖的抑制作用。方法:用 ConA刺激小鼠脾细胞,分别用四甲基偶
氮唑盐染色法(MTT法),流式细胞术等方法观察结血蒿醇提物对细胞增殖和活化的作用。结果:结
血蒿醇提物对体外 ConA刺激的小鼠脾细胞的增殖和活化均有显著的抑制,作用呈剂量依赖性。结
论:结血蒿醇提物可抑制 ConA刺激的小鼠脾细胞的增殖和活化,提示其具有免疫抑制活性。
关键词:结血蒿 小鼠脾细胞 增殖 活化
收稿日期:2005-08-01
修回日期:2005-08-30
* 江苏省自然科学基金重点项目(BK2003206):中药选择性免疫抑制作用的机理研究,负责人:陈婷;江苏高校高新技术产业发展面上项目
(JH03-054),负责人:徐强。
** 联系人:徐强,教授,博士生导师,本刊编委,研究方向:主要从事中药免疫药理学研究,Tel(Fax):025-83597620,E-mail:molpharm@163.com。
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植物结血蒿(ArtemisiavestitaWal)的根茎。结血蒿
醇提物(AV-ext)的提取方法如下:称取 100g药材,
用 15倍量 75%乙醇浸泡 3h,加热回流 3h,再加入
10倍量的 75%乙醇加热回流 3h后过滤,两次滤液
合并,浓缩干燥得提取物粉末,得率为 10%。储备液
溶于 DMSO,使用时用 RPMI1640培养基稀释。
2.方法
(1)脾细胞的制备。
取标准体重的小鼠,放血处死,无菌取出脾脏放
入冰浴玻璃平皿(直径 5cm)中,平皿中盛有约 3ml
无菌的 RPMI1640培养基,轻轻将脾细胞挤出,再
加入 7ml培养基,用移液管反复吹打分散至单细胞
悬液。400目过滤,收集细胞悬液,1000rpm离心
5min(4℃)。弃上清后脾细胞加入 10ml的 Tris-
NH4Cl,静置 2~3min,1000rpm离心 5min(4℃),去
除红细胞。弃上清液后,再用 RPMI1640洗涤两次,
待用[3]。
(2)MTT法测脾细胞增殖。
将细胞加入 96孔板,每孔 5×105个,同时加入
不同浓度的药物及 ConA(5μg/ml),37℃、5% CO2
培养 72h。培养毕,向 96孔板培养的各孔细胞中分
别加入 5mg/ml的 MTT溶液 20μl,继续培养 4h,
1000rpm离心 10min,弃上清液。加入 200μl的 DM-
SO,待沉淀溶解完全后,用酶标仪测定 OD540[4]。
(3)CFSE法测脾细胞分裂增殖。
取脾细胞后,用温热的培养基悬浮细胞,加入
CFSE(5μg/ml),放入培养箱染色 15min,用血清终
止,用 RPMI1640培养基洗 2遍后,加药培养 3d后
用流式细胞仪检验[5]。
(4)流式细胞仪分析对细胞活化表面分子 CD69
表达的影响。
取脾细胞,悬浮加入 anti-CD69抗体避光孵育
45min,用 PBS溶液洗两遍后用 400μl含 0.5%多
聚甲醛的 PBS溶液悬浮,用流式细胞仪检验[6]。
3.统计学处理
实验结果用 mean±SD表示。对于多组之间的比
较,先用单因素方差分析(ANOVA),如果有显著性
差异(P<0.01),再用 Dunnetstest检测组间差异。
二、结 果
1.结血蒿醇提物对脾细胞增殖的抑制作用
脾细胞在加入 ConA的同时,加入不同浓度的
结血蒿醇提物培养 3d。用 MTT染色后在核酸分析仪
上测量 540nm处的吸收光度。结果如图 1所示,结
血蒿醇提物对 ConA刺激小鼠脾细胞的增殖有明
显的抑制作用,并呈浓度依赖性,其半数抑制浓度
(IC50)为 2μg/ml。
2.CFSE染色观察结血蒿醇提物对细胞分裂增
殖的抑制作用
当细胞受到 ConA刺激时,可以分裂增殖,则
CFSE染料的荧光强度随着分裂而降低,流式细胞术
分析时,峰向左偏移。实验结果如图 2所示:Marker
标记的左侧峰代表分裂增殖后的细胞。ConA活化
后的细胞增殖增加,峰向左偏移;药物处理后的细胞
经分析峰明显向右偏移,证明药物有抑制细胞增殖
的作用。
3.结血蒿醇提物对细胞活化表面分子 CD69
表达的影响
图1 结血蒿醇提物对脾细胞增殖的抑制作用
细胞培养3d后用MTT染色后在酶标仪上测量 540nm处的
吸收光度(药物浓度如图),药物的抑制率呈剂量依赖性。
注:**P<0.01 vs.Cont(Dunnets test).
AV-ext(!g/ml)
O
D
=
54
0
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图3 结血蒿醇提物对细胞活化
表面分子CD69的影响
如图所示,右侧Marker标记的部分为CD69阳性细胞。Con
A活化后的细胞表面表达 CD69增加,峰向右偏;药物处理后,峰
向左偏移,说明药物有抑制 CD69表达功能,其作用呈剂量依赖
性。
图2 CFSE染色观察结血蒿醇提物
对细胞分裂增殖的抑制作用
细胞收集后用流式细胞仪分析。如图所示:Marker标记的左
侧峰代表分裂增殖后的细胞。Con A活化后的细胞增殖增加,
峰向左偏移;药物处理后的细胞经分析峰明显向右偏移,证明药
物有抑制细胞增殖的作用。
E
ve
nt
s
E
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E
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E
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E
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s
CFSE CD69
Normal
ConA
ConA+1!g/mlAV-ext
E
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64
E
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64
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64
E
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64
E
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nt
s
64
ConA+5!g/mlAV-ext
ConA+10!g/mlAV-ext
Normal
ConA
ConA+1!g/mlAV-ext
ConA+5!g/mlAV-ext
ConA+10!g/mlAV-ext
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右侧 Marker标记的部分为 CD69阳性细胞。
Con A活 化 后 的 细 胞 表 面 表 达 CD69增 加 至
62.26%,峰向右偏移;药物处理后,峰向左偏移,1、5
及 10μg/ml的结血蒿提取物使 CD69阳性细胞数分
别下降至 61.53%,52.81%和 34.29%,说明药物有抑
制 CD69表达的功能,其作用呈剂量依赖性。
三、讨 论
本研究主要探讨了结血蒿醇提物在体外抑制细
胞增殖活化的作用。我们采用丝裂原致淋巴细胞转
化对药物的作用进行了考察,从图 1可知,对 ConA
刺激的小鼠脾细胞增殖试验中,结血蒿醇提物显示
了浓度依赖性的抑制作用,这个结果在 CFSE染色
法测增殖的试验中也得到了证实(见图 2)。为了进
一步考察药物的作用机制,我们考察了药物对 T细
胞活化的表面分子 CD69表达的影响作用,结果发
现,结血蒿醇提物能剂量依赖性地抑制 CD69分子
的表达,提示其能够减少 ConA刺激的脾细胞的活
化(见图 3)。
综上所述,结血蒿醇提物能显著的抑制 ConA
所致的脾淋巴细胞增殖,其机理与抑制 CD69分子
的表达有关,从而抑制 T淋巴细胞的活化。
参考文献
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sionandmetaloproteinaseproductionofTlymphocytes.Internation-
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7 FelermannK,LuhmannD,StangeEF.Istherestilarolefor
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InflammBowelDis,2003,9:198.
(责任编辑:左 向)
(上接第32页)
故不能轻易断言蔓荆子炒炭没有药理作用或药理作
用下降,只能说炒炭品的挥发油作用下降或损失,相
反总黄酮表现的药理作用有可能会增强。
3.损失折算后的总黄酮变化
以上结果为实际取样测定总黄酮含量结果。不
同程度炒制品其损失率不同,生品为 0、微炒为
10%、炒焦为 20%、炒炭为 30%、炒过炭为 80%,若
按损失率计算后,则总黄酮含量随炒制程度加重上
升变化不明显。但由于中医临床用药过程中,不考虑
炒制过程中的损失率,而以不同饮片规格药用,故蔓
荆子总黄酮相对含量与临床疗效的关系仍需进一步
探讨。
参考文献
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化学工业出版社,2000.533.
2 中国药典委员会编.中国药典 2000年版一部,益心酮片.北京:化
学工业出版社,2000.563.
3 中国药典委员会编.中国药典 2000年版一部,消咳喘糖浆.北京:
化学工业出版社,2000.567.
4 中国药典委员会编.中国药典 2000年版一部,排石颗粒.北京:化
学工业出版社,2000.578.
5 郭长强,宋慧.蔓荆子及其炮制品的总黄酮初步分析.中成药.
1995,17(1):20.
(责任编辑:周立东)
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forwardinCompendiumofMaterialMedicabyLiShizheninMingdynasty.Itisdefinedthatwhentwokindsofdrugs
areusedtogether,onedrugcandamageorreducetheefectsoftheother.Nowdadys,manyexpertshaveoriginalviews
aboutmutualinhibition.Theydeem thatmutualinhibitionhasrelativeincompatibility,andasarelative
incompatibility,Mutualinhibitionhassomespecificcharacteristics.
KeyWords:mutualinhibition,compatibility,sevenemotions
InhibitionofProliferationandActivationofSpleencelsofMicebyEthanolExtractfromArtemisiaVestita
LiYihua,SunYang,GuoZonghui,ChenTingandXuQiang
(StateKeyLaboratoryofPharmaceuticalBiotechnology,SchoolofLifeSciences,NanjingUniversity,Nanjing210093)
ObjectiveToexaminetheinhibitoryefectof75% ethanolextractfromaerialpartsofArtemisiavestita,a
traditionalTibetanmedicine,ontheproliferationandactivationofmousespleencelsactivatedwithconcanavalinA
(ConA).MethodToactivatespleencelsofmicewithConAinvitroandthenobservetheefectoftheethanolextract
ontheproliferationandactivationofthecelsbythemethodofMTT,CFSEandflowcytometricanalysis.ResultsThe
ethanolextractfromArtemisiavestitacanremarkablyinhibittheproliferationandactivationofspleencelsactivated
byConinvitroanditsefectdependsondosages.ConclusionTheethanolextractfromArtemisiavestitaisableto
exertinhibitoryefectontheproliferationandactivationofspleencelsactivatedbyConA,implyingthatthis
traditionalTibetanmedicinehasanimmunosuppressiveactivity。
KeyWords:Artemisiavestita,spleencelsofmouse,proliferationactivation
DiterminationofTotalFlavoneContentinDiferentKindsof
ParchedMedicinalMaterialsofVitexTrifoliaL.
GuoChangqiangandChengLifang
(AcademyofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedicaofShandongProvince,Jinan250014)
ZhaoZhenghong
(TraineefromShandongUniversityofTraditionalChinesemedicineandMateriaMedica,Jinan250014)
Objective TodeterminethetotalflavonecontentindiferentkindsofparchedmedicinalmaterialsofVitex
trifoliaL.MethodToapplyultravioletspectrophotometryandtakerutinforcontrolsampletotesttheabsorptionrate
offlavoneofvarioussamplesofvitextrifoliaL.at510nmsoastodeterminetheirrespectivetotalflavonecontent.
ResultThetotalflavonecontentsoftherawmaterial,slightlyparchedmaterial,scorchedlyparchedmaterial,
charedlyparchedmaterialandover-charedlyparchedmaterialofVitextrifoliaL.are5.65%,5.81%,7.88%,9.36%
and0.31%respectively.ConclusionWiththeincreasingdegreeofparchingthetotalflavonecontentofVitextrifolia
L.goesupfirstanddecreaseslaterandevennearlylosealitsflavonebecauseofbeingoverparched.
KeyWords:VitextrifoliaL.,parchedmedicinalmaterial,ultravioletspectrophotometry,totalflavone,
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