全 文 ：亮菌多糖的苯酚-硫酸比色法含量测定
宋群亮1 ,张　平 1, 2 ,孙旭群 2 ,李绍平2 ,黄赵刚 2 ,夏　泉 2
(1. 安徽医科大学药学院 ,合肥　230032;2.安徽医科大学第一附属医院药剂科 , 合肥　230022)
摘要:目的 建立亮菌多糖的含量测定方法。方法 采用苯酚-硫酸比色法。结果 测定波长为 490 nm ,线性范围在 3. 1 ～ 15.
6 m g L -1 ,平均回收率为 99. 78%, RSD =0. 99%。亮菌多糖的含量为 68. 72%, RSD为 1. 28%。结论 该方法操作简便 、快速
准确 、重现性好 ,可用于亮菌多糖含量的测定。
关键词:亮菌;多糖;苯酚-硫酸比色法;含量测定
Determ ination of polysaccharide in Arm illariella
tabescens by phenol-sulfuric acid colormi etry
SONG Q un-liang1 , ZHANG Ping1, 2 , SUN Xu-qun2 , LI Shao-ping2 , HUANG Zhao-gang2 , X IA Quan2
(1. Departmen t of Pharmacy, AnhuiMed icalUn iversity, 2. TheF irst Affiliated Hospita l of Anhu iM ed ical University,H efei　230032)
Abstrac t:A im To estab lish a sim ple and accurate m ethod fo r the de term ination of po ly saccharide in A rm illariella tabe scens.
M ethod Pheno l-su lfur ic ac id co lo rim etric analysis is em ployed. R esu lt　The detected w ave leng th w as 490 nm. L inear range w as 3. 1 ～
15. 6 mg L - 1. The average recovery rate w as 99. 78% and RSD w as 0. 99%. The po ly saccharide con tent o f A rm illarie lla tabescens in
to ta l polysaccha ridew as 68. 72% and RSD w as 1. 28%. Conclu sion Them ethod is convenien t, rapid, accu ra te and reproducible. It can
be used fo r qua lity contro l o f po ly saccharide of A rm illariella tabescens.
K ey words:A rm illarie lla tabe scens;po ly saccharide;pheno l-su lfuric acid co lorim e try;de term ination
　　亮菌 [ Arm illariella tabescens(Scop. ex. fr)S ing]是一种能发
光的担子菌 , 其性味甘凉 ,具有清热利湿 、疏肝解郁之功效 , 对
基金项目:安徽省教育厅自然科学基金项目(No 2002k j138)
通讯作者:张　平 ,主任药师 ,硕士生导师 ,研究方向:中药新药的研究
开发。 Tel:0551-2922422。 Emai l:zhangp ing_ ay@ sohu. com
肝炎有明显的防治作用 , 在我国民间流传用作治疗急慢性肝
炎及胆道疾患。亮菌多糖是亮菌中主要有效成分 , 现代药理
研究表明亮菌多糖具有保肝 [ 1, 2] 、防辐射 [ 3] 、增强免疫 [ 4]和抗
肿瘤 [ 5]等药理作用 ,有非常广阔的开发前景。本文采用传统
经典的苯酚-硫酸比色法 [ 6, 7]测定亮菌多糖含量 , 为亮菌多糖
2. 8　稳定性试验　取同一供试品溶液 ,分别于 0、2、4、6、8 h,
按上述色谱条件测定峰面积 , 结果表明供试品溶液在 8 h内
稳定 , RSD为 2. 07%。
2. 9　加样回收率试验　称取已知含量的样品 6份 ,分别精密
加入一定量的没食子酸对照品 ,依法制备供试品溶液 , 按上述
色谱条件进行含量测定 , 计算回收率 , 结果见表 1,得平均回
收率为 98. 27%, RSD为 0. 95%。
表 1　加样回收率试验结果
编号 样品含量 /mg 加入量 /mg 测得量 /m g 回收率 /%
1 0. 273 0. 260 0. 527 97. 69
2 0. 277 0. 260 0. 534 98. 85
3 0. 279 0. 260 0. 531 96. 92
4 0. 284 0. 260 0. 540 98. 46
5 0. 280 0. 260 0. 539 99. 62
6 0. 291 0. 260 0. 546 98. 08
2. 10　样品测定　精密称取 3批宫炎平浓缩丸样品 , 分别按
供试品溶液的制备方法操作 ,按上述色谱条件分析测定 , 计算
出每批样品中没食子酸的含量 ,结果见表 2。
表 2　宫炎平浓缩丸中没食子酸的含量(n=3)
批号 没食子酸 /m g g- 1 RSD /%
20050904 0. 216 0. 68
20050905 0. 267 1. 24
20050906 0. 225 0. 87
3　讨论
　　供试品溶液制备的试验研究中 , 为考察提取溶媒对样品
含量测定的影响 , 对以甲醇 、甲醇-水 、流动相溶液为提取溶媒
进行比较 , 结果以甲醇-水(50∶50)溶液为溶媒提取时 ,没食子
酸提取最完全且溶剂峰最小 , 测得的含量最高。以 50%甲醇
为溶媒 , 分别将供试品溶液超声 15、 30、60 m in进行比较 [ 3] ,
结果超声 30 m in后没食子酸的含量无明显增加 , 超声 30 m in
即可。在流动相的选择中 , 比较了四氢呋喃-甲醇-0. 2%磷酸
(0. 5∶0. 5∶99)[ 4] 、 0. 2%甲醇的乙腈溶液-含 0. 1%磷酸 、 0.
1%三乙胺的水溶液(3∶97)[ 5]等 , 结果以乙腈-含 0. 1%磷酸 、
0. 1%三乙胺的水溶液(2∶98)为流动相分离效果较好。
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(收稿日期:2007 - 02 - 26)
512 安 徽 医 药　AnhuiMed ical and Pharmaceutical Journa l　2007 Jun;11(6)
质量控制提供了可靠的实验方法和理论依据 , 对亮菌多糖的
进一步开发利用奠定基础。
1　仪器与试药
1. 1　仪器　TU-1800SPC紫外分光光度计 (北京普析通用仪
器有限责任公司);AB135-S百万分之一电子天平(METTLER
TOLEDO公司)。
1. 2　试药　D-无水葡萄糖对照品 (中国药品生物制品检定
所 , 批号:0833-9501);亮菌菌丝粉(由安徽杰明生物制剂有限
公司提供并经安徽医科大学李绍平博士鉴定 );苯酚(AR);
硫酸(98%, AR);活性炭 (药用);亮菌多糖(自制);其他试剂
均为分析纯。
2　实验方法与结果
2. 1　亮菌多糖的提取与纯化　取亮菌菌丝粉适量 ,以 20倍量
的水浸泡 1 h, 加热至微沸 ,维持 h,放冷, 3 000 r m in- 1离心
20 m in,残渣再加相同倍量的水重复提取 2次 ,合并上清液。上
清液减压浓缩至溶液浓度为 1 /6 g生药 /m l, 浓缩液加入 95%
乙醇使含醇量达 80%,静置 6 h, 抽滤 , 得亮菌多糖粗品。 Sevag
法脱蛋白后真空干燥 ,干燥物经无水乙醇反复冲洗 , 再将干燥
物溶于适量蒸馏水 ,加入 0. 3%的活性炭脱色 120 m in, 抽滤 ,将
脱色后的多糖液浓缩蒸干, 真空干燥 ,粉碎 ,备用。
2. 2　含量测定
2. 2. 1　对照品溶液的制备　精密称取 105℃干燥至恒重的无
水葡萄糖对照品 25 mg, 置 100 m l容量瓶中 , 加适量蒸馏水溶
解 ,稀释至刻度 ,摇匀, 即得浓度为 0. 25 g L - 1的对照品溶液。
2. 2. 2　供试品溶液的制备　精密称取亮菌多糖样品 20 mg,
置 50 m l容量瓶中 ,加适量蒸馏水溶解 , 稀释至刻度 , 摇匀 , 即
得。
2. 2. 3　测定波长的选择　取一定量的对照品和供试品溶液
经苯酚-硫酸显色后 , 随行作空白对照 ,在 400 ～ 700 nm波长
范围进行扫描 , 结果表明葡萄糖对照品与亮菌多糖的最大吸
收波长均在 490 nm处(图 1), 故选 490 nm作为测定波长。
图 1 光谱吸收曲线　　 1-葡萄糖对照品 2-亮菌多糖
2. 2. 4　标准曲线的制备　分别精密吸取对照品溶液 0. 1、 0.
2、0. 3、0. 4、0. 5 m l, 置 10 m l具塞试管中 , 加水至 2. 0 m l, 各精
密加入 6%苯酚溶液 1 m l及浓硫酸 5 m l, 放置 10 m in, 摇匀 ,
再在室温下放置 20 m in, 以相应的试剂为空白对照。置 TU-
1800SPC紫外分光光度计中 ,于 490nm处测定吸光度 , 以吸光
度(A)为纵坐标 , 浓度(C)为横坐标 ,绘制标准曲线 , 得回归
方程:A = - 0. 0228 +0. 0465C(r=0. 9998), 实验表明葡萄
糖浓度在 3. 1 ～ 15. 6 m g L- 1范围内线性关系良好。
2. 2. 5　稳定性实验　取葡萄糖对照品溶液 0. 3 m l, 按 2. 2. 4
项下方法显色 , 每隔 20 m in测定吸光度 , 连续 2 h, 结果发现
吸光度无明显变化。
2. 2. 6　重复性实验　精密吸取 0. 3 m l供试品溶液 6份置于
10 m l具塞试管中 ,按 2. 2. 4项下方法测定吸光度 , 结果 RSD
=0. 85%(n =6), 表明本法重复性好。
2. 2. 7　加样回收率实验　精密称取已知含量的样品 5份 , 分
别加入葡萄糖对照品适量 , 加水溶解并定容至 50m l容量瓶
中 , 取溶液适量 ,按 2. 2. 4项下的方法进行测定 , 并计算加样
回收率 , 结果见表 1, 计算出平均回收率为 99. 78%, RSD=0.
99%,表明本法准确性较好 。
表 1　回收率实验
样品号 样品量
mg
加入对照
品量 mg
测得量
m g
回收率
%
平均回收
率%
RSD
%
1 5. 32 4. 80 10. 09 99. 38
2 5. 61 4. 12 9. 68 98. 79
3 5. 62 4. 35 10. 01 100. 92 99. 78 0. 99
4 5. 85 5. 23 11. 12 100. 76
5 4. 81 4. 26 9. 03 99. 06
2. 2. 8　样品的测定　精密吸取供试品溶液 0. 3 m l, 置 10 m l
具塞试管中 , 按 2. 2. 4项下方法测定吸光度 , 从标准曲线上读
出供试液中多糖的重量(以葡萄糖计)(m g), 按下式计算样品
中亮菌多糖含量 , 多糖含量(%)=多糖重量 /亮菌多糖样品
重量 ×100%, 结果亮菌多糖平均含量为 68. 72%, RSD=1.
28%(n =5)。
3　讨论
　　本文采用苯酚-硫酸比色法测定亮菌多糖的含量 ,多糖在
浓硫酸作用下 , 先水解成单糖 , 并迅速脱水生成糖醛衍生物 ,
与苯酚反应生成橙黄色溶液 , 己糖在 490 nm 处(戊糖及糖醛
酸在 480 nm)有最大吸收 [ 6] ,亮菌多糖和葡萄糖溶液经 400 ～
700 nm扫描表明在 490 nm 处有最大吸收 , 因此选定 490 nm
为测定波长。苯酚易氧化 , 因此所用试剂需现配现用 ,并注意
避光保存。
　　本实验测定亮菌多糖的含量 , 操作简便且显色稳定 , 重现
性好 , 在 3. 1 ～ 15. 6 m g L -1范围内线性关系良好 , 加样回收
率满意 , 是检测亮菌多糖含量的一种简单可靠的方法 , 为亮菌
多糖制剂的质量控制提供参考。
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