全 文 ：188
纤维素酶提取冬枣叶中
总黄酮工艺的研究
张圣燕，张 成
(滨州学院化学与化工系，山东滨州 256603)
摘 要:采用纤维素酶提取冬枣叶中的总黄酮。以芦丁为标准品，采用分光光度法测定冬枣叶中总黄酮的含量，通过
单因素实验研究提取温度、提取时间、酶用量和料液比对提取率的影响，再利用正交实验优化最佳提取工艺条件。结
果表明，纤维素酶提取冬枣叶中总黄酮的最佳工艺条件为:料液比 1∶50(g /mL) ，提取温度 55℃，提取时间 90min，酶用
量 4mg /g。在最佳提取工艺条件下，提取率可达 2.45%。同时得到各影响因素对总黄酮提取率的显著性影响顺序为:
提取温度 ＞提取时间 ＞酶用量 ＞料液比。
关键词:纤维素酶，冬枣叶，总黄酮
Study on extraction technology of total flavones
using cellulase from leaves of winter－ jujube
ZHANG Sheng－yan，ZHANG Cheng
(Department of Chemistry and Chemical Engineering of Binzhou University，Binzhou 256603，China)
Abstract:Total flavones in leaves of winter－ jujube were extracted using cellulose.The total flavones extraction rate
was determined by spectrophotometry method with rutin as reference substance. In the single factor analysis，the
effect of extraction temperature，extraction time，enzyme amount and solid － liquid ratio were measured. The
orthogonal test was used to optimize the conditions of extraction.The results showed that the best conditions of
extraction total flavones from leaves of winter － jujube were the solid － liquid ratio 1 ∶ 50 (g /mL) ，extraction
temperature 55℃，extraction time 90min，enzyme amount 4mg /g.Under this optimal condition，extraction rate was
2.45% .The results showed that the order of extraction rate of total flavones was as follows:extraction temperature ＞
extraction time ＞ enzyme amount ＞ solid－ liquid ratio.
Key words:cellulase;leaves of winter－ jujube;total flavones
中图分类号:TS210.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2013)01－0188－03
收稿日期:2012－07－23
作者简介:张圣燕(1982－) ，女，硕士，讲师，研究方向:天然产物提取。
基金项目:滨州学院青年人才创新基金(BZXYQNLG200803)。
冬枣为鼠李科枣属植物，具有很好的医用价值，
成熟枣果中的营养成分已被研究，并被提取出
来［1－2］。而冬枣叶却被大量废弃，研究表明，枣叶中
含有甜味抑制剂、黄酮类化合物和生物碱等有效成
分［3］。其中黄酮类化合物具有防癌抗癌、抗肿瘤、抗
心脑血管疾病、抗骨质疏松、清除自由基和抗氧化等
生理活性［4］，在医药、食品领域有着重要的应用。冬
枣叶中总黄酮的提取可为冬枣叶的开发利用提供新
的方向。目前，总黄酮的提取方法主要有溶剂浸提
法［5］、微波提取法［6］、超声波提取法［7］、超临界 CO2 萃
取法［8］和酶提取法［9］等，而对冬枣叶中总黄酮提取工
艺的研究还较少。本文利用纤维素酶酶解细胞壁，
采用纤维素酶提取冬枣中的总黄酮，研究提取条件
对总黄酮提取率的影响，优化提取工艺，为冬枣叶的
综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
冬枣叶 采摘自滨州沾化冬枣园;纤维素酶
(30units /mg) 日本;芦丁标准品(纯度≥98%)
购于北京世纪奥科生物科技有限公司;无水乙
醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、石油醚 均为分
析纯。
Agilent8451 型紫外分光光度计 美国 Agilent;
B－220型恒温水浴锅 北京泰克仪器有限公司;T203
型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 冬枣叶中总黄酮的提取工艺 冬枣叶洗净，
烘干(50℃)至恒重，粉碎，过 40 目筛，石油醚
(60～90℃)浸泡 30min后，超声脱脂 20min，过滤。重
复 1 次。残渣挥干溶剂后，密封备用。
准确称取预处理好的冬枣叶粉末 1.0g，加入
70%的乙醇溶液和纤维素酶，进行酶提取，提取后过
滤，得总黄酮的粗提取液。
1.2.2 标准曲线的绘制 准确称取芦丁标准品
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.01.025
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10.92mg，溶解后，转移至 50mL 容量瓶中，70%的乙
醇定容，制成浓度为 0.2184mg /mL的芦丁标液。
准确量取芦丁标液 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL
于 6 支 10mL容量瓶中，分别加入 5%的亚硝酸钠溶
液 0.3mL，摇匀，放置 6min，然后加入 10%的硝酸铝
溶液 0.3mL，摇匀，放置 6min，再加入 4%的氢氧化钠
溶液 4.0mL，70% 的乙醇定容，摇匀，静置 15min［5］。
以试剂空白为参比，在 510nm处测吸光度，做芦丁浓
度－吸光度标准曲线，得回归方程为:A = 13.02913 ×
C +0.033，其线性相关系数为 R2 = 0.9994。
1.2.3 总黄酮含量的测定 将总黄酮的粗提取液转
移到 100mL容量瓶中，70%的乙醇定容，摇匀后，待
用。准确吸取 3.0mL定容液于 10mL容量瓶中，加入
显色剂(5%亚硝酸钠溶液 0.3mL，10%硝酸铝溶液
0.3mL，4%氢氧化钠溶液 4.0mL)后，定容，摇匀，静置
15min，以试剂空白为参比，在 510nm 波长下，测定吸
光度，根据标准曲线方程计算浓度，得出提取率。
总黄酮的提取率(%)
= C ×定容溶液体积 ×稀释倍数
原材料质量
× 100
式中:C－总黄酮浓度，mg /mL。
1.2.4 单因素实验
1.2.4.1 提取温度对总黄酮提取率的影响 料液比
为 1 ∶40(g /mL) ，酶用量为 3mg /g，提取温度分别为
35、45、55、65、75℃，提取时间为 90min 的条件下，提
取冬枣叶中的总黄酮，测定并计算提取率。
1.2.4.2 提取时间对总黄酮提取率的影响 料液比
为 1∶40(g /mL) ，酶用量为 3mg /g，提取温度为 55℃，
提取时间分别为 30、60、90、120、150min的条件下，提
取冬枣中的总黄酮，测定并计算提取率。
1.2.4.3 酶用量对总黄酮提取率的影响 料液比为
1∶40(g /mL) ，酶用量分别为 1、2、3、4、5mg /g，提取温
度为 55℃，提取时间为 90min的条件下，提取冬枣中
的总黄酮，测定并计算提取率。
1.2.4.4 料液比对总黄酮提取率的影响 料液比
(g /mL)为 1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50、1 ∶ 60，酶用量为
4mg /g，提取温度为 55℃，提取时间为 90min 的条件
下，提取冬枣中的总黄酮，测定并计算提取率。
1.2.5 正交实验 在上述单因素实验的基础上，以
提取温度、提取时间、酶用量、料液比为因素设计正
交实验，以确定冬枣叶中总黄酮的最佳提取工艺条
件，因素水平见表 1。
表 1 L9(3
4)正交因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平
因素
A提取时间
(min)
B提取温度
(℃)
C酶用量
(mg /g)
D料液比
(g /mL)
1 60 45 3 1∶30
2 90 55 4 1∶40
3 120 65 5 1∶50
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 提取温度对总黄酮提取率的影响 由图 1 可
以看出，总黄酮的提取率最初随着提取温度的升高
而增加，当提取温度达到 55℃左右时，总黄酮的提取
率达到最高，继续升高温度，总黄酮的提取率开始降
低。这是因为，温度较低时，纤维素酶的活性较低，
提取效果较差，随温度的升高，酶的活性逐渐增强，
提取率增加，但当温度超过 55℃后，纤维素酶开始变
性失活，导致总黄酮的提取率开始降低。
图 1 提取温度对总黄酮提取率的影响曲线
Fig.1 Influence of extraction temperature
on total flavones extraction rate
2.1.2 提取时间对总黄酮提取率的影响 由图 2 可
见，随着提取时间的增长，总黄酮的提取率逐渐增
加，当提取时间达到 90min 后，总黄酮的提取率增加
不明显。这说明在 90min 时，提取效果已基本达到
最佳，再延长提取时间对黄酮的提取率无显著影响。
图 2 提取时间对总黄酮提取率的影响曲线
Fig.2 Influence of extraction time
on total flavones extraction rate
2.1.3 酶用量对总黄酮提取率的影响 由图 3 可见，
总黄酮的提取率随着酶用量的增加而增加，当纤维
素酶用量达到 4mg /g 左右时，总黄酮提取率增加变
缓慢。这表明，当酶用量达到 4mg /g 时，冬枣叶黄酮
的提取效果已趋于最佳，再增加酶用量，对黄酮的提
取率影响不大，且造成材料浪费。
图 3 酶用量对总黄酮提取率的影响曲线
Fig.3 Influence of enzyme amount
on total flavones extraction rate
2.1.4 料液比对总黄酮提取率的影响 由图 4 可见，
190
总黄酮提取率随着料液比中溶剂量的增加先增加后
降低，当料液比为 1∶40 时，提取率达到最大。这是因
为，溶剂量的增大，使得总黄酮的溶出量增加，引起
提取率增加;但溶剂量的增加也引起一些醇溶性杂
质、亲脂性强的成分溶出量增多，这些成分与黄酮类
物质竞争乙醇－水分子，可导致黄酮的溶出量减少，
从而降低总黄酮的提取率［10］。
图 4 料液比对总黄酮提取率的影响曲线
Fig.4 Influence of solid－liquid ratio
on total flavones extraction rate
2.2 正交实验
由表 2 结果可知，各因素对总黄酮提取率的影
响程度依次为:B ＞ A ＞ C ＞ D，即:提取温度 ＞提取时
间 ＞酶用量 ＞料液比。最佳提取条件为 A2B2C2D3，
即:提取时间为 90min，提取温度为 55℃，酶用量为
4mg /g，料液比为 1∶50(g /mL)。
表 2 L9(3
4)正交实验结果表
Table 2 Results of orthogonal test
实验号 A B C D 提取率(%)
1 60 45 3 30 2.2217
2 60 55 4 40 2.2872
3 60 65 5 50 2.1837
4 90 45 4 50 2.2894
5 90 55 5 30 2.3040
6 90 65 3 40 2.2204
7 120 45 5 40 2.2360
8 120 55 3 50 2.2834
9 120 65 4 30 2.1985
K1 6.6926 6.7471 6.7255 6.7242
K2 6.8138 6.8746 6.7751 6.7436
K3 6.7179 6.6026 6.7237 6.7565
k1 2.2309 2.2490 2.2418 2.2414
k2 2.2712 2.2915 2.2584 2.2478
k3 2.2393 2.2009 2.2412 2.2521
R 0.0403 0.0906 0.0171 0.0107
2.3 验证实验
选用最佳提取条件组:提取时间 90min，提取温
度 55℃，纤维素酶用量 4mg /g，料液比 1 ∶50(g /mL)
重复实验 3 次，进行验证，实验数据见表 3，3 次实验
的平均提取率为 2.45%。
表 3 正交实验优化条件下总黄酮提取率
Table 3 Total flavones extraction rate under
optimal condition with orthogonal test
实验号 1 2 3 平均值
提取率(%) 2.45 2.46 2.45 2.45
由表 3 可知，A2B2C2D3 条件下冬枣叶中总黄酮
的提取率高于表 2 中的最高提取率(2.3040%) ，故
A2B2C2D3 为最优化实验条件。
2.4 对比实验
在最佳工艺条件下，分别采用乙醇浸提法(提取
温度 80℃，提取时间 4h，料液比 1∶20(g /mL) )和酶解
法(提取温度 55℃，提取时间 90min，料液比 1 ∶ 50
(g /mL) ，酶用量 4mg /g)提取冬枣叶中的总黄酮，测
定含量，比较提取率。
表 4 提取工艺对总黄酮提取率的影响
Table 4 Influence of extraction technologies
on total flavones extraction rate
提取方法 乙醇浸提法 酶解法
提取率(%) 1.32 2.45
由表 4 可见，在最佳条件下，酶解法的提取率为
2.45%，乙醇浸提法的提取率为 1.32%。可见，相对
于乙醇浸提法而言，酶解法可降低提取温度，缩短提
取时间，提高冬枣叶中总黄酮的提取率。
3 结论
本文采用纤维素酶提取冬枣叶中的总黄酮，在
单因素实验的基础上，进行了多因素正交实验，确定
了纤维素酶提取冬枣叶中总黄酮的最佳工艺条件，
即:料液比 1 ∶50(g /mL) ，提取温度 55℃，提取时间
90min，酶用量 4mg /g。在最佳提取条件下，提取率可
达 2.45%。同时得到各影响因素对冬枣叶中总黄酮
提取率的显著性影响顺序为:提取温度 ＞提取时间
＞酶用量 ＞料液比。
参考文献
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