全 文 ：78　 草　业　科　学 22卷 10期
10/2005 PRAT ACULT URA L SCIENCE Vol.22No.10
苜蓿根腐病病原菌的分离及鉴定
王多成1 ,孟有儒2 ,李文明1 ,李万苍1
(1.张掖市玉米原种场 ,甘肃张掖 734000;2.河西学院 ,甘肃 张掖 734000)
摘要:从甘肃张掖 、酒泉 2市采集苜蓿 Medicago sativa 根腐病样品 15 份 , 按照柯赫证病律对其进行病原物
分离 、鉴定。结果表明:发病部位分离到的菌株以镰孢霉 Fusarium spp.占优势 , 经致病性测定和接种试验
证明 , 腐皮镰孢霉 F.solani致病性最强 ,接种后病株率达 60%以上;其次是尖孢镰孢霉 F.oxy sporum 和串
珠镰孢霉F.monili f orme, 致病性弱 ,发病株率为 16.7%～ 23.3%;腐皮镰孢霉与尖孢镰孢霉或串珠镰霉混
合接种 ,发病率均高于单独接种的发病率 , 而病株上获得的其他分离物均无致病性。研究证明苜蓿根腐病
是以腐皮镰孢霉为主要病原 ,并与尖孢镰孢霉和串珠镰孢霉复合侵染导致的一种病害。
关键词:苜蓿;根腐病;复合侵染
中图分类号:S435.4　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2005)10-0078-04
　苜蓿Medicago sat iva 为豆科多年生植物 ,是
牛 、羊等牲畜的重要饲料 。因营养价值高 ,适口性
好 ,有“牧草之王”的美称。随着农业产业结构的
调整 ,以苜蓿为主的种草业悄然兴起 ,栽培形式以
过去的野生型 、粗放型向精细种植方式转变 ,根腐
病的发生也日趋加重。研究拟通过田间调查 、室
内分离和接种鉴定进一步确定苜蓿根腐病的主要
病原 ,为指导根腐病的田间防治提供依据。
1　材料与方法
1.1 供试材料　从张掖市沙井镇 、酒泉市果园
镇苜蓿地选取根腐病典型病株 15份做分离样本 ,
并采集种子做致病性测定 。
1.2 供试培养基　PDA 培养基[ 1] ;适于镰孢霉
Fusarium spp.的选择性培养基(简称 F 培养
基)[ 2] ;没食子酸琼脂培养基(简称 M 培养基)[ 1] ,
SNA 培养基[ 3] 。
1.3 试验方法
1.3.1苜蓿根腐病发病部位组织分离　取根腐病
样品根段 ,在病健组织处取样[ 1] ,样本表面用清水
冲洗干净后 ,用 5%次氯酸钠消毒 5 min ,再用无
菌水冲洗 3 次 , 每次 5 min , 然后切成 0.5 ～
1.0 cm小段 ,接种到事先制备好的 4 种平板培养
基上 ,置 28 ℃下培养 5 d后记录分离物的类别和
出现率。初步鉴定分离纯化后转管 ,保存于 4 ℃
冰箱中备用。
1.3.2分离物致病性测定
1.3.2.1 苜蓿育苗:将 10目河沙 、炉渣和草炭灭
菌后 ,按 1∶1∶1(W/W)混合均匀 ,装入预先消
毒的直径为20 cm的花盆中浇水备用。将精选的
苜蓿种子在清水中浸泡 10 ～ 12 h ,每盆 30粒 ,播
于花盆中 ,覆土 1.0 cm 左右 ,培育在 25 ～ 30 ℃的
温室中备用。
1.3.2.2 接种物准备:分离所得的真菌分离物(镰
孢霉 、链格孢菌 、青霉菌 、枝孢霉)在 PDA 培养基
上培养 7 ～ 10 d ,加入无菌水洗脱 ,用消毒沙布过
滤 ,分别制成 2.5×107 , 1.8×107 , 2.5×107 , 1.8
×107 个/mL 浓度的孢子悬浮液备用 。
1.3.2.3 接种试验:挖取盆栽苜蓿 30 d苗龄幼苗
洗净根部 ,采用浸根接种法接菌[ 1] ,即将其根系浸
入孢子悬浮液中 10 min , 以无菌水浸根部作对
照。接菌后的苜蓿幼苗移栽到装有灭菌的河沙 、
炉渣和草炭(1∶1∶1)的花盆内 ,置于 24 ～ 32 ℃
的温室内 ,并用遮阳网遮盖 2 d后取出 ,按常规管
理。定期观察记录发病情况。每处理接菌 10株 ,
重复 3次 。
收稿日期:2005-01-08
基金项目:国家林业局“ 948”项目《树苜蓿良种及其栽培
技术引进》[ 2001-50(Z)] 资助
作者简介:王多成(1964-), 男 ,甘肃高台人 , 农艺师 , 从
事玉米 、牧草种子生产及病虫害防治研究。
通讯作者:孟有儒　E m ail:m eny rg szy@163.com
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1.3.2.4 病原菌复合接种:将接种试验有致病性
的镰孢霉按不同组合进行复合接种 ,每处理 10
株 ,重复 3次 ,接种方法和培养条件同 1.3.2.3 。
1.3.2.5 病原菌鉴定:经致病性测定后得到的病
原物 ,分别接种于 PDA 培养基培养 15 d 后 ,观察
记载培养性状 ,并在显微镜下观测形态特征 。参
照魏景超《真菌鉴定手册》[ 4] 和 Boo th《镰刀菌属》
等参考资料[ 2 , 5] 进行种类鉴定。
2　结果与讨论
2.1 症状　发病初期根毛和胚根上出现黄褐色
小病点 ,病点逐渐扩大 ,呈黄褐色水渍状 、边缘不
明显的圆形 、长圆形病斑 ,并逐步向根尖和茎基部
扩展 。主根或侧根表皮呈黄褐色或褐色 ,病部表
皮腐烂 ,有的根毛脱落 ,有时病部生粉白色或粉红
色霉层。地上部叶片发黄 ,边缘出现不规则枯黄
褐色病斑 ,严重时个别枝条萎蔫 ,甚至全株枯死。
直接影响苜蓿植株的生长和产草量 ,造成很大的
经济损失 。
2.2 发病部位病原菌分离　采用 PDA 培养
基分离所得的真菌中 , F(镰孢霉)占 46.7%, Al
(链格孢菌 A lternaria spp.)占 6.7%, Pe(青霉菌
Penici l lium spp.)占 3.3%, Cl(枝孢菌 Clados-
porium spp.)占 3.3%;在 F 培养基上分离得到
的镰孢霉所占比例最高 , 占 67.0%,其中 F1 占
36.7%,F2占 17.0%,F3和 F4分别占 10.0%和
3.3%,其他分离物只占 20.0%;在 M 培养基上
分离出现的微生物 , 镰孢霉也占绝对优势 , 占
73.3%,其他分离物只占 6.6%;在 SNA 培养基
上 F1 , F3出现率只占 10%,而青霉菌和链格孢菌
出现率占 17.1%(表 1)。
表 1　苜蓿根腐病发病部位分离物出现率 %
F 培养基
分离物编号 出现率
PDA 培养基
分离物编号 出现率
M 培养基
分离物编号 出现率
SNA培养基
分离物编号 出现率
F1 36.7 F1 30.0 F1 40.0 F1 6.7
F2 17.0 F2 10.0 F2 13.3 F2 3.3
F3 10.0 F3 6.7 F3 20.0
F4 3.3
A l 10.0 A l 6.7 A l 3.3 A l 6.7
Pe 6.7 Pe 3.3 Pe 3.3 Pe 10.4
Cl 3.3 Cl 3.3
2.3 致病性测定
2.3.1单菌株接菌结果　分离物单菌株接菌致病
性测定结果表明:F1 , F2 , F3具有致病力 ,其中 F1
致病力最强 ,而且潜伏期最短 ,接菌后 24 d 开始
显症 ,50 d左右 3次重复平均发病率达60.0%。发
病株幼苗胚根和根毛出现黄褐色水渍状病斑 ,3 ～
5 d病斑扩大 ,环绕根毛 ,上部幼苗枯萎 ,表现症状
与田间发病基本一致 。F2和 F3亦有一定的致病
力 ,其中F2达23.3%,F3达 16.7%,F4只有 1株
发病 ,因此 ,F4 可能不是致病菌。F1 ,F2 ,F3接种
后潜伏期都在 40 d左右 ,其他分离物都未引起苜
蓿幼苗发病 。从接种发病株上重新分离到病原物
与接种菌形态完全一致 ,因此 F1是引发苜蓿发生
根腐病的主要病原菌。F2和 F3虽能引起苜蓿幼
苗发病 ,但发病率不高 ,是一类致病力低于腐皮镰
孢霉的次要病原菌。
2.3.2 病原物复合接种侵染结果　将具有一定致
病力的镰孢霉分离物单独接菌和复合接种苜蓿幼
苗后 ,除 F1+F4外 ,其他组合复合接种发病率都
超过 F1单独接菌 ,而且 F1+F2+F3 复合接菌发
病率和 F1+F2+F3+F4复合接菌发病率基本相
同 ,而略大于 F1+F2 的发病率 ,潜伏期也明显缩
短 ,18 d 即可显症 , 32 d达到发病高峰 ,说明 F2
与 F3在复合侵染中也起着重要的作用 ,而 F4在
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复合接菌中作用不大(见表 2)。
2.4 病原菌鉴定
2.4.1 F1:分生孢子梗常从基部做叉状分枝 ,下端
较宽 ,直 ,有隔膜 ,无色 ,大小(14.8 ～ 33.6)μm ×
(3.1 ～ 5.7)μm;大型分生孢子小 ,镰刀形 ,也有纺
锤形 ,一端稍钝 ,上端稍尖 ,具 1 ～ 5隔 , 3 隔者居
多。其中:3隔孢子占 54.8%,大小(18.2 ～ 32.5)
μm×(3.1 ～ 5.1)μm ,平均 27.8 μm ×4.4 μm;4
隔占 30.1%,大小(32.5 ～ 46.4)μm×(4.7 ～ 5.3)
μm ,平均 35.1 μm×5.1 μm ;5隔占 15%左右 ,大
小(34.2 ～ 46.6)μm ×(4.8 ～ 5.5)μm ,平均 38.9
μm×5.3 μm 。鉴定为腐皮镰孢霉 F.solani [ 5] 。
表 2　分离物单株接种与复合接种的致病性比较
接种体及处理 接种株数(株)
病株数
(株)
平均发病率
(%)
F1 30 18 60.0
F2 30 7 23.3
F3 30 5 16.7
F4 30 1 3.3
F1+F2+F3+F4 30 25 83.3
F1+F2+F3 30 26 86.7
F1+F2 30 20 66.7
F1+F4 30 17 56.7
CK 30 0 0
　注:每处理 10 株 , 3 次重复 ,共接种 30 株。
2.4.2 F2:PDA 培养基上产生大量小型分生孢
子 ,多串生或球状聚生 ,亦称假头状着生 ,小型分
生孢子椭圆形 、卵形 ,单胞 ,无色 ,少数具 1隔 ,大
小(3.5 ～ 6.3)μm ×(2.3 ～ 5.4)μm;大型分生孢
子产生少 ,多为新月型 , 有脚胞 ,有横隔膜 3 ～ 5
个 ,亦有 6 ～ 7 个 ,但少 ,无色 , (5.2 ～ 60.8)μm ×
(2.3 ～ 4.7)μm 。 鉴 定 为 串 珠 镰 孢 霉
F.monil i forme [ 2] 。
2.4.3 F3:菌落在 PDA 培养基上呈羊毛状 ,气生
菌丝茂盛 ,基物表面淡青莲色 ,菌落反面淡紫色;
小型分生孢子多 ,椭圆形至长圆形 ,无色 ,无隔 ,偶
有假头状着生 , (5.3 ～ 10.6)μm ×(2.3 ～ 3.5)
μm;大型分生孢子纺锤形至镰刀形 ,弯曲或端直 ,
多为 3隔 ,间有 5隔 ,大小 37.2 μm ×(2.9 ～ 4.5)
μm;厚垣孢子球形 。表面有纹饰 ,顶生 、间生或侧
生;产胞细胞单瓶状 ,短小。鉴定为尖孢镰孢霉
F.oxy sporum [ 6] 。
3　结果与讨论
3.1 目前为止 ,引起苜蓿根腐病的病原菌各说不
一 ,大致有以下几种:Phytophthoramegasperma[ 7] ,
Pythium spp., Rhizoctonia solani [ 8] , F.oxysporum ,
F.solani[ 9] ,也有报道尖孢镰孢霉引起苜蓿萎蔫
病[ 7] 。原因一是采样调查的地域不同 ,引起苜蓿
发生根腐病的病原菌可能存在差异;二是不同分
离物复合接菌的研究报道很少 ,从一个侧面说明多
病原复合侵染引起苜蓿发生根腐病的研究还欠深
入。据笔者研究 ,初步证明了发生在甘肃河西走廊
中 、西部的苜蓿根腐病 ,除腐皮镰孢霉是根腐病的
主要病原外 ,尖孢镰孢霉和串珠镰孢霉均能复合侵
染引起更严重的发病。而且很可能在复合侵染中
起着很重要的作用 ,不仅是发病率提高了 23.3%,
潜伏期缩短了 6 d ,发病高峰期也提前了 18 d。
3.2 腐皮镰孢霉分类目前仍较混乱 , Raillo 提出 3
个基本种[ 10] , Jof fe提出了 2种 2变种[ 11] ,Gerlach
和 Nirenberg 又提出了 6种及若干变种[ 12] ,叶琪
明对中国腐皮镰孢霉进行了广泛调查研究 ,鉴定
出 3种 2变种 ,其侵染豆科植物的主要是腐皮镰
孢霉原变种 F.solani var.solani[ 13] 。目前根据病
原菌致病性差异 ,先后报道侵染豆科植物的腐皮
镰孢霉还有蚕豆专化型 F.solani.f.sp.f aba只侵
染蚕豆[ 14 , 15] ,豌豆专化型 F.solani.f.sp.pisi只
侵染豌 豆[ 11 , 14 , 15] , 菜 豆专 化型 F.solani. f.
sp.phaseol i只侵染菜豆 、利马豆 、豇豆[ 16 , 17] ,大豆
专化 型 F.solani.f.sp.glycines 主要 侵 染大
豆[ 18] 。寄生苜蓿的根腐病菌专化型问题还需要
通过专化性寄主范围和致病性测定后才能确定 ,
有待今后进一步研究。
3.3 苜蓿根腐病防治难度较大 ,从田间调查发现
田块间 、品种间发病率有明显差异。今后要注意
抗病品种的选育和推广种植 ,并要研究农业栽培
措施在防治苜蓿根腐病中的作用 ,防止此病害进
一步扩大蔓延。
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Isolation and identification of the pathogens causing root rot disease of Medicago sativa
Wang Duo-cheng 1 ,MENG You-ru1 , Ll Wen-ming 2 , LI Wan-cang2
(1.Zhangye Primary Co rn Seeds Plant ,Zhangye734000 ,China;
2.Hexi Uvniversi ty ,Zhangye 734000 ,China)
Abstract:Fifteen samples o f roo t ro t disease of Medicago sat iva were collected f rom Zhangye and Ji-
uquang of Gansu , China.Pathogenicity o f fungal iso lates obtained from these sample s w as tested by
veri fial standard means of the Kochs Postulation.The resul ts show ed that the iso lates mainly belonged
to Fusarium spp.Infection analy sis indicated that F.solani had the st rongest virulence w ith a disease
seedling s rate o f more than 60%, whereas pathogenicity rate o f F.oxysporum , F. moni li f orme
ranged from 16.7% to 23.3%.When F.solani was co-inoculated w ith o ther iso lates , the disease in-
dices of mixed inoculat ions w ere all higher than tho se of thei r individual infection.The combined inoc-
ulations of F.solani with F.oxy sporum , o r F.moni li forme induced highe r rates of disease seedling s
than those o f F.solani with o ther fungi.Our results revealed that F.solani was the majo r pathogen
of roo t ro t disease of Medicago sat iva ,whereas Fusarini sajani and F.moni li forme , F.oxy sporum
and the other tw o Fusarium species only play ed an accessory role in Med icago sativa.
Key words:Medicago sat iva;ro ot ro t disease;complex infection